閻文飛，程凡升，姜新強，劉翠霞，朱 丹

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院，山東 青島 266109)

土壤鹽堿化是影響農(nóng)耕的突出問題，我國鹽堿地面積大約為9 900萬hm2[1]，嚴(yán)重影響了我國糧食作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。鹽堿脅迫會嚴(yán)重抑制植物的生長發(fā)育，其中，Na+可引發(fā)離子毒害，同時堿脅迫中的HCO3-和CO32-的存在會導(dǎo)致pH值升高，引起混合毒害作用[2]。野大豆(Glycinesoja)是大豆(Glycinemax)的野生近緣種，在我國分布最廣，種類最多；自然條件下生長的野大豆在遺傳方面未受到人為選擇的影響，而且在長期的自然選擇中形成了豐富的變異類型，具有優(yōu)良的耐鹽堿、抗病蟲等性狀，保留了很多豐富的功能蛋白資源。前期研究從吉林省白城市重度鹽堿地采集野生大豆，經(jīng)過耐鹽堿分析挖掘到極耐鹽堿野大豆G07256[3]。本研究以野大豆G07256為材料，深入挖掘耐鹽堿蛋白，對于培育具有耐鹽堿特性的大豆新品種，具有重要的現(xiàn)實意義。

關(guān)于植物耐鹽堿分子機制的研究，近年來，越來越多的學(xué)者從生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等多個領(lǐng)域進(jìn)行了多方面研究。Ge等[4]通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)手段構(gòu)建了野大豆碳酸鹽脅迫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Ji和Lin等[5-6]提出了SOS3/SCaBP8-SOS2-SOS1和SCaBP1-PKS5/24-AHA2鹽堿脅迫信號傳導(dǎo)通路。Sunkar等[7]和Phillips等[8]從miRNA和降解組方面進(jìn)行了植物耐逆境的研究。關(guān)于野大豆的耐鹽堿機制，前期研究發(fā)現(xiàn)，TIFY家族基因在野大豆中有34個[9]，擬南芥中有18個[10]，水稻中有20個[11]。該家族蛋白調(diào)控了多種植物特有的生命過程，如生長發(fā)育、對茉莉酸信號途徑的應(yīng)答等。朱丹等[12]發(fā)現(xiàn)，GsTIFY11b受鹽和堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但超量表達(dá)沒能提高擬南芥對鹽堿脅迫的耐性；Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)GsTIFY10過度表達(dá)可以增強擬南芥對碳酸氫鹽的耐受能力，同時在種子萌發(fā)、幼苗和成苗期，一些與碳酸鹽脅迫相關(guān)Marker基因的表達(dá)量明顯高于野生型植株；Hakata等[14]發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)水稻的一個TIFY基因能通過積累糖含量從而增加谷粒的大小。植物在應(yīng)對不利環(huán)境時，形成了復(fù)雜的信號感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。JA和ABA能調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育和繁殖，并且還能在植物受到生物脅迫和非生物脅迫的條件下通過改變自身細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)來介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)[15]。最近大量研究表明，TIFY家族的亞家族JAZ類蛋白能夠負(fù)向調(diào)節(jié)茉莉酸信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2、MYC3、MYC4、MYB21和bHLH017等[16-17]。

本研究以野大豆G07256為研究材料，結(jié)合前期數(shù)據(jù)研究克隆得到GsTIFY6B基因；采用生物信息學(xué)的方法對該基因的進(jìn)化樹、保守結(jié)構(gòu)域、氨基酸序列和基本理化性質(zhì)進(jìn)行了分析；利用熒光定量檢測了GsTIFY6B在野大豆不同組織、鹽堿脅迫和MeJA、ABA處理下轉(zhuǎn)錄水平變化。從而為探討GsTIFY6B參與非生物脅迫功能和應(yīng)答機制，耐鹽堿功能蛋白的挖掘以及耐鹽堿大豆品種的分子育種和鹽堿地的改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料處理

