鄧鵬輝，馬常亭，張 健，高明霞，李鴻佳，張才擎

支氣管哮喘是由遺傳、環(huán)境等多種因素共同導致的氣道慢性炎癥性疾病。隨著人類生活環(huán)境的改變，哮喘的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢，調查統(tǒng)計全球范圍內有近3億哮喘患者，而目前在治療中，激素干預在哮喘治療中的有效性成為國際共識[1]，其治療哮喘的機制較為復雜，也一直是專家學者的研究熱點。氣道重塑是哮喘病程中重要的病理特征，有文獻[2]報道核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號通路參與哮喘氣道重塑的過程，而多位學者研究發(fā)現(xiàn)激素干預能顯著抑制氣道重塑這一病理過程，但是否通過抑制NF-κB/TGF-β1信號通路來達到治療哮喘的目的少有文獻提及。該研究通過觀察布地奈德霧化給藥后小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar fluid，BALF)和肺組織中各種炎性因子的變化，探討布地奈德對哮喘氣道炎癥和氣道重塑的抑制作用及相關作用途徑。

1 材料與方法

1.1動物雌性BALB/C小鼠30只，6～8周齡，16～20 g，購自山東大學醫(yī)學動物實驗中心，室溫20～22 ℃條件下飼養(yǎng)，自由進食飲水。

1.2主要試劑雞清卵蛋白(ovalbumin，OVA)(美國Sigma公司)；布地奈德霧化液(budesonide，BUD)(上海阿斯利康制藥有限公司)；白介素-13(interleukin-13，IL-13)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-5(interleukin-5，IL-5)ELISA試劑盒(杭州X-Y Biotechnology公司); 轉化生長因子-β1(TGF-β1)、核轉錄因子-κB p65(NF-κB p65)兔抗人一抗(美國Santa Cruz 公司)；山羊抗兔二抗、GAPDH山羊抗兔抗體(英國Abcam公司)；TRIzol 試劑液及引物(美國Invitrogen 公司)；SYBR Premix Ex Taq 和 PrimeScript RT 試劑盒(大連TaKaRa 公司)；980超聲霧化儀(上海新天緣醫(yī)療設備有限公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型制備與分組 隨機將30只小鼠分為對照組、布地奈德組及哮喘組，每組10只。布地奈德組及哮喘組分別在第1天、第8天腹腔注射OVA混懸液(0.1 mg OVA+1 mg 氫氧化鋁溶于2 ml生理鹽水配成)0.5 ml/只，致敏；對照組用等量含有氫氧化鋁凝膠的生理鹽水代替。1周后(第15天)將布地奈德組及哮喘組霧化吸入2 ml OVA 溶液(2.5 g/10 g OVA/PBS)，連續(xù)霧化1周，1次/d，對照組則用等量生理鹽水代替。布地奈德組小鼠分別在霧化OVA溶液前2 h給予BUD 10 ml霧化吸入；對照組給予等量生理鹽水對照。

1.3.2標本的采集 小鼠最后一次霧化致敏完畢后，水合氯醛(10%)麻醉(0.15 ml/10 g 體質量)。固定并解剖小鼠胸頸部組織，暴露氣管并連接留置針，將生理鹽水緩慢注入兩肺，回抽灌洗液，暫置于冰上放存，隨后于4 ℃、1 500 r/min離心5 min，收集并區(qū)別標記上清液。取出支氣管及肺組織后用4%多聚甲醛固定，用于制片后HE染色和圖像采集，取部分肺組織于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3肺組織HE染色 各組小鼠肺組織經4%多聚甲醛固定后，行常規(guī)脫水、包埋、切片，經染色、脫水、中性樹膠封片，隨后于顯微鏡下觀察各組小鼠氣道管周圍炎癥細胞的浸潤情況，基底膜連續(xù)性的變化及肺泡損害的程度。

1.3.4BALF細胞因子含量測定 采用ELISA法測肺泡灌洗液IL-13、IL-4、IL-5細胞因子的含量，測出各個樣本指標相應的光密度(optical density OD)值，根據各OD值計算相應濃度，具體過程按各試劑盒說明書操作嚴格執(zhí)行。

1.3.5Western blot 檢測肺組織中NF-κB p65、TGF-β1的含量 取肺組織標本100 mg加裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1) 0.5 ml，置冰上剪碎并勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心 15 min，取上清液加入上樣緩沖液，95 ℃金屬浴5 min。分裝后放-80 ℃冰箱保存。配10%分離膠及5%濃縮膠行蛋白凝膠電泳，電泳完畢，將蛋白轉膜至 PVDF 膜上，用5% 脫脂牛奶封閉，加入NF-κB p65、TGF-β1兔抗人多克隆抗體，內參山羊抗兔GAPDH抗體4 ℃ 孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗( 1 ∶5 000) 37 ℃孵育2 h,ECL發(fā)光試劑盒顯影。用 Image J 軟件分析測定條帶的積分光密度值的峰面積。

