薩日娜　潘新波　顧志榮

摘要：目的 基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）代謝組學(xué)方法探討甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性成分與藥材生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系。方法 采用GC-MS技術(shù)測(cè)定31批甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材樣品中揮發(fā)性成分，并通過(guò)無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析（PCA）和有監(jiān)督模式的偏最小二乘分析（PLS）對(duì)甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材與其生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。結(jié)果 PCA結(jié)果表明，甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性成分與海拔、土壤類型具有相關(guān)性；PLS可將31批甘肅不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品依據(jù)海拔差異明顯分為3類，不同海拔的當(dāng)歸樣品中揮發(fā)性成分存在較為明顯的差異；分析對(duì)比分析PCA和PLS得到的線性載荷圖，可識(shí)別篩選出11個(gè)差異特征性成分，通過(guò)NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定出其中7個(gè)差異性化合物。結(jié)論 甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性成分與其生長(zhǎng)的海拔、土壤類型的交互影響具有明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸；甘肅；不同產(chǎn)地；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；主成分分析；偏最小二乘法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.020

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）06-0082-05

Relationship Between Volatile Components in Angelicae Sinensis Radix from Different Regions in Gansu Province and Its Growing Environment with GC-MS-based Metabolomics

SA Ri-na1，2， PAN Xin-bo3， GU Zhi-rong1，2， LIU Jie-li1， SUN Yu-jing1，4， WANG Ya-li1，4

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Gansu Provincial Hospital， Lanzhou 730000， China； 3. The Second Peoples Hospital of Lanzhou， Lanzhou 730000， China； 4. Key Laboratory of TCM Quality and Standard of Gansu Province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To explore the relationship between the volatile components in Angelicae Sinensis Radix from different regions of Gansu Province and its growing environment with metabolomics based on GC-MS. Methods The GC-MS method was used for detecting the volatile components in Angelicae Sinensis Radix from 31 different regions in Gansu province， and principal component analysis （PCA） and partial least squares （PLS） methods were used for analyzing and evaluating its relationship with the growing environment. Results The results of PCA showed that the volatile components in Angelicae Sinensis Radix from different regions in Gansu province were related to the altitude and the soil types. The PLS method could divide 31 samples of Angelicae Sinensis Radix from different regions in Gansu Province into three groups according to the difference of altitude. There were significant differences in the volatile components in the samples taken at different altitude regions. After analyzing linear loading plots from PCA and PLS， 11 charateristic components were screened out， including 7 compounds were identified by the retrieval of NIST11 database. Conclusion The volatile components in Angelicae Sinensis Radix from different regions in Gansu Province are closely related to the altitude and the soil type.

Keywords： Angelicae Sinensis Radix； Gansu Province； different regions； GC-MS； principal component analysis； partial least squares method

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30960037）

通訊作者：王亞麗，E-mail：cnwy11166@hotmail.com

隨著植物代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，因其具有的整體性、系統(tǒng)性和綜合性特點(diǎn)，逐漸在中醫(yī)藥研究、中藥質(zhì)量控制及中藥資源開(kāi)發(fā)等方面得到廣泛重視。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）作為代謝組學(xué)重要分析技術(shù)，對(duì)整體性控制中藥的質(zhì)量及揭示藥用植物中代謝物質(zhì)的變化具有重要意義。主成分分析（PCA）是一種常用的無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法，是將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，有效找出數(shù)據(jù)中最“主要”的信息[1]。偏最小二乘法（PLS）是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，在了解樣本分類信息前提下，尋找已知分類組別之間的變量差異，或?qū)ふ易兞亢妥兞恐g的相關(guān)系數(shù)[2]。有報(bào)道顯示，錳、鎂、鎳和鉀是當(dāng)歸藥材的特征性無(wú)機(jī)元素，當(dāng)歸中無(wú)機(jī)元素分布與其生長(zhǎng)的土壤類型密切相關(guān)[3]。本研究測(cè)定31批甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中揮發(fā)性成分，采用PCA和PLS分析對(duì)比其差異性代謝物，初步探究當(dāng)歸藥材中揮發(fā)性成分與其生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系，為當(dāng)歸道地性的成因提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

HP6890/5975N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Palo Alto，CA，USA），7683B自動(dòng)進(jìn)樣器（Palo Alto，CA，USA），BS124S型電子天平（德國(guó)Sartorius），HY-04型高速粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司），AS7240B型超聲器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

