陳 倩，卓 維，羅 靜，楊尚諭，魯黎明，李立芹

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.作物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

乙烯響應(yīng)因子(ERF，ethylene response factor)基因是廣泛存在于植物中的一類 AP2/ERF超家族基因。AP2/ERF基因編碼在植物生長和發(fā)育中具有多種功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并且響應(yīng)生物和非生物脅迫。該類轉(zhuǎn)錄因子在激活或抑制防御反應(yīng)基因的過程中也起著關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，例如當(dāng)植物面臨干旱或高鹽脅迫時[1]。在植物中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族含有轉(zhuǎn)錄因子的種類最多，但它們?nèi)堪辽僖粋€由60～70個保守氨基酸殘基構(gòu)成的APETALA2(AP2)結(jié)構(gòu)域。每個結(jié)構(gòu)域均主要由YRG和RADY元件構(gòu)成，其中YRG元件通常由19～22個保守的氨基酸組成，RADY元件則通常包含33～43個氨基酸[2]。

AP2/ERF超家族根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量分為4個亞家族，具體包括AP2(APETALA 2)、ERF(Ethylene-responsive element binding factors)、DREB(de-hydration-responsive element binding protein)和RAV(related to ABI3/VP1)[3]。其中，AP2家族包含2個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面有著重要作用[4]；ERF和DREB家族只含有一個典型的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域，主要功能是調(diào)節(jié)植物對激素(乙烯和ABA等)、病原和脅迫(低溫、干旱及高鹽)等的應(yīng)答反應(yīng)；而RAV家族除了包含一個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，還含有一個B3結(jié)構(gòu)域，主要功能為調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，并對環(huán)境脅迫做出響應(yīng)[5-6]。

近年來，ERF轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)乙烯信號通路的關(guān)鍵蛋白得到了廣泛的關(guān)注[7]。ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子可以特異性地識別并結(jié)合下游基因啟動子區(qū)域的GCC-box，以調(diào)控下游功能基因的表達(dá)，具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制，從而提高植物抗逆性[8]。ERF轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合不同的順式作用元件，來參與不同類型的非生物脅迫應(yīng)答，如干旱脅迫、NaCl脅迫以及低溫脅迫等逆境應(yīng)答反應(yīng)，并在植物的生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到了重要作用[9]。已有報道表明，在水稻中過表達(dá)番茄ERF基因TSRF1，能提高ABA生物合成相關(guān)基因SDR的表達(dá)，從而增加轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)的ABA含量，同時提高了轉(zhuǎn)基因水稻的干旱脅迫耐受性[10]。在擬南芥中過表達(dá)AtERF1 能夠提高轉(zhuǎn)基因植株對干旱、鹽和高溫脅迫的耐受性[11]。并另有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥ERF基因能通過參與ROS信號通路，維持H2O2的平衡及響應(yīng)非生物脅迫[12]。

在擬南芥中，總共65個ERF基因已被成功鑒定[13]。在楊樹中，共鑒定了ERF亞家族中的91個成員[14]。隨著更廣泛的基因組序列研究， ERF家族已經(jīng)在各種植物如葡萄[15]、黃瓜[16]、番茄[17]、高粱[18]、白菜[19]中被分離和鑒定。然而，目前關(guān)于煙草ERF基因的鑒定和研究較少。

本研究根據(jù)同源克隆的方法，從普通煙草K326中克隆到1個ERF基因NtRAP2-7，并運用生物信息學(xué)方法，對該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測，同時，運用qRT-PCR技術(shù)，分析其在煙草各組織中的表達(dá)水平以及在低鉀、高鹽、干旱、ABA、H2O2和低溫脅迫下基因的表達(dá)模式，旨在為研究NtRAP2-7基因在煙草抗性機制中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