將飽滿的、無病害的野大豆G07256種子浸沒于濃H2SO4中處理8～10 min以去除泥膜，倒凈濃H2SO4，用無菌水沖洗3～4遍后接種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上(pH值5.8)，25 ℃暗培養(yǎng)，萌動后置于光下。當(dāng)幼苗長至21 d時，分別取大豆幼苗的根、莖、葉、子葉各3份，液氮速凍，然后放-80 ℃冰箱保存。

待幼苗長至21 d時，分別在100 mmol/L NaCl溶液、50 mmol/L NaHCO3溶液(pH值8.5)、100 μmol/L ABA、50 μmol/L MeJA條件下處理0，1，3，6，12 h后，迅速剪取幼嫩的葉片和根，置于-80 ℃保存。

1.2 RNA提取和cDNA合成

以1.1中野大豆的根、莖、葉、子葉為植物材料，采用Eastep?Super總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)提取總RNA，檢測RNA濃度及質(zhì)量。cDNA反轉(zhuǎn)錄采用GoScriptTmReverse Transcription System試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GsTIFY6B基因克隆

以大豆基因組序列為參考設(shè)計目的基因全長序列擴增的特異引物，用PrimeSTARTMHS DNA Polymerase，以野大豆總cDNA為模板和基因特異引物進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)的體系為：10 μL 5×PrimeSTARTMHS PCR Buffer，4 μL dNTP mix(2.5 mmol/L each)，2 μL 5′ PCR Primer(10 μmol/L)，2 μL 3′ PCR Primer(10 μmol/L)，1 μL稀釋5倍的cDNA模板，0.5 μL PrimeSTARTMHS DNA Polymerase，PCR-Grade H2O補足體積(總體積50 μL)。PCR反應(yīng)的條件為：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)回收目的條帶，并與pMD19-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂在有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單菌落鑒定，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，將鑒定出的陽性克隆交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1. 4 GsTIFY6B生物信息學(xué)分析

利用DNAMANV6分析野大豆GsTIFY6B氨基酸序列；采用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)在線軟件預(yù)測野大豆GsTIFY6B的分子量、理論等電點、分子式、穩(wěn)定性和脂肪指數(shù)。利用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)在線軟件預(yù)測野大豆GsTIFY6B的親疏水性；利用TMHMM Server v. 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件分析野大豆GsTIFY6B的跨膜結(jié)構(gòu)；利用(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測野大豆GsTIFY6B的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)預(yù)測野大豆GsTIFY6B的三級結(jié)構(gòu)。利用NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)下載與野大豆GsTIFY6B的同源性較高的氨基酸序列，用MEGA 5軟件對野大豆GsTIFY6B氨基酸序列及其同源性較高的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸比對，采用NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建野大豆GsTIFY6B的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用MEME(http：//meme-suite.org/tools/meme-chip)分析GsTIFY6B的保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 GsTIFY6B基因表達(dá)特性

設(shè)計野大豆GsTIFY6B基因的定量引物RT-GsTIFY6B-F(5′-ATACCTGTTACCACGCCTCATT-3′)、RT-GsTIFY6B-R(5′-GCAGAAGGCGCAGATGGTC-3′)，內(nèi)參基因Q-Gsgapdh-F(5′-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3′)、Q-Gsgapdh-R(5′-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3′)。利用熒光定量PCR分析GsTIFY6B基因在野大豆根、莖、葉、子葉等不同組織中的表達(dá)特異性[18]；以及在100 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaHCO3、100 μmol/L ABA、50 μmol/L MeJA處理下在野大豆根和葉中的表達(dá)特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GsTIFY6B基因克隆

根據(jù)公布的大豆基因組序列，設(shè)計GsTIFY6B同源克隆引物，以野大豆根和葉的cDNA為模板，經(jīng)高保真PCR擴增后得到GsTIFY6B基因全長，經(jīng)連T-載體測序后，獲得野大豆GsTIFY6B的CDS全長序列1 047 bp，將其翻譯成氨基酸序列，共編碼348個氨基酸(圖1)。

