張 莘，常國斌，鄭圣晗，王統(tǒng)苗，陳博雯，張 揚，王志秀，陳國宏

(揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

雞主要組織相容性復(fù)合體(MHC，Major histocompatibility complex)與機體多種疾病抗性和免疫系統(tǒng)關(guān)系密切[1-2]。BLEC1基因(C-type lectin-like receptor 1)位于雞MHC核心區(qū)域，編碼C型凝集素區(qū)域[3]，與CD69家族的激活抗原相關(guān)，最接近于人LLT1基因和小鼠Clr基因家族[4]，BLEC1基因RNA有廣泛的組織分布，并且脾細胞激活后顯著上調(diào)[5]。C型凝集素是免疫應(yīng)答中具有多種功能的蛋白質(zhì)[6-7]，BLEC1氨基酸序列與C型凝集素第Ⅴ組的受體有很大的同源性，C型凝集素第Ⅴ組的受體包括C型凝集素類似NK受體，許多C型凝集素類似NK受體能結(jié)合MHC Ⅰ類分子[3，8]，所以，BLEC1基因?qū)τ谙忍煨悦庖吆涂共⌒杂兄匾饔?。有文獻報道，雞MHC具有1對凝集素樣受體基因，一個是NK受體，另一個是激活抗原，與人類和小鼠基因組的NK復(fù)合體(NKC)轉(zhuǎn)錄方向相反[5，9]。Bernot等[10]發(fā)現(xiàn)，類似MHC區(qū)域的Rfp-Y區(qū)域有許多凝集素類似物基因，且其中有幾個基因與BLEC1基因類似[11]，但是通過對雞的基因組序列分析，研究人員并沒有發(fā)現(xiàn)與BLEC1基因類似的基因[12]，BLEC1基因與雞抗病性的關(guān)系還不明晰。目前，國內(nèi)外針對BLEC1基因的研究相對較少，而BLEC1基因在雞上的研究對其抗病育種有重要意義，同時雞肉又是我國的重要肉源之一。

本研究通過目標(biāo)捕獲測序，篩選出BLEC1基因的Indels、SNPs位點以及對應(yīng)氨基酸的變化，為了探究該基因在不同雞品種中的遺傳多樣性，對該基因進行系統(tǒng)聚類比對分析，希望可以為家禽抗病育種和免疫遺傳學(xué)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的26個雞品種分別是：紅色原雞(RJ)亞種、如皋雞(RC)、茶花雞(CH)、安卡雞(AK)、藏雞(ZC)、AA雞(AA)、白耳雞(BE)、仙居雞(XJ)、羅斯雞(RS)、綠殼蛋雞(GC)、SPF-來航雞(LH)、太湖雞(TH)、斗雞(DJ)、蕭山雞(XC)、溧陽雞(LC)、北京油雞(BY)、鹿苑雞(LY)、固始雞(GS)、雪山草雞(XS)、黑狼山雞(HL)、泰和烏骨雞(WG)、大骨雞(BB)、青腳麻雞(QJ)、文昌雞(WC)、廣西黃雞(GH)、隱性白羽雞(RW)26個雞品種中紅色原雞(RJ)亞種來自云南省野生動物救護中心，仙居雞(XJ)、茶花雞(CH)、北京油雞(BY)、鹿苑雞(LY)、蕭山雞(XC)、白耳雞(BE)、泰和烏骨雞(WG)、藏雞(ZC)、黑狼山雞(HL)、固始雞(GS)、斗雞(DJ)、大骨雞(BB)12個地方雞品種來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院家禽科學(xué)研究所國家地方禽種資源基因庫，其余雞品種均來自揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實驗室禽種資源基因庫。

1.2 DNA提取

每個雞品種翅靜脈采血1 mL，置于2 mL離心管中，離心管中盛有0.1 mL的肝素鈉抗凝劑，共收集10個樣本，用苯酚和氯仿法提取DNA，選擇完整性好(無拖尾現(xiàn)象)，OD值介于1.8～2.0的DNA樣品稀釋至50 ng/μL，4 ℃冷藏保存。

1.3 BLEC1基因序列分析與進化樹構(gòu)建

將DNA樣品送深圳華大基因公司進行目標(biāo)序列捕獲測序，獲得序列以NCBI(National Center of Biotechnology Information)中紅色原雞(Gallusgallus)為標(biāo)準(zhǔn)基因庫，并用MEGA 6軟件對26個雞種BLEC1基因序列進行對比分析，篩選BLEC1基因的SNPs位點和Indels位點，最后運用鄰接法(Neighbour joining)系統(tǒng)聚類分析26個雞品種構(gòu)建進化樹(Phylogenetic tree)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BLEC1基因序列分析