供試煙草品種為普通煙草品種 K326。采用漂浮育苗的方法進行育種，生長60 d后，分別對煙株的根、莖、葉進行取樣。待其生長至盛花期，再對花進行取樣。所有采集的樣品均需在液氮中速凍1 min后，放置-80 ℃冰箱中以供后續(xù)使用。

將煙草品種K326種子進行表面消毒，均勻地播種到MS培養(yǎng)基上，15 d后進行脅迫處理。低鉀、高鹽、干旱、ABA、H2O2處理是挑選生長狀況一致的幼苗，分別移到相應(yīng)培養(yǎng)基上。低鉀培養(yǎng)基是用NH4H2PO4和NH4NO3來替代MS培養(yǎng)基中原有的KH2PO4以及KNO3，其余成分相同，此時培養(yǎng)基中的K+濃度約為10 μmol/L。高鹽、干旱、ABA處理培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入相應(yīng)成分，使培養(yǎng)基分別含有NaCl(200 mmol/L)、PEG6000(5%)、ABA(1 μmol/L)、H2O2(10 mmol/L)。低溫處理是將15 d齡的幼苗置于 4 ℃光照培養(yǎng)箱中。上述處理，均在處理時間為0，3，6，12，24 h對煙草幼苗進行整株取樣。

TRIzol試劑、高保真酶、限制性內(nèi)切酶、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Green Master mix等試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，cDNA合成試劑盒購于賽默飛世爾科技公司，通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，DH5α大腸桿菌菌株購于南京諾唯贊生物科技有限公司，由上海生工生物工程有限公司完成引物合成與測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草NtRAP2-7基因的克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 參考GenBank收錄的林煙草ERF序列(XP_009772737.1)，根據(jù)同源物種的保守區(qū)域，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物NtRAP2-7-F：5′-TCTAGAATGTTGGATCTGAATGTATC-3′(劃線部分為XbaⅠ酶切位點)和NtRAP2-7-R：5′-CCCGGGTTAACTAATGTTAAGGGTGA-3′(劃線部分為SmaⅠ酶切位點)。具體方法按文獻[20]進行，對目的基因進行克隆。

PCR擴增目的片段經(jīng)純化后與過表達(dá)載體pBI121用XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切，在16 ℃下連接過夜，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，隨后在含有卡那霉素的LB平板上進行抗性篩選，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，并將酶切產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.2 煙草NtRAP2-7基因生物信息學(xué)分析 利用網(wǎng)站上ExPASy ProtParam在線工具，分析NtRAP2-7基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；運用DNAMAN軟件進行蛋白同源性比對以及疏水性分析；應(yīng)用IBCP的在線工具SOPMA，對NtRAP2-7的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；SWISS-MODEL在線預(yù)測NtRAP2-7的三級結(jié)構(gòu)特性，預(yù)測結(jié)果在Ras Top軟件中查看；利用Prot Fun 2.2 Server軟件對蛋白功能進行預(yù)測；利用NLS Mapper軟件在線預(yù)測該基因的核定位信號；應(yīng)用在線程序PSORT預(yù)測NtRAP2-7的亞細(xì)胞定位；運用MEGA 5軟件，采用鄰近法模式構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，具體參數(shù)設(shè)置見參考文獻[21]。

1.2.3 煙草NtRAP2-7基因的表達(dá)分析 根據(jù)NtRAP2-7基因序列，設(shè)計qRT-PCR引物NtRAP2-7-qF：5′-TCTTGAGCCAAAGCATCTA-3′和NtRAP2-7-qR：5′-GTCGTGGAAACACTTGAACC-3′，采用煙草組成型表達(dá)基因18SrRNA作為內(nèi)參，以煙草不同組織和不同處理下的幼苗cDNA為模板，進行基因表達(dá)模式分析，引物序列參照文獻[22]。PCR擴增程序：50 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s，65 ℃延伸45 s，共39次循環(huán)。所有的樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)水平，運用Excel 2013進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtRAP2-7基因的克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建

