李 琦，成莉鳳，段盛文，馮湘沅，鄭 科，楊 琦，劉志遠(yuǎn)，彭源德

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長沙 410205；2.湖南利爾康生物股份有限公司，湖南 岳陽 414100；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

木聚糖是一種帶有多種取代基的復(fù)雜多糖，其主要成分是D-木糖。根據(jù)糖苷鍵的類型不同，木聚糖可分為β-1，4-木聚糖和β-1，3-木聚糖[1]。自然界中的木聚糖多為在主鏈和側(cè)鏈上含有不同大小的取代基團(tuán)的異質(zhì)多糖，主鏈上最常見的取代基團(tuán)是O-乙酰基、L-阿拉伯糖基和O-甲基-葡萄糖醛酸基等[2]。由于木聚糖化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，決定了其徹底降解需要內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶、木糖苷酶等一系列的酶協(xié)同作用[3]。

木聚糖酶也叫內(nèi)切木聚糖酶或β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶 (endo-1，4-β-xylanase，EC 3.2.1.8)，以內(nèi)切方式作用于木聚糖分子中β-1，4-木糖苷鍵，生成木二糖及木二糖以上的寡聚木糖，還有少量木糖和阿拉伯糖[4]。目前，其已被廣泛應(yīng)用于造紙、飼料、紡織、能源等行業(yè)[5-6]。尤其在植物韌皮脫膠中，木聚糖酶作為去除附著在纖維表面或鑲嵌在纖維內(nèi)部的半纖維素木聚糖的關(guān)鍵因子，是脫膠酶制劑中不可或缺的成分[7]。

國內(nèi)外有關(guān)產(chǎn)木聚糖酶的微生物報(bào)道很多，比如：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GN156、鏈霉菌(Streptomycesturgidiscabies)C56、類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)JDR-2等[8-10]。近年來，隨著基因工程和蛋白質(zhì)技術(shù)的發(fā)展，利用基因重組技術(shù)克隆和表達(dá)了一系列來自細(xì)菌或真菌的木聚糖酶基因[11]。最為常見的表達(dá)方式是原核表達(dá)，其操作簡單、代時(shí)短，易于高密度培養(yǎng)，但大多數(shù)E.coli基因工程菌的木聚糖酶表達(dá)量往往比在親本中產(chǎn)酶量低，且表達(dá)產(chǎn)物易存在于細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)腔內(nèi)形成包涵體，需進(jìn)行破壁才能提取，限制了酶在工業(yè)中的應(yīng)用。近年來采用了酵母、霉菌等真核生物使木聚糖酶基因高效分泌表達(dá)[12]。目前，極端嗜熱菌產(chǎn)木聚糖酶是研究熱點(diǎn)，其產(chǎn)量高，耐熱性好，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景[13]。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類所農(nóng)產(chǎn)品加工微生物遺傳改良與應(yīng)用團(tuán)隊(duì)長期從事麻類脫膠酶學(xué)研究，在工程酶項(xiàng)目組對耐熱的木聚糖酶基因原核表達(dá)的基礎(chǔ)上[14]，根據(jù)一種新型木聚糖酶基因xynA(GenBank登錄號：U57819)的成熟蛋白編碼序列構(gòu)建真核表達(dá)體系，進(jìn)而對表達(dá)產(chǎn)物定性和定量分析，為該木聚糖酶的功能研究和大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 YPD培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基。

1.1.2 引物 5′AOX引物序列：GACTGGTTCCAATTGACAAGC；3′AOX引物序列：GGATGTCAGAATGCCATTTGC。

1.1.3 主要試劑TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；兔抗his標(biāo)簽、羊抗兔、酵母基因組DNA快速抽提試劑盒(SK8228)、TCA沉淀試劑盒沉淀蛋白(BSP012)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；所有引物合成、基因合成以及DNA 序列測定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因合成 合成xynA(GenBank登錄號：U57819)中編碼成熟木聚糖酶的基因序列，正向序列添加GCgaattc(酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ)，反向序列添加ATgcggccgc(酶切位點(diǎn)NotⅠ)。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pPICZαA-xynA構(gòu)建及線性化 將包含木聚糖酶成熟蛋白編碼基因xynA的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pPICZαA分別用EcoR Ⅰ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，37 ℃保溫3 h后，分別用EasyPure PCR Purification Kit進(jìn)行純化后，用T4DNA 連接酶將2個(gè)片段進(jìn)行連接，將連接液轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10，將轉(zhuǎn)化液涂布到含Amp 25 μg/mL和Kan 50 μg/mL的LB平板上。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定，目的片段大小正確為陽性克隆。從陽性菌落提取質(zhì)粒，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，確定堿基無突變，即成功獲得pPICZαA-xynA。SacⅠ酶切重組質(zhì)粒pPICZαA-xynA，回收線性化后的正確DNA 片段。