1.3.6RT-PCR檢測NF-κB p65及TGF-β1 mRNA表達 各組小鼠取適量肺組織，加入一定量TRIzol提取總RNA，依照試劑盒說明，取2 μg總RNA 反轉錄成 cDNA，然后取2 μl cDNA產物， SYBR 預混液 16 μl、上下游引物各1 μl，共20 μl總 反 應 體 系 行 實 時 定 量 PCR。NF-κB p65上游引物:5’-GA CCTGGAGCAAGCCATTAG-3’,下游引物:5’-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3’；TGF-β1上游引物:5’-GGAGCCCGAAGCGGACTA-3’，下游引物:5’-GCGTTGTTGCGGTCCAC-3’;GAPDH上游引物:5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’,下游引物:5’-CATCGAAGGTGGAAGAGTGG-3’。反應程序：95 ℃預變性90 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，至40個循環(huán)后，用熒光定量 PCR 儀(ABI7500)自動分析和計算出每個樣本ct值，實驗組NF-κB p65、TGF-β1 mRNA 相對于對照組基因表達倍數采用2-ΔΔCT進行數據處理。

1.3.7圖像采集分析 于顯微鏡下放大觀察各組小鼠肺切片中肺泡和支氣管周圍炎癥情況，每張切片選取3個具有完整的小支氣管且直徑在100～200 μm的橫截圖像，運用圖像采集系統(tǒng)、醫(yī)學圖像分析軟件測定支氣管腔基底膜周長(perimeter basement membrane，Pbm)、支氣管管壁面積(wall area of bronchial tube，WAt)、支氣管管壁平滑肌面積(wall area of bronchial smooth muscle，WAm)及平滑肌細胞計數(number of bronchial smooth muscle cells，N)，上述指標Pbm標準化后， 用WAt/Pbm、WAm/Pbm、N/Pbm表示。

2 結果

2.1肺組織病理切片HE染色結果對照組小鼠支氣管黏膜下及管腔周圍無炎細胞浸潤，管腔完整光滑，肺泡結構清晰，基底膜無斷裂和增厚、無新生血管形成。哮喘組小鼠支氣管管腔狹窄、管壁增厚，黏膜充血水腫伴有炎細胞浸潤，基底膜增厚不規(guī)則，有新生血管形成；布地奈德組有哮喘組的病理特點，但程度均較哮喘組明顯減輕。見圖1。

2.2BALF中IL-13、IL-4、IL-5含量檢測結果哮喘組與對照組相比,BALF中上述細胞因子表達水平明顯比對照組高(P<0.05)，哮喘組與布地奈德組相比，則布地奈德組中各指標水平明顯降低(P<0.05)，見圖2。

2.3肺組織中NF-κBp65、TGF-β1蛋白的含量哮喘組小鼠肺組織中NF-κB、TGF-β1表達明顯高于布地奈德組(P<0.05)，亦高于對照組，布地奈德組上述指標也高于對照組，見圖3。

2.4各組肺組織中TGF-β1mRNA的相對表達量Real-time PCR 結果顯示，哮喘組小鼠肺組織NF-κB p65、TGF-β1 mRNA表達量均明顯高于對照組(P<0.05)，布地奈德組NF-κB p65、TGF-β1 mRNA 水平低于哮喘組，但高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

2.5圖像分析布地奈德組小鼠的 WAt/Pbm、WAm/Pbm較哮喘組小鼠明顯偏低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是涉及多種炎癥細胞和相關細胞因子參與的慢性氣道變態(tài)反應性呼吸系統(tǒng)疾病。其中，氣道重塑是支氣管哮喘的重要病理過程之一[3]，是引起哮喘氣流受限的重要環(huán)節(jié)，因此抑制哮喘的氣道重塑可能成為哮喘治療的關鍵。目前關于哮喘氣道重塑機制的研究已引起專家學者的廣泛關注，其具體形成機制尚無定論。NF-κB是一種轉錄調節(jié)因子，可參與多種蛋白的轉錄調控[4]，通過調節(jié)免疫及炎癥和相關炎癥因子之間的相互效應，在炎癥反應和免疫調節(jié)中起關鍵作用[5]，有研究[5-6]報道NF-κB在支氣管哮喘的氣道重塑的過程中同樣扮演重要角色，可通過激活多種炎癥細胞并促進與炎癥相關的基因轉錄來加重氣道炎癥反應[7]，反復的炎癥刺激進而促使氣道重塑的發(fā)生。而抑制NF-κB的活化會對哮喘病理過程和炎癥反應產生重要影響[8-9]。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色情況 ×200A：對照組; B：布地奈德組; C：哮喘組

