徐艷雪，韓曈曈，朱友明，陳喬爾

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類不具有蛋白編碼功能的RNA分子，其轉錄物長度大于200個核苷酸。研究顯示，lncRNA是胚胎發(fā)生[1]、干細胞生物學和細胞發(fā)育[2]及癌癥進展[3]中至關重要的調節(jié)因子。c-Myc是一種較早被證實的癌基因，能與一些蛋白編碼或非編碼RNA的啟動子調節(jié)區(qū)域結合，促進細胞分裂，使細胞永生化，在多種人類腫瘤的檢測中都能發(fā)現其表達升高。因此，為了在舌鱗癌中識別參與c-Myc功能調控的lncRNAs，該研究使用攜帶c-Myc tet-off系統(tǒng)的SCC3舌鱗癌細胞進行基因芯片分析。經過初步篩選，發(fā)現敲低c-Myc表達水平，一種新基因lncRNA7(lncRNA-RP11-132A1.4，位于chr7:100,951,626-100,954,266，序列名稱ENST00000419422)的表達顯著下調。該實驗旨在探究敲低受c-Myc調控的lncRNA7后，觀察舌鱗癌細胞SCC3增殖的變化，從而為舌鱗癌的分子靶向治療提供新契機。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑人源SCC3舌鱗癌細胞和人源293T胚胎腎細胞均為安徽醫(yī)科大學口腔實驗室保種；DMEM培養(yǎng)液、青鏈霉素溶液、胎牛血清、PBS、胰酶溶液購自GIBCO公司和Hyclone公司；大腸桿菌DH5α為本實驗室傳代保存；1%氯化鈉、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物購自上海生工生物工程股份有限公司；慢病毒包裝試劑購自上海和元技術有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；actin抗體、c-Myc抗體購自美國Santa Cruz公司；RNA提取試劑盒購自美國Promega公司，逆轉錄試劑盒、QRT反應試劑盒購自日本TaKaRa公司，質粒提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購自美國Axygen公司，蛋白質定量試劑盒購自美國Thermo公司，MTT試劑購自美國Sigma公司，DEPC無酶水，DMSO試劑購自上海碧云天科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將SCC3細胞和293T細胞分別培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM溶液中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。隔天換液，依據細胞生長情況適時進行傳代及凍存，后續(xù)實驗備用。

1.2.2載體構建 下調c-Myc表達的pLKO.1-shc-Myc組及pLKO.1-shc-cMyc-ctrl對照組、上調c-Myc表達的Flag-c-Myc組及Flag對照組載體均由中國科學技術大學生命科學院提供。shlncRNA7載體引物由上海生工技術服務有限公司設計和合成，擴增得到目的片段shlncRNA7 F：5′-CCGGGGAAAGGG AAGAAGTCCTCCTCGAGGAGGACTTCTTCCCTTTCC TTTTTG-3′，R：5′-AATTCAAAAAGGAAAGGGAAGAA GTCCTCCTCGAGGAGGACTTCTTCCCTTTC-C-3′。將上述擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離、純化產物，回收目的片段。限制性內切酶酶切載體pLKO.1，T4連接酶在37 ℃水浴中將目的片段與載體連接，將連接產物轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)14 h。選取陽性菌落送公司測序鑒定，證實構建成功。

1.2.3慢病毒包裝與轉染 根據實驗需要，以上已構建好的攜帶pLKO.1-shc-Myc、Flag-c-Myc、pLKO.1-shlncRNA7的載體均需分別進行慢病毒包裝與轉染。病毒包裝過程中將2 μg攜帶目的基因的載體以及3種包裝輔助質粒包括2 μg pREV、2 μg pGag和1μg pVSVG共同轉染入293T細胞(293T細胞在轉染前先接種于6孔板中，待密度達到50%～60%時進行轉染，轉染前1 h更換新鮮培養(yǎng)基)，于不含血清的DMEM溶液中培養(yǎng)6 h，再更換為含有20%胎牛血清的DMEM溶液，收集48、72 h含有病毒的細胞上清液保存于-80 ℃中。轉染SCC3細胞前一天胰蛋白酶消化細胞，取適量接種于6孔板中，密度15%左右，待第2天SCC3密度達30%左右再將以上收集到的含病毒的細胞上清液轉入，每孔同時加入8 mg/L的Polybrene 2 μl。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后接種至6孔板,待細胞生長到密度大約70%時加入5 mg/L嘌呤霉素篩選，24 h后觀察細胞凋亡情況；再吸取上清液，更換新的選擇性培養(yǎng)液。在加藥篩選2～3周情況下能存活的SCC3細胞即為轉染成功的細胞，死亡的細胞即為未轉染成功的細胞。對存活的細胞進行克隆和擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至適當規(guī)模時，收集該單克隆抗藥細胞。