1.2.3 畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化 挑取YPD平板上X33菌株接種進(jìn)入50 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為1.3～1.5，冰浴30 min。4 ℃，1 500 r/min，離心5 min沉淀細(xì)胞，于10 mL冰冷的無菌去離子水懸浮。4 ℃，1 500 r/min，離心5 min沉淀細(xì)胞，于5 mL冰冷的無菌去離子水懸浮。4 ℃，1 500 r/min，離心5 min沉淀細(xì)胞，于2 mL冰冷的無菌1 mol/L 山梨醇懸浮(該步驟重復(fù)1次)，分裝備用。取8 μL線性化的單拷貝質(zhì)粒加入80 μL X33感受態(tài)細(xì)胞并輕輕混勻，轉(zhuǎn)入2 mm預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，冰上放置5 min，放入電轉(zhuǎn)儀，電擊，電壓：1 500 V，電擊時(shí)間4.8 ms，電擊完成后，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，30 ℃，靜置培養(yǎng)1～2 h，取100 μL菌液涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板。將單菌落用無菌水充分打散、混勻，稀釋1 000 倍，再分別取100 μL菌液涂布于含0.8 mg/mL Zeocin的YPD平板。

1.2.4 陽性克隆的PCR鑒定 參照酵母基因組DNA快速抽提試劑盒說明書提取酵母基因組DNA。使用載體通用引物5′AOX和3′AOX引物序列，以pPICZαA-xynA質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR參數(shù)設(shè)置：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 木聚糖酶序列分析 根據(jù)木聚糖酶基因測序結(jié)果，翻譯成蛋白質(zhì)序列，利用NCBI中的Blast進(jìn)行序列比對，找到相似性較高的微生物來源的木聚糖酶氨基酸序列，利用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 X33/pPICZαA-xynA分泌表達(dá) 挑選7 個(gè)高濃度抗生素篩選后的單克隆，于2.5 mL YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h。配制BMGY(pH值6.0)培養(yǎng)基，分別接種200 μL菌液(包括X33/pPICZαA空載)，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)4.7，離心，換成培養(yǎng)基BMMY(pH值6.0)，每12 h加入0.5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度29 ℃，220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)72 h，測定粗酶液的木聚糖酶活力。

1.2.7 Western Blot 鑒定木聚糖酶 SDS-PAGE樣品制備：取600 μL誘導(dǎo)72 h的菌懸液離心收獲上清，取200 μL上清，采用生工TCA沉淀試劑盒沉淀蛋白，最終蛋白重懸液體積為20 μL。X33/pPICZαA-xynA轉(zhuǎn)化子分別記為：X33/pPICZαA-H1～H7，陰性對照為X33/pPICZαA。SDS-PAGE電泳：濃縮膠5%，分離膠12%。取20 μL上樣。濃縮膠在80 V條件下電泳30 min；分離膠在120 V條件下電泳60 min。考馬斯亮藍(lán)法染色。Western Blot流程：①轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)，250 mA，2 h；②封閉：5%的脫脂奶粉，37 ℃ 緩慢振蕩1 h；③孵育一抗(兔抗his標(biāo)簽)：1∶500稀釋，37 ℃ 緩慢振蕩60 min；④孵育二抗(羊抗兔)：1∶8 000稀釋，37 ℃ 緩慢振蕩60 min；⑤顯色：TMB顯色[15]。

1.2.8 木聚糖酶活力測定 取發(fā)酵液10 mL，在4 ℃條件下，3 000 r/min離心10 min，上清液即為酶液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液和2.0 mL 0.5%的木聚糖底物(緩沖體系為pH值6.0，0.05 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉)，60 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，沸水浴10 min終止反應(yīng)。同時(shí)，將1.0 mL相同酶液在沸水浴中滅活5 min，后續(xù)做相同處理為空白對照，測定OD540。酶活力定義：在適當(dāng)反應(yīng)條件下，每分鐘釋放出1 μmol還原糖(以木糖計(jì))所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位，以U表示[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒SacⅠ線性化及轉(zhuǎn)化

對SacⅠ酶切后的線性質(zhì)粒進(jìn)行檢驗(yàn)。圖1結(jié)果表明，其片段約為4 646 bp(泳道2)，這與預(yù)期的載體3 593 bp 和目的基因1 053 bp之和基本一致。將正確的線性化的重組子轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X33。

M.從上到下依次為20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp；1.未線性化pPICZαA-xynA質(zhì)粒；2.線性化的pPICZαA-xynA質(zhì)粒。M.From top to bottom 20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp; 1.Unlinearized pPICZαA-xynA plasmid; 2.Linearized pPICZαA-xynA plasmid.

2.2 菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取7 個(gè)單菌落，以質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定。圖2結(jié)果表明，7 個(gè)轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物均有一特異條帶(約1 541 bp)，其分子量大小與預(yù)計(jì)大小相同。

M.20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp；P.陽性對照；L-1～L-7.7個(gè)轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物。M.20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp; P.Positive control；L-1-L-7.PCR products of 7 transformers.