圖1 GsTIFY6B 堿基序列和氨基酸序列Fig.1 The base sequence and aminoacid sequence of GsTIFY 6B

2.2 GsTIFY6B進(jìn)化樹分析與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

將野大豆GsTIFY6B的氨基酸序列放到NCBI中進(jìn)行比對，下載了12個與GsTIFY6B氨基酸序列同源性相對較高的蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，由圖2可以看出，GsTIFY6B與大豆GmTIFY6B(KHN16562.1)同源性最近，與綠豆VrTIFY6B(XP 014510328.1)、木豆CcTIFY6B(KYP61540.1)、蔓花生AdTIFY6A(XP 015957233.1)等豆科植物也有較高的同源性。通過在線軟件MEME分析了這些蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)所有這些與GsTIFY6B同源性較高的蛋白都有3個共同的保守結(jié)構(gòu)域：N端保守區(qū)、TIFY結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域(圖3)。

圖2 GsTIFY6B進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of GsTIFY6B

圖3 GsTIFY6B的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domains analysis of GsTIFY6B

2.3 GsTIFY6B蛋白理化性質(zhì)分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

用ProtParam在線軟件對GsTIFY6B氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GsTIFY6B蛋白分子量為36.8 ku，等電點為9.12，分子式為C1617H2597N447O504S14，不穩(wěn)定系數(shù)為41.89，是一個不穩(wěn)定蛋白，與之前下載的12個GsTIFY6B同源關(guān)系較近的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)是衡量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標(biāo)，GsTIFY6B脂肪指數(shù)為77.33，與同源關(guān)系較近蛋白相比最大，其穩(wěn)定性最高(表1)。對GsTIFY6B蛋白進(jìn)行親疏水性預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白親水性氨基酸均勻地分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸，因此，為親水性蛋白(圖4-A)。對GsTIFY6B蛋白有無跨膜性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有氨基酸均在膜外，且無跨膜結(jié)構(gòu)(圖4-B)。對GsTIFY6B蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)α-螺旋占23.56%，β-折疊占10.06%，延伸鏈占17.24%，無規(guī)卷曲占49.14%(圖4-C)。采用SWISS-MODEL構(gòu)建GsTIFY6B蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)比較簡單，主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致(圖4-D)。

2.4 GsTIFY6B基因在野大豆不同組織中的表達(dá)特性分析

熒光定量PCR結(jié)果顯示，GsTIFY6B基因在野大豆的根、莖、葉、子葉中均有表達(dá)，且在根中相對表達(dá)量最高，約為在子葉中的6倍(圖5)；在子葉、莖、葉中的相對表達(dá)量相差不大，說明GsTIFY6B在野大豆的不同組織中表現(xiàn)出表達(dá)特異性。張晉玉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，GmZHD1在大豆的種子、葉片和花中表達(dá)較高，但在花中表達(dá)最高。本研究發(fā)現(xiàn)，在野大豆根中表達(dá)量最高，說明GsTIFY6B主要參與野大豆根中的代謝活動，可能與其吸收營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。

表1 GsTIFY6B及相近氨基酸的基本理化性質(zhì)Tab.1 The basic physical and chemical properties of GsTIFY6B and near amino acids

A.親疏水性預(yù)測；B.跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；C.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；D.三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。A.Hydrophilicity and hydrophobicity prediction；B.Transmembrane structure prediction；C.Secondary structure prediction；D.Tertiary structure prediction.

圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖6-7同。Bars with different lowercase letters indicate significant differences by Turkey HSD test(P<0.05). The same as Fig.6-7.