1.2.4Western blot檢測c-Myc的蛋白表達 SCC3細胞分為pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組、pLKO.1-shc-Myc組、Flag對照組和Flag-c-Myc組。每組加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，分別收集裂解液至1.5 ml Ep管中。BCA法定量測樣品的蛋白濃度，每組取等量的蛋白樣品，SDS-PAGE電泳，轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，每組分別加入c-Myc抗體(貨號CST9402，1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，加入相應二抗室溫孵育1.5 h，TBST再清洗3次，底物化學發(fā)光檢測法顯影。

1.2.5qRT-PCR檢測lncRNA7的表達水平 用TRIzol分別提取穩(wěn)定轉染pLKO.1-shc-Myc組、pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組、Flag-c-Myc組、Flag對照組、pLKO.1-shlncRNA7組 及pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組的SCC3細胞中的總RNA。利用PrimeScriptTMRT Master Mix 逆轉錄試劑盒獲得cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ncRNA7引物F：5′-GGAAAGGGAAGAAGTCCTCCC-3′，R：5′-TCCACAATTCTCTA-TATGACA-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)。以GAPDH作為分子內參，待反應完畢以ΔΔCt值來分析各組的結果。pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7表達量的均數設為1，計算出pLKO.1-shc-Myc組SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7的相對表達量；Flag對照組SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7表達量的均數為1，計算出Flag-c-Myc組SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7的相對表達量；pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7表達量的均數設為1，計算pLKO.1-shlncRNA7組SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7的相對表達量。

1.2.6MTT實驗檢測SCC3細胞生長 將pLKO.1-shlncRNA7組和pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組的SCC3細胞接種于96孔板，密度為2×103個/孔，在0、6、12、24、48、72 h的6個時間點棄原培養(yǎng)液，每孔加入5 g/L 的MTT 20 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h，再棄培養(yǎng)液，每孔新加入150 μl的 DMSO，振蕩10 min，酶標儀570 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。

1.2.7細胞克隆實驗檢測SCC3細胞增殖 將pLKO.1-shlncRNA7組和pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組SCC3細胞分別接種于6孔板，密度為300個/孔，培養(yǎng)10 d。4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色4 h，TBST清洗。

1.2.8熒光原位雜交技術檢測lncRNA7的定位 將細胞標本放在含10%固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)的1×PBS中5 min進行預變性。將玻片標本浸入固定液中2次，每次10 min，再將標本依次經體積分數為70%、90%和100%的冰乙醇，然后干燥。濕盒中倒入50%甲酰胺/2×SSC 50 ml，37 ℃預熱。以地高辛標記DNA探針，序列為ACTCAATTCAAATATTTAATGGGTTGTACTCTGGCCATTCAGG-TGAACAAAATCTGCTGG，孵育探針，80 ℃變性10 min。變性好的樣本于濕盒中37 ℃雜交過夜。次日，將已雜交的玻片標本置于42～50 ℃體積分數為50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。2×SSC室溫下清洗玻片標本。細胞核Hoechst染色1 min，2×SSC洗滌2次，指甲油封閉蓋片，熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1不同表達載體轉染SCC3細胞后c-Myc蛋白的表達將構建好的載體pLKO.1-shc-Myc組及其pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組轉染入SCC3細胞，通過Western blot檢測c-Myc蛋白表達情況。結果表明，與pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組相比，pLKO.1-shc-Myc組中c-Myc表達水平明顯降低(P<0.05)；同樣，將構建好的載體Flag-c-Myc及其Flag對照組轉染入SCC3細胞，通過Western blot檢測c-Myc蛋白表達情況。結果表明，與Flag對照組相比，Flag-c-Myc組中c-Myc表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 c-Myc蛋白表達情況A:pLKO.1-shc-Myc組和pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組轉染入SCC3細胞后細胞中c-Myc的蛋白表達；B：Flag-c-Myc組和Flag對照組轉染入SCC3細胞后c-Myc的蛋白表達

2.2c-Myc表達水平對lncRNA7表達的影響利用qRT-PCR檢測上述成功表達shc-Myc的SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7的表達水平。結果表明，與pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組相比，pLKO.1-shc-Myc組lncRNA7的表達水平下降(F=132.589，P<0.05)；同樣，利用qRT-PCR檢測上述成功過表達c-Myc的SCC3細胞中l(wèi)ncRNA7的表達水平。結果表明，與Flag對照組相比，Flag-c-Myc組lncRNA7的表達水平上升(F=602.91，P<0.05)，見圖2。提示在舌鱗癌細胞SCC3中l(wèi)ncRNA7受c-Myc的正調控。

2.3pLKO.1-shlncRNA7轉染SCC3細胞后lncRNA7的表達將構建好的載體pLKO.1-shlncRNA7組及其pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組轉染入SCC3細胞，通過qRT-PCR檢測lncRNA7的表達水平。結果表明，與pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組相比，pLKO.1-shlncRNA7組中l(wèi)ncRNA7表達水平明顯降低(F=278.639，P<0.05)，見圖3。