為了探究我國地方雞種BLEC1基因中堿基序列，筆者查詢了NCBI中紅色原雞的堿基，并以此為參考序列，序列號為NC_006103.4。由圖1可知，紅色原雞的BLEC1基因位點118 439-122 492，共4 054 bp，外顯子5個，內(nèi)含子4個。通過對比可知(表1)，在26個雞品種中BLEC1基因內(nèi)含子上有59個Indels位點和45個SNPs位點，外顯子上有53個Indels位點和16個SNPs位點，由此可見BLEC1基因有較好的多態(tài)性。

2.2 不同雞品種中BLEC1基因SNPs位點統(tǒng)計分析

雞種測序所得的SNPs如表2所示，共發(fā)現(xiàn)14個SNPs，主要位于Exon1、Exon2、Exon5和內(nèi)含子上，其中有5個SNPs位于外顯子上，其余SNPs均位于內(nèi)含子中。且在外顯子中氨基酸有3個發(fā)生錯義突變，其余為同義突變。

圖1 NCBI中紅色原雞 BLEC1基因序列Fig.1 BLEC1 gene sequences in Gallus gallus

表1 BLEC1基因外顯子和內(nèi)含子上SNPs和Indels分布情況Tab.1 Nucleotide variations in exons and introns of BLEC1 gene

表2 BLEC 1基因SNPs、氨基酸信息Tab.2 SNPs and amino acid information of BLEC 1 gene

表3顯示了各雞種BLEC1基因SNPs的分布情況，對BLEC1外顯子SNPs進行分析發(fā)現(xiàn)，SNP5存在于泰和烏骨雞、SPF-來航雞、北京油雞、太湖雞、紅色原雞亞種、青腳麻雞和鹿苑雞中，SNP1和SNP2只在雪山草雞和鹿苑雞中檢測到，安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞的突變位點一致為SNP3，鹿苑雞和SPF-來航雞有3個SNPs位點，雪山草雞和泰和烏骨雞有2個SNPs位點，Exon2上的SNP4位點只在蕭山雞和SPF-來航雞中發(fā)現(xiàn)，國外雞品種中AA雞、羅斯雞和隱性白羽雞均沒有發(fā)現(xiàn)SNPs位點。隨后，筆者對該基因內(nèi)含子進行分析，SNP10在固始雞、如皋雞、藏雞等10個雞品種中檢測到，蕭山雞、綠殼蛋雞、太湖雞等17個雞品種含有SNP14，SPF-來航雞內(nèi)含子上有6個SNPs位點，在所有雞品種中最多，蕭山雞、安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞的突變位點大體一致。其他雞品種，包括國外雞品種如羅斯雞和AA雞均沒有檢測到SNPs位點。鹿苑雞、蕭山雞、SPF-來航雞等雞種在外顯子的SNPs位點較多，且導(dǎo)致了氨基酸變化，抗性較好的雞種SNPs普遍多于抗性差的雞種，表明BLEC1基因的SNPs位點與雞種的抗病力密切相關(guān)。

2.3 不同雞品種中BLEC1基因Indels位點統(tǒng)計分析

在不同雞品種BLEC1基因的Indels分布中，BLEC1基因的插入缺失發(fā)生在Exon1和內(nèi)含子中(表4)，12處插入缺失中有3處發(fā)生在外顯子上，且在雞種中廣泛存在(表5)，除黑狼山雞外，其余雞品種中均存在Indel1位點，同時Indel3存在于除雪山草雞和鹿苑雞外的所有雞種中，這些都導(dǎo)致BLEC1基因Exon1翻譯產(chǎn)物發(fā)生巨大的變化，而且在BLEC1內(nèi)含子上，除蕭山雞外，其余雞品種都篩選出Indels位點，這些都表示BLEC1基因具有極高的多態(tài)性。

表3 不同雞品種 BLEC 1基因的SNPs分布情況Tab.3 SNPs distribution of BLEC 1 gene in different breeds

注：“+”表示存在；空白表示不存在。表5同。
Note：“+”Indicates existence;Blank indicates no existence.The same as Tab.5.

表4 BLEC 1基因Indels信息Tab.4 Indels information of BLEC gene

注：D和I分別代表堿基缺失和插入；“/”后面表示缺失或插入的序列。
Note：D and I represent base deletions and insertions，respectively； “/” after that are the sequence of deletions and insertions.