2.5 野大豆GsTIFY6B基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)特性分析

為更深入地了解野大豆GsTIFY6B參與的生物學(xué)功能，采用熒光定量PCR分析其在100 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaHCO3脅迫處理下野大豆葉和根中的相對表達(dá)量。從圖6可以看出，在鹽堿脅迫處理下，GsTIFY6B的相對表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)。NaCl脅迫時，GsTIFY6B在野大豆根和葉中的誘導(dǎo)表達(dá)量分別在6，3 h達(dá)到峰值，分別為0 h表達(dá)量的13，12倍。在NaHCO3脅迫處理初期，GsTIFY6B的相對表達(dá)量在根和葉中都有略微的下調(diào)，而在6 h表現(xiàn)為上調(diào)，在12 h達(dá)到峰值，分別為0 h表達(dá)量的8，10倍。說明GsTIFY6B受鹽堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在鹽堿脅迫信號通路中發(fā)揮重要作用，且野大豆響應(yīng)NaCl脅迫的方式與NaHCO3截然不同。

圖6 鹽堿脅迫處理下 GsTIFY6 B 在野大豆根和葉中的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression of GsTIFY6 B in Glycine soja roots and leaves with the treatment of salt and alkaline

2.6 野大豆GsTIFY6B基因在ABA和MeJA處理下的表達(dá)特性分析

作為TIFY家族的蛋白，特別是JAZ亞族，在JA信號通路中發(fā)揮重要作用。有研究表明，JAZ蛋白通過TIFY結(jié)構(gòu)域和負(fù)調(diào)節(jié)子NINJA蛋白之間的相互作用，從而抑制JA信號通路[15]。采用熒光定量PCR分析了GsTIFY6B響應(yīng)ABA和MeJA脅迫時的調(diào)控機制。從圖7可以看出，在100 μmol/L ABA處理下，GsTIFY6B在野大豆根中相對表達(dá)量明顯下調(diào)，且在3 h表達(dá)量最低；而在葉中，前3 h相對表達(dá)量變化不明顯，在6 h之后表現(xiàn)為明顯上調(diào)表達(dá)，且在12 h達(dá)到峰值，說明GsTIFY6B在應(yīng)對ABA脅迫時，在根和葉中表現(xiàn)出截然不同的應(yīng)答模式；在MeJA處理時，GsTIFY6B在根中1，3 h下調(diào)表達(dá)，6，12 h上調(diào)表達(dá)，說明GsTIFY6B在中后期響應(yīng)MeJA信號，而在葉中GsTIFY6B的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，且在3 h達(dá)到峰值，上調(diào)了約9倍。說明GsTIFY6B主要在野大豆的葉中積極響應(yīng)植物激素ABA和MeJA。

圖7 植物激素ABA和MeJA處理下 GsTIFY6B在野大豆根和葉中的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of GsTIFY6B in Glycine soja roots and leaves with ABA and MeJA

3 討論與結(jié)論

關(guān)于植物耐鹽堿的分子機制，轉(zhuǎn)錄調(diào)控子在調(diào)控上游起著重要的作用，例如：WRKY轉(zhuǎn)錄因子有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，其轉(zhuǎn)錄激活與WRKY蛋白的磷酸化有關(guān)[20]，劉輝等[21]研究發(fā)現(xiàn)，巴西橡膠樹中HbWRKY41在高鹽脅迫下被強烈誘導(dǎo)；MYB轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，尤其是R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子在鹽堿脅迫中發(fā)揮重要作用[22]，王曉雪等[23]研究發(fā)現(xiàn)，OsMYB56轉(zhuǎn)錄因子能夠提高轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽能力。DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族，含有60～70個氨基酸的AP2保守區(qū)，通過與抗逆相關(guān)基因啟動子區(qū)域中的DRE/CRT順式作用元件結(jié)合從而調(diào)控下游基因表達(dá)[24]，張彬彬等[25]研究發(fā)現(xiàn)，TaDREB3轉(zhuǎn)錄因子可以提高大豆耐鹽堿能力。

TIFY家族蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，主要定位于細(xì)胞核，起著轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。包含28個氨基酸和一個TIF[F/Y]XG核心模體，其中疏水性氨基酸是可變的，而甘氨酸完全保守[26]。TIFY家族蛋白可以分為4個亞家族，分別是ZML、JAZ、PPD和TIFY亞家族[27]。本研究克隆獲得一個TIFY亞家族蛋白-GsTIFY6B，編碼348個氨基酸，通過進(jìn)化樹和結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)GsTIFY6B與大豆、綠豆、木豆和蔓花生的TIFY蛋白親緣關(guān)系最近，都具有N端保守結(jié)構(gòu)域，還有TIFY和Jas結(jié)構(gòu)域。通過與其相似性較高的氨基酸進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)均為不穩(wěn)定蛋白，它們的等電點在8.82～9.48，均為不穩(wěn)定蛋白。通過預(yù)測GsTIFY6B的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其主要有α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，而三級結(jié)構(gòu)比較簡單。