以煙草總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 500 bp左右的位置上有清晰明亮的條帶(圖1-A)，經(jīng)測序結(jié)果顯示，該目的片段長度為1 398 bp，與預(yù)期的目的片段大小相符。

將PCR擴增產(chǎn)物純化后和pBI121載體分別進行雙酶切，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取陽性克隆，對連接產(chǎn)物進行酶切驗證，結(jié)果顯示，在1 500 bp左右的位置上有清晰的條帶(圖1-B)。將酶切成功的單菌落質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果顯示，目的片段大小為1 398 bp，表明pBI121-NtRAP2-7過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.NtRAP2-7基因PCR產(chǎn)物電泳圖；B.NtRAP2-7基因酶切電泳圖；1.NtRAP2-7基因；M.Marker。A.NtRAP2-7 PCR product electrophoresis；B.NtRAP2-7 gene digested electrophoresis；1.NtRAP2-7 gene；M.Marker.

2.2 目的基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1NtRAP2-7編碼蛋白的理化性質(zhì)及疏水性預(yù)測分析 運用ExPASy ProtParamtool軟件，對目的蛋白的理化性質(zhì)進行在線分析。結(jié)果顯示，NtRAP2-7蛋白由20種氨基酸組成，共包含465個氨基酸殘基，其中，Ser數(shù)量最多，為10.8%，而Cys數(shù)量最少，為1.1%；該蛋白的分子式為C2229H3479N651O707S14，預(yù)測分子量為51.16 ku；等電點PI為8.16，屬堿性蛋白。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)為50個，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為52個，NtRAP2-7的脂肪系數(shù)為63.78，總的疏水性平均系數(shù)為-0.628。運用DNAMAN軟件對NtRAP2-7蛋白進行疏水性/親水性預(yù)測分析，結(jié)果如圖2所示，與之前疏水系數(shù)預(yù)測結(jié)果相一致，平均疏水系數(shù)小于0，可以預(yù)測該蛋白是親水性蛋白。

圖2 NtRAP2-7蛋白疏水性預(yù)測Fig.2 The hydrophobicity and transmembraneprediction of NtRAP2-7

2.2.2 NtRAP2-7蛋白的亞細(xì)胞定位、核定位信號及磷酸化位點分析 通過在線PSORT工具，對NtRAP2-7蛋白的亞細(xì)胞定位進行預(yù)測。結(jié)果顯示，定位在細(xì)胞核中的概率為65.2%，在細(xì)胞質(zhì)中的概率為21.7%，分別有4.3%的概率定位于細(xì)胞骨架、線粒體及過氧化物酶體。表明NtRAP2-7定位于細(xì)胞核的可能性最大。所以，利用NLS Mapper軟件在線預(yù)測該基因的核定位信號，在第60～71個氨基酸有單分型的NLS序列VHHGSKRAHHS，初步說明該蛋白是核蛋白。利用NetPhos 3.1 Server在線工具對NtRAP2-7蛋白中存在的Ser、Thr和Tyr殘基的磷酸化位點進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示(圖3)，NtRAP2-7中包含58個磷酸化位點(37個Ser磷酸化位點、18個Thr磷酸化位點和3個Tyr磷酸化位點)。表明蛋白激酶可能使該蛋白的這些氨基酸位點磷酸化，從而參與一系列生理生化過程的調(diào)控。

圖3 NtRAP2-7中的磷酸化位點分析Fig.3 Predicted phosphorylation site in NtRAP2-7

2.2.3 NtRAP2-7蛋白結(jié)構(gòu)及生物功能預(yù)測分析 運用IBCP的在線工具SOPMA，對NtRAP2-7蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明(圖4-A)：該蛋白分別含有無規(guī)則卷曲51.61%，延伸鏈23.23%，α-螺旋17.85%，β-折疊所占比例最低，為7.31%。由此推測，無規(guī)則卷曲、延伸鏈以及α-螺旋是構(gòu)成NtRAP2-7蛋白的主要結(jié)構(gòu)，β-折疊含量較少。