正己烷（色譜純），上海中秦化學(xué)試劑有限公司。31批當(dāng)歸藥材，于2012年10月采集于甘肅不同產(chǎn)地，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室晉玲教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的根，樣品用清水洗凈，自然陰干后密封，置于2 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩悠穪?lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 進(jìn)樣條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane毛細(xì)管柱（30 m×250 ?m×0.25 ?m）；升溫程序：初始溫度70 ℃，以4 ℃/min升至130 ℃，2 ℃/min升至170 ℃，8 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；He氣柱流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：脈沖不分流；進(jìn)樣量：0.2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

標(biāo)準(zhǔn)EI源（電子能量70 eV），離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描范圍（m/z）40～550 aum。

2.2 供試品溶液的制備

將樣品粉碎，過(guò)40目篩，分別精密稱定各樣品粉末約5.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加50 mL正己烷溶液，超聲提?。üβ?00 W，頻率50 kHz）30 min，過(guò)濾，合并提取液，用正己烷溶液定容于10 mL容量瓶中，即得。

2.3 數(shù)據(jù)處理

將采集的GC-MS原始數(shù)據(jù)保存為CSV格式。應(yīng)用MATLAB6.5軟件進(jìn)行譜峰平滑去噪、基線校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)化、峰識(shí)別及峰特征提取等預(yù)處理，并通過(guò)多元曲線分辨法分解重疊峰[4-5]。預(yù)處理后生成的三維矩陣導(dǎo)入SIMCA-P11.0軟件進(jìn)行PCA，以觀察樣品的聚集、離散及離群點(diǎn)。PLS用于識(shí)別造成這種聚集和離散的主要差異性成分。所篩選出的差異成分在NIST11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)中進(jìn)行檢索。

2.4 甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸指紋圖譜的建立

取樣品粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，所采集的GC/MS數(shù)據(jù)通過(guò)Matlab6.5軟件建立31批當(dāng)歸藥材樣品GC-MS指紋圖譜，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，各樣品的主要特征峰無(wú)明顯差異，指紋圖譜整體特征相似，甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材所含揮發(fā)性物質(zhì)的主要化學(xué)成分相近，僅從指紋圖譜相似性上無(wú)法反映出甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性成分的差異性。

2.5 主成分分析

采用PCA對(duì)31批甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣品的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到PCA得分圖（見(jiàn)圖2）和載荷圖（見(jiàn)圖3）。

從第一和第二主成分的PCA得分圖可以看出，31批當(dāng)歸樣品有較明顯的聚集和離散的分布，說(shuō)明不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材中的揮發(fā)性成分存在一定的差異性。其中，30號(hào)樣品為離群點(diǎn)，結(jié)合樣品來(lái)源信息，發(fā)現(xiàn)30號(hào)樣品海拔最低，這可能是造成該樣品與其他樣品差異性的主要原因。此外，12號(hào)和14號(hào)樣品點(diǎn)重疊，且距離其他樣品較遠(yuǎn)，結(jié)合樣品來(lái)源信息，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)樣品的海拔較高，土壤類型均為黑沙壤土，與其他樣品差異性較大。按PCA得分圖結(jié)果，將其第一主成分和第二主成分的空間投影結(jié)果劃分為A、B區(qū)域。A區(qū)域中包括1～7、15～20、25～28號(hào)樣品，結(jié)合樣品來(lái)源信息分析發(fā)現(xiàn)，在此區(qū)域中的大部分樣品的海拔區(qū)域?yàn)?300 m左右，且土壤類型相近，多為黑壚土，小部分為褐色土，其中26號(hào)樣品在區(qū)域A中相對(duì)離散，海拔高度為2750 m，明顯高于其他樣品，土壤類型為黑鈣土和砂壤土，區(qū)別于其他樣品。B區(qū)域中包括8～11、13、21～24、29、31號(hào)樣品，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，B區(qū)域中樣品的平均海拔低于A區(qū)域樣品的平均海拔。且在B區(qū)域中，8～11號(hào)及13號(hào)樣品相對(duì)聚集，海拔相近，土壤類型相似，均為黑壚土；21～24號(hào)樣品相對(duì)聚集，海拔相近，土壤類型相似，均為褐色土；29、31號(hào)樣品相對(duì)聚集，二者土壤類型相似，但海拔相差較大。通過(guò)以上分析可以初步得出，甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材樣品中的揮發(fā)性成分與海拔、土壤類型具有相關(guān)性。