表5 不同雞品種BLEC 1基因的Indels分布情況Tab.5 Indels distribution of BLEC 1 gene in different breeds

2.4 不同雞品種中BLEC1基因系統(tǒng)聚類分析

將不同雞品種的BLEC1基因用MEGA 6軟件運用鄰接法構(gòu)建NJ(Neighbour-joining)進化樹，如圖2所示，樹枝的長度代表了樹的距離，樹枝上顯示Bootstrap 1 000個循環(huán)設(shè)置的置信度。由圖2可知，26個雞品種大致分為3類，其中，安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞聚為一類；蕭山雞單獨為一類；其余雞種聚為一類。我國地方雞品種中，BLEC1基因具有豐富的遺傳多樣性，不同雞品種的抗病性和免疫能力可能存在差異。

圖2 不同雞種NJ系統(tǒng)進化樹(Bootstrap=1000)Fig.2 NJ phylogenetic tree of differentbreeds(Bootstrap = 1000)

3 討論

BLEC1基因是迄今為止描述的任何非哺乳動物C型凝集素與特定哺乳動物NKC編碼受體序列同一性最接近的基因，且BLEC1基因和BNK基因與特定的哺乳動物NKC編碼受體的相關(guān)性比其他雞C型凝集素更密切[5]，在迄今為止研究的任何哺乳動物的MHC中沒有鑒定到C型凝集素基因，表明BLEC1基因可能與雞的先天免疫性能有一定的關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明，在BLEC1基因的5個外顯子中，SNPs主要存在于Exon1、Exon2、Exon5，Exon3和Exon4沒有堿基突變，同時5個存在于外顯子的SNPs位點中有3個導(dǎo)致氨基酸發(fā)生錯義突變，可能導(dǎo)致單元型之間的功能能力差異以支持免疫影響疾病易感性的反應(yīng)，這與Shiina等[12]的研究結(jié)果一致。寧官保等[13]研究表明，BLEC1基因的表達與雞馬立克病(MD)耐受性有著密切的關(guān)系，又有研究表明，我國許多地方家禽品種擁有較強的抗病性狀和免疫能力，且對馬立克氏病的抗性較高[14]，本研究中，SNPs位點基本集中在鹿苑雞、雪山草雞、SPF-來航雞等抗病性強的雞種上，所以，這些SNPs位點可能與雞的抗病性有關(guān)。國外雞品種中AA雞和羅斯雞不存在任何突變位點，這可能與其為國外雞種起源不同且抗病性差有關(guān)。同時在Exon1上存在多個插入缺失位點，表明BLEC1基因多態(tài)性主要集中于Exon1，Indel1存在于除黑狼山雞以外的所有雞種中，所以，Indel1可以作為雞免疫特性的候選標(biāo)記?；蛑袃?nèi)含子并不參與蛋白質(zhì)的編碼，但是有研究表明，內(nèi)含子對蛋白質(zhì)的調(diào)控和編碼序列有重要作用[15-17]。26個雞品種中BLEC1基因的內(nèi)含子上有45個SNPs位點和59個Indels位點，可能與該基因的表達調(diào)控有關(guān)。以上這些都顯示出BLEC1基因具有較高的多態(tài)性，可能和雞的抗病性有關(guān)。

有研究報道，中國地方雞種的雜合度值明顯高于其他蛋雞、肉雞等商業(yè)品系及歐洲地區(qū)的部分地方雞種[18-20]。從NJ進化樹中可以看出，安卡雞、SPF-來航雞和泰和烏骨雞聚為一類，在這3個雞種都含有SNP3和SNP9，且這2個位點不存在于其他雞種中；蕭山雞自成一類可能是因為其在1999年被確認(rèn)滅絕[21]，且在本試驗中只有蕭山雞未篩選出Indels位點，所以BLEC1基因上的Indels位點影響了基因的表達調(diào)控；在剩余雞種中，鹿苑雞和青腳麻雞有極高的同源性，這2種雞都具有適應(yīng)性廣、抗病性強的特性，所以聚類在一起，在陳穎等[22]的研究結(jié)果中，茶花雞、藏雞、仙居雞、白耳雞聚在一類，這與本研究結(jié)果相同。我國地方雞品種BLEC1基因具有遺傳多樣性，且與雞種的抗病性有關(guān)，但是雞BLEC1基因與疾病間具體的關(guān)聯(lián)機制還需進一步研究探討。