利用SWISS-MODEL和RasTop在線軟件對NtRAP2-7的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示(圖4-B)，NtRAP2-7蛋白包含1個α-螺旋及3個β-折疊的保守結(jié)構(gòu)。利用ProtFun 2.2 Server軟件對ERF蛋白的功能進行預(yù)測，結(jié)果表明(表1)，NtRAP2-7蛋白具有生物合成的輔因子功能的可能性為2.917、轉(zhuǎn)運結(jié)合的可能性為1.885、行使翻譯功能的可能性為1.614。其中，在生物合成中行使輔因子功能的可能性最大。

A.NtRAP2-7蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.NtRAP2-7蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。A.NtRAP2-7 protein secondary structure prediction；B.NtRAP2-7 protein three-dimensional structure prediction.

2.2.4 NtRAP2-7同源性分析及保守結(jié)構(gòu)域分析 將NtRAP2-7氨基酸序列與其他植物中RAP2-7蛋白序列進行同源性進化分析，結(jié)果表明(圖5-A)，NtRAP2-7與林煙草RAP2-7、野生煙草RAP2-7、絨毛狀煙草RAP2-7等氨基酸序列同源性較高，分別為98%，96%，94%，與葡萄RAP2-7的同源性最低，為54%。由圖5可知，煙草與馬鈴薯、番茄等聚成一類，而葡萄等單獨一組，NtRAP2-7與茄科植物的親緣關(guān)系較近且進化同步，表明該基因在物種進化中可能較為保守。通過多重序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示(圖5-B)，NtRAP2-7蛋白序列中包含一段典型的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，并含有保守的YRG元件和RAYD元件。

2.3 NtRAP2-7的組織表達(dá)分析

通過qRT-PCR技術(shù)，研究該基因在煙草K326品種不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖6)，NtRAP2-7的表達(dá)量大小依次為根>莖>葉>花，在根中的表達(dá)量為花中表達(dá)量的23.85倍，為葉中表達(dá)量的6.36倍，為莖中表達(dá)量的2.02倍。結(jié)果表明，NtRAP2-7基因在葉和花中的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，但在煙草其他組織中的表達(dá)具有顯著差異(P<0.05)，推測該基因主要在根中起調(diào)控作用。

表1 NtRAP2-7蛋白功能預(yù)測Tab.1 The function prediction of NtRAP2-7

2.4 逆境脅迫下NtRAP2-7的表達(dá)分析

采用qRT-PCR對NtRAP2-7在低鉀(10 μmol/LK+)、5%PEG、ABA(1 μmol/L)、NaCl(200 mmol/L)、H2O2(10 mmol/L)及低溫(4 ℃)處理下的表達(dá)動態(tài)進行實時檢測。該基因在高鹽、5%PEG及低鉀處理下，6 h表達(dá)量上升至最大，分別為對照(0 h)的1.23倍(圖7-A)、8.36倍(圖7-B)和7.37倍(圖7-C)。在ABA和H2O2處理下，都是24 h時表達(dá)量達(dá)到最大，分別為對照(0 h)的1.49倍(圖7-D)和11.42倍(圖7-E)。NtRAP2-7在低溫處理下表達(dá)受到抑制，在處理24 h時表達(dá)量降至最低(圖7-F)。結(jié)果表明，該基因的表達(dá)水平在低鉀、PEG、ABA、NaCl、H2O2處理下受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，在低溫處理下受到顯著抑制(P<0.05)。