從PCA線性載荷圖識(shí)別篩選出11個(gè)用于區(qū)別產(chǎn)地差異的特征性物質(zhì)。通過(guò)NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒別出其中的7個(gè)差異性化合物，按對(duì)應(yīng)峰的先后順序編號(hào)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 偏最小二乘分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證海拔對(duì)當(dāng)歸質(zhì)量的影響，首先排除土質(zhì)的影響，采用有監(jiān)督模式的PLS分析，對(duì)不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品按照海拔高低進(jìn)行分組，判別海拔對(duì)當(dāng)歸中揮發(fā)性成分的影響。將31批當(dāng)歸樣品分為3組：低海拔，產(chǎn)地海拔低于2300 m的樣品；中海拔，產(chǎn)地海拔為2300～2600 m的樣品；高海拔，產(chǎn)地海拔高于2600 m的樣品。

PLS得分圖見(jiàn)圖4?？梢钥闯?，不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品根據(jù)海拔差異能夠較為明顯分離，說(shuō)明不同海拔產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品存在較為明顯的差異。其中11號(hào)和13號(hào)樣品聚集在兩組分中間，分析原因，發(fā)現(xiàn)其海拔相近且介于2200～2300 m。

PLS線性載荷圖見(jiàn)圖5。篩選因產(chǎn)地海拔不同引起的當(dāng)歸揮發(fā)性成分差異性物質(zhì)，鑒定發(fā)現(xiàn)，與PCA載荷圖得出差異大的物質(zhì)一致，但是這些差異性物質(zhì)的峰的高低、正負(fù)值不同，說(shuō)明這些化合物對(duì)海拔差異的響應(yīng)不同。對(duì)比PCA和PLS線性載荷圖可以發(fā)現(xiàn)，1、2、11號(hào)峰代表的化合物受海拔的影響較小，主要受土壤類型的影響。3號(hào)峰和5號(hào)峰代表的化合物受海拔和土壤類型因素的影響，為各組間差異性最大的物質(zhì)。其余物質(zhì)主要受海拔的影響，其中6號(hào)峰代表的化合物受海拔的影響較大。

3 討論

在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學(xué)在藥物有效性和安全性、中藥資源及質(zhì)量控制研究等方面具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值[6]。許多植物代謝物是中藥的活性成分，其種類和含量隨品種、生長(zhǎng)環(huán)境、采集時(shí)間及產(chǎn)地加工等因素而變化。

模式識(shí)別（pattern recognition）在化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法中是解決復(fù)雜體系中歸類問(wèn)題和搜索標(biāo)記物的主要手段。它是將海量多維原始數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算機(jī)的壓縮、降維和歸類分析，然后將樣品集按照樣品的某種特性根據(jù)化學(xué)數(shù)據(jù)矩陣（通常為隱含的）進(jìn)行分類、特征選取并尋找其內(nèi)部規(guī)律的一種多元分析技術(shù)[7]，分為有無(wú)監(jiān)督模式和有監(jiān)督模式。其中，無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法是根據(jù)數(shù)據(jù)本身的屬性來(lái)判斷樣本的類別，如PCA和系統(tǒng)聚類分析（HCA）等。有監(jiān)督模式識(shí)別是將已知類別的樣本隨機(jī)分為兩部分（訓(xùn)練集和測(cè)試集），利用已知類別的訓(xùn)練集建模，通過(guò)測(cè)試集的正確率來(lái)表征建立模型的性能，常見(jiàn)的方法有PLS等[8]。PCA為無(wú)監(jiān)督模式中最常見(jiàn)方法，通過(guò)樣本矩陣提取樣本向量，然后提取其變量向量，主要用于觀測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械慕M間分離趨勢(shì)及是否有異常點(diǎn)的出現(xiàn)[9]；有監(jiān)督模式PLS在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中最為常用，此種方法可以最大程度地反映組別之間的差異[10]。

產(chǎn)地作為中藥道地性的重要影響因素之一[11]，光照、環(huán)境溫度、降水量、土壤條件等生態(tài)因子隨著地理區(qū)域的不同發(fā)生改變，進(jìn)而影響藥材質(zhì)量。本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)合PCA和PLS進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性物質(zhì)與其生長(zhǎng)的海拔、土壤類型具有相關(guān)性，其中海拔對(duì)甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸揮發(fā)性物質(zhì)的影響更為明顯，且通過(guò)分析篩選出的甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸揮發(fā)性差異性化合物與其生長(zhǎng)的海拔和土壤類型的交互影響有關(guān)，為進(jìn)一步闡明當(dāng)歸道地性的成因提供了一定依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-31）

（修回日期：2017-09-19；編輯：陳靜）