植物對非生物脅迫的應(yīng)答是一個極為復(fù)雜的過程，有研究表明，非生物脅迫所引起植物生理生化指標(biāo)改變是由植物體內(nèi)的保護(hù)系統(tǒng)和相關(guān)基因表達(dá)共同調(diào)控的，且基因的表達(dá)具有組織特異性[28]。植物在相應(yīng)鹽堿脅迫時，最先感知的器官為根。趙春梅等[29]研究發(fā)現(xiàn)，GmCHI1p具有明顯的根組織特異性，且在傷害誘導(dǎo)時強烈表達(dá)。本研究通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)GsTIFY6B在野大豆中的不同組織中均有表達(dá)，且在根中相對表達(dá)量最高。在NaCl脅迫處理下，GsTIFY6B相對表達(dá)量在根和葉中均出現(xiàn)上升趨勢，且上升趨勢相似，可以推測出GsTIFY6B在野大豆的根和葉中均能正向調(diào)控NaCl脅迫對野大豆的傷害，從而提高大豆耐鹽能力。在NaHCO3脅迫處理前期，GsTIFY6B在根和葉中的相對表達(dá)量受到抑制，而后出現(xiàn)明顯上升，可能是因為GsTIFY6B基因在NaHCO3處理下需要經(jīng)歷一個過渡期或啟動期才能被誘導(dǎo)表達(dá)。

另外，植物激素ABA、MeJA等在植物逆境脅迫應(yīng)答過程中通過相互協(xié)同或相互拮抗作用對植物生長和發(fā)育起重要的調(diào)控作用[30]。郭貴華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，ABA具有緩解孕穗期干旱脅迫對水稻生理代謝功能的損傷，促進(jìn)復(fù)水后的功能修復(fù)，從而減輕干旱對產(chǎn)量的影響。楊藝等[32]研究發(fā)現(xiàn)MeJA能夠緩解鹽脅迫對棉花種子傷害，從而促進(jìn)棉花種子的萌發(fā)和幼苗生長。本研究發(fā)現(xiàn)，在ABA脅迫處理下，GsTIFY6B在根中的相對表達(dá)量明顯被抑制，表現(xiàn)出下調(diào)，而在野大豆葉中GsTIFY6B的表達(dá)量在前期受到抑制，而6 h之后表達(dá)量增加；在MeJA脅迫處理時，GsTIFY6B在根中的相對表達(dá)量變化不明顯，而在葉中GsTIFY6B的相對表達(dá)量呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，且在3 h達(dá)到峰值。說明GsTIFY6B響應(yīng)ABA和MeJA參與野大豆耐鹽堿的機制不一樣。可能是由于植物激素作用的專一性不明顯，通常同一種激素具有多種不同的生理效應(yīng)，而不同的激素又往往可以引起同一種生理效應(yīng)[30]。

本研究克隆得到了野大豆GsTIFY6B基因全長CDS 1 047 bp，編碼348個氨基酸，其理化性質(zhì)與同源性相近蛋白相似，含有保守結(jié)構(gòu)域TIFY和Jas，在野大豆根中表達(dá)量最高。能夠積極響應(yīng)鹽堿脅迫、植物激素ABA和MeJA。GsTIFY6B可能通過參與ABA和MeJA信號通路來調(diào)控對鹽堿脅迫的響應(yīng)。本研究可為后期植物耐鹽堿功能基因的挖掘，培養(yǎng)具有較強耐鹽堿能力的大豆，為改良鹽堿地和提高我國鹽堿地的利用率提供理論研究基礎(chǔ)。