圖2 c-Myc對lncRNA7表達的影響A: 下調c-Myc后lncRNA7的表達情況；B：上調c-Myc后 lncRNA7的表達情況；與pLKO.1-shc-Myc-ctrl對照組比較：*P<0.05；與Flag對照組比較：#P<0.05

圖3 lncRNA7表達情況與pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組比較：*P<0.05

2.4lncRNA7對SCC3細胞生長的影響利用上述成功表達shlncRNA7的SCC3細胞進行MTT實驗。結果表明，與pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組相比，pLKO.1-shlncRNA7組在轉染0、6、12、24 h SCC3細胞生長差異無統(tǒng)計學意義，但轉染48 h后，pLKO.1-shlncRNA7組細胞增殖速率明顯低于pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組，且與對照組SCC3細胞克隆數差異有統(tǒng)計學意義(F=265.457，P<0.05)，見圖4。

2.5lncRNA7對SCC3細胞增殖能力的影響利用上述成功表達shlncRNA7的SCC3細胞進行細胞克隆實驗。結果表明，與pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組相比，pLKO.1-shlncRNA7組細胞克隆數量明顯減少(F=69.120，P<0.05)，見圖5。

圖4 轉染shlncRNA7后SCC3細胞生長情況與pLKO.1-shlncRNA7-ctrl對照組比較：*P<0.05

圖5 轉染shlncRNA7后SCC3細胞克隆數量情況 結晶紫染色

2.6lncRNA7在SCC3細胞中的定位熒光原位雜交實驗結果表明lncRNA7定位于SCC3細胞質中，見圖6。因此，可以初步推測lncRNA7于細胞質中發(fā)揮上述功能。

3 討論

舌鱗狀細胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，具有較高轉移率和死亡率[4]。目前通常采用外科手術聯合放療和化療等綜合手段治療，但舌鱗癌患者的5年生存率仍然不夠理想[5]。因此，從基因水平上尋找舌鱗癌潛在的分子機制來改善治療策略十分必要。

近年來，lncRNA引起了越來越多學者的關注，其在腫瘤中的異常表達和突變通過細胞增殖、侵襲和轉移促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，lncRNA CRNDE在肝癌細胞中高表達并能促進肝癌進展[6]；lncRNA LOC554202在結腸癌中低表達且與TNM分期、組織學分級及淋巴結轉移等因素相關[7]。Myc基因家族是已被發(fā)現的一組癌基因。c-Myc作為Myc家族的一員，通常被認為在細胞周期、增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要調控作用[8]。c-Myc癌基因及其蛋白產物幾乎在所有類型惡性疾病中均有表達的升高[9]。Hu et al[10]在非小細胞肺癌中通過染色質免疫沉淀等一系列實驗證實c-Myc可與lncRNA BCYRN1基因的啟動子區(qū)域結合并靶向其上調，導致細胞運動和侵襲能力增加；另有研究[11]顯示lncRNA PCAT-1能上調c-Myc蛋白，促進前列腺癌細胞增殖，其通過Myc 3’非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)在轉錄后水平調控c-Myc，并且還觀察到PCAT-1能夠經miR-34a干擾Myc的調控。因此，這些證據都表明c-Myc與lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中密切相關。然而，對c-Myc相關lncRNA在舌鱗癌中作用的研究甚少，仍有待發(fā)展。

本實驗通過基因芯片發(fā)現了舌鱗癌細胞SCC3中受c-Myc正調控的lncRNA7，并通過下調和上調c-Myc，進一步驗證其對lncRNA7表達水平的影響，發(fā)現lncRNA7表達的確受c-Myc的正調控。將SCC3細胞中敲低lncRNA7作為實驗組，shctrl作為對照組進行MTT實驗，在最初轉染的0、6、12、24 h,兩組SCC3細胞生長基本無差異，隨著時間的延長，轉染48 h后開始觀察到與對照組相比，shlncRNA7實驗組細胞增殖速率有所降低，且SCC3細胞增殖數與對照組相差也越發(fā)顯著；此外，對兩組細胞還進行了細胞克隆實驗，shlncRNA7實驗組細胞克隆形成數量明顯少于對照組；通過以上兩個實驗證實敲低lncRNA7可以抑制SCC3細胞增殖。最后通過熒光原位雜交實驗證實了lncRNA7定位于SCC3細胞質中，由此可初步推斷敲低lncRNA7抑制SCC3細胞增殖和克隆是于細胞質中發(fā)揮的作用，這可為進一步探究lncRNA7在細胞中的功能提供線索，也為臨床舌鱗癌的基因治療提供理論依據。

圖6 lncRNA7在細胞中的定位情況 Hoechst染色×160A：紅色代表lncRNA7；B：藍色代表用Hoechst染色的細胞核；C：A和B結合