圖2 ELISA法檢測各組小鼠BALF中IL-13、IL-4、IL-5細胞因子的含量A：IL-4；B：IL-13；C：IL-5；1：對照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

圖3 Western blot法檢測各組小鼠肺組織NF-κB p65、TGF-β1蛋白的表達水平A：NF-κB p65；B：TGF-β1；1：對照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

圖4 Real-time PCR檢測各組肺組織NF-κB p65、TGF-β1 mRNA相對表達水平A：NF-κB p65 mRNA；B：TGF-β1 mRNA；1：對照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

圖5 各組小鼠WAt/Pbm、WAm/Pbm、N/Pbm的比較A：WAt/Pbm；B：WAm/Pbm；C：N/Pbm；1：對照組；2：布地奈德組；3：哮喘組；與對照組比較:*P<0.05；與哮喘組比較:#P<0.05

TGF-β1是Th2型細胞因子，是導致肺纖維化和氣道重塑的重要炎癥介質，可通過對相關炎癥細胞和細胞因子的調節(jié)進而使膠原合成、血管形成、上皮下纖維化等氣道結構的變化[10]，促進氣道的重塑。有學者報道[11]，TGF-β1基因的轉錄有賴于NF-κB的活化，進而使TGF-β1表達增加，而TGF-β1會誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，促進平滑肌細胞分裂增殖肥大，促進氣道膠原沉積和基底膜增厚等，致使氣道重塑，氣管管腔狹窄[7,12]，本研究中哮喘小鼠的氣道重塑與NF-κB及TGF-β1的關系也佐證了上述研究。

IL-13、IL-4、IL-5亦屬于Th2型細胞因子，也參與哮喘的氣道炎癥和重塑的過程，IL-13、IL-4等細胞因子的表達，加重炎癥反應，而IL-13、IL-4、IL-5能夠上調TGF-β1，進一步促進氣道結構改變，在試驗中各組小鼠BALF上述炎癥因子差異也較為明顯。

吸入糖皮質激素是目前治療支氣管哮喘國際公認的有效藥物，其主要作用于支氣管上皮細胞，通過抑制相關炎癥趨化因子的釋放，從而抑制炎癥細胞向氣道聚集，使哮喘炎癥反應減輕，在本研究中，布地奈德干預后NF-κB、TGF-β1表達均低于模型組，提示布地奈德可下調NF-κB、TGF-β1的表達起到治療哮喘作用。有研究[13-14]報道通過信號通路NF-κB/TGF-β1可致細胞外基質的產生及氣道重塑，而NF-κB的活化對TGF-β1的表達有較大影響[12]，因此推測霧化吸入布地奈德可能是通過抑制NF-κB/TGF-β1這一信號通路來達到抑制氣道重塑的目的。

實驗結果顯示，布地奈德組較哮喘組IL-13、IL-4、IL-5 Th2細胞因子明顯減少，較對照組高，說明布地奈德在哮喘治療中具備對抗氣道炎癥的作用；同時肺組織HE染色顯示布地奈德組哮喘小鼠氣道狹窄程度較哮喘組有顯著緩解，能夠改善氣道重塑；各組小鼠肺組織中NF-κB、TGF-β1的含量顯示布地奈德組中兩種指標與哮喘組相比明顯降低，較對照組高，Real-time PCR 結果顯示NF-κBp65、TGF-β1mRNA在哮喘組明顯高于對照組和布地奈德組，說明布地奈德能夠抑制NF-κB、TGF-β1表達和兩者mRNA轉錄；各組圖像分析結果中布地奈德組小鼠的 WAt/Pbm、WAm/Pbm較哮喘組小鼠明顯偏低。上述結果表明NF-κB/TGF-β1通路在哮喘早期氣道重塑中起重要作用，布地奈德干預能夠抑制NF-κB表達而阻止TGF-β1mRNA的轉錄，達到抑制哮喘早期氣道重塑。

綜上所述，布地奈德可能通過抑制NF-κB/TGF-β1這一信號通路抑制早期氣道重塑是其治療哮喘的機制之一，限于實驗的條件、方法及樣本量等因素，其具體阻斷信號通路的原理仍需進一步探索。