圖7 非生物逆境脅迫下NtRAP2-7的表達(dá)分析Fig.7 Expression of NtRAP 2-7 under abiotic stress

3 討論與結(jié)論

植物的非生物脅迫應(yīng)答是一個復(fù)雜的過程，往往需要多個功能基因共同參與。而功能基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，一個轉(zhuǎn)錄因子可以同時調(diào)節(jié)幾個功能基因，在抗逆反應(yīng)過程中具有重要作用。國內(nèi)外學(xué)者對ERF轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定及功能方面開展了較多的研究，發(fā)現(xiàn)其主要參與植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫等過程[23]，但在煙草中該基因的研究較少?；诙壗Y(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，NtRAP2-7蛋白包含1個α-螺旋及3個β-折疊結(jié)構(gòu)。這在大豆ERF蛋白的研究中也有相同發(fā)現(xiàn)[24]，這對于DNA序列識別和結(jié)合是非常重要的[25]。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，NtRAP2-7轉(zhuǎn)錄因子主要定位于細(xì)胞核，這在馬鈴薯和擬南芥中也有相同發(fā)現(xiàn)[26-27]?；谶M化樹分析結(jié)果表明，NtRAP2-7與煙草RAP2-7成員關(guān)系較近，與7個茄科RAP2-7轉(zhuǎn)錄因子聚為一類，這說明RAP2-7轉(zhuǎn)錄因子在茄科植物的進化中比較保守。

組織表達(dá)分析結(jié)果表明，NtRAP2-7基因在選取的各個組織中均有表達(dá)，但各組織間的表達(dá)水平不同，在根中表達(dá)量最高，莖和葉次之，在花中的表達(dá)量最低。茄子中有7個ERF基因的組織表達(dá)情況與之相似[28]。推測在煙草生長過程中，根和葉是最重要的用于營養(yǎng)吸收和光合作用的器官，NtRAP2-7基因的高表達(dá)可能有助于植物快速的營養(yǎng)生長以及響應(yīng)環(huán)境脅迫。

qRT-PCR分析結(jié)果表明，在各種非生物逆境脅迫下，NtRAP2-7基因相對表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著變化，表明該基因的表達(dá)受各種非生物脅迫因子的影響，推測NtRAP2-7基因可能參與植物各種非生物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。在200 mmol/LNaCl和5% PEG處理6 h，該基因的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，這與大豆ERF基因在高鹽和PEG脅迫處理后，表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)的情況相似[29]。也有研究表明，華北駝絨藜ERF基因在鹽和干旱脅迫條件下發(fā)揮正調(diào)控的作用[30]。在1 μmol/L ABA處理下，該基因的表達(dá)在24 h時顯著升高，這與麻風(fēng)樹和擬南芥ERF基因在ABA處理后的表達(dá)模式相同[31-32]。在4 ℃處理的24 h內(nèi)的各時間點，NtRAP2-7基因的表達(dá)受到抑制，這在大豆ERF基因的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[33]，由此推測，NtRAP2-7基因?qū)δ承┑蜏孛{迫基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。這與在擬南芥中的研究不同，在低溫脅迫后1 h，4個擬南芥ERF基因的表達(dá)水平均受到顯著誘導(dǎo)，隨后降低，24 h降至初始水平以下[34]。這可能是由于取材時間點不同所造成的。以上研究為進一步探索NtRAP2-7轉(zhuǎn)錄因子基因的功能及機制提供了重要的依據(jù)。

根據(jù)同源物種基因的保守性，參考林煙草RAP2-7序列設(shè)計引物，從普通煙草K326中克隆到1個ERF蛋白基因NtRAP2-7，序列長度為1 398 bp。生物信息學(xué)研究表明，NtRAP2-7為堿性親水性蛋白，主要定位于細(xì)胞核。含有一個典型的AP2/ERF蛋白結(jié)構(gòu)域，且具有多個Ser、Thr和Tyr磷酸化位點。qPT-PCR分析結(jié)果表明，NtRAP2-7基因在煙草根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但在根中表達(dá)量最高。NtRAP2-7基因在不同時間點的表達(dá)，分別受到低鉀、PEG、ABA、NaCl、H2O2及低溫脅迫的顯著誘導(dǎo)或抑制，表明NtRAP2-7基因可能在植物多種非生物脅迫應(yīng)答中行使功能。