2.3 木聚糖酶序列分析

通過生物信息學(xué)軟件分析，該木聚糖酶含有典型的糖苷水解酶11類催化結(jié)構(gòu)域(圖3)，成熟蛋白的預(yù)測分子量為38.6 ku，等電點(diǎn)為6.86。用MEGA 6.0軟件對不同微生物來源木聚糖酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行聚類分析。圖4結(jié)果表明，在進(jìn)化樹中，本研究的木聚糖酶與來源于Orpinomycessp. FCT 2進(jìn)化的木聚糖酶遺傳距離最近，處于同一分支上。

圖3 木聚糖酶的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Analysis on structural domain of xylanase

圖4 不同來源木聚糖酶序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-Joining tree constructed showing phylogenetic relationships amongxylanase sequences from different microorganisms

2.4 X33/pPICZαA-xynA分泌表達(dá)檢測

2.4.1 木聚糖酶活力檢測 取成熟的發(fā)酵液，測定胞外木聚糖酶活力。由表1可知，在該測定條件下，7個(gè)基因工程菌的胞外木聚糖酶活力均≥300 U/mL，其中，L-7測得的果膠裂解酶活力最高，達(dá)487.2 U/mL。

表1 基因工程菌種的木聚糖酶活力檢測Tab.1 Detection on xylanase activity secreted by genetic-engineering strains U/mL

2.4.2 SDS-PAGE分析 取誘導(dǎo)72 h后的胞外蛋白進(jìn)行電泳。圖5結(jié)果表明，7 個(gè)基因工程菌種的胞外蛋白特征譜帶大小均約為45 ku，比目標(biāo)XynA蛋白預(yù)期大小38.6 ku略大。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；N.陰性對照；H-1～H-7.7 個(gè)基因工程菌的胞外誘導(dǎo)蛋白。圖6同。M.Protein molecular weight ledders;N.Negative control；H-1-H-7.Extracellular inducible proteins of 7 genetically engineered bacterias.The same as Fig.6.

2.4.3 Western Blot分析 對基因工程菌的胞外蛋白進(jìn)一步Western Blot分析，圖6結(jié)果表明，與陰性對照比較，H-1～H-7均在45～60 ku附近有明顯條帶信號。其分子量也比目標(biāo)XynA蛋白預(yù)期的38.6 ku略大，推測其可能是發(fā)生了糖基化或其他翻譯后修飾。

圖6 基因工程菌的胞外木聚糖酶Western Blot分析Fig.6 Western Blot analysis of extracellular xylanasesfrom genetic-engineering strains

3 討論與結(jié)論

木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛，但是應(yīng)用于不同領(lǐng)域的木聚糖酶需具有不同的酶學(xué)性質(zhì)，不同家族的木聚糖酶的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、作用方式和底物特異性有很大的區(qū)別。紙漿工業(yè)中，應(yīng)用較多的為耐熱的高活性的堿性木聚糖酶；食品和飼料加工業(yè)中，應(yīng)用較多的則為酸性木聚糖酶[17-18]。關(guān)于微生物木聚糖酶的耐熱性和耐堿性的研究較多，但是酸性和中性木聚糖酶的研究報(bào)道較少。本研究對一個(gè)新型的第11 家族的木聚糖酶基因構(gòu)建了真核表達(dá)體系，初步獲得的胞外酸性偏中性木聚糖酶活力最高達(dá)487.2 U/mL，是同類基因其他胞外分泌量的8～10 倍[19-21]。其表達(dá)產(chǎn)物分子量比目標(biāo)XynA蛋白預(yù)期的(38.6 ku)略大，推測其可能是發(fā)生了糖基化或其他翻譯后修飾[22]，還有待進(jìn)一步證實(shí)。

通過優(yōu)化發(fā)酵條件，可以大幅度提高木聚糖酶的產(chǎn)酶量。王雅珍等[23]通過對1株青霉菌的液體發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果表明產(chǎn)木聚糖酶酶活力達(dá)到1 808 U/mL，是初篩酶活的361.6%。滕超等[24]對1株真菌嗜熱踝節(jié)菌的木聚糖酶產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)第7天產(chǎn)酶量達(dá)3 026.65 U/mL，是初始酶活的3.15倍。本研究后續(xù)將會(huì)嘗試優(yōu)化基因工程菌種X33/pPICZαA-xynA的產(chǎn)酶條件，有望大幅度提高木聚糖酶的分泌量。

雖然市場上現(xiàn)有很多木聚糖酶的相關(guān)商品，但是具有競爭力的產(chǎn)品大部分來自外國公司(如杰能科諾、諾德和諾維信等)，國內(nèi)仍需自主大力開發(fā)各種木聚糖酶新產(chǎn)品[16]。

本研究對一種新型G11木聚糖酶基因構(gòu)建了真核表達(dá)體系。一種新型木聚糖酶基因在畢赤酵母中獲得可溶性高效表達(dá)，為下一步獲取高純度木聚糖酶研究酶學(xué)性質(zhì)、催化分子機(jī)理以及大規(guī)模研制木聚糖酶制劑奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。