黃紹代，王 玉，魯長風，陳 鵬，王 沖，劉雪劍，孫百川，張凱紅，荊曉光，胡 丹，彭 江，田建偉,2

干細胞移植技術的廣泛研究，為臨床上治療各種疾病提供了新的思路。而種子細胞的選擇是干細胞移植的基本要素，脂肪干細胞具有來源豐富、取材方便、對供體損傷小、增殖分化能力強等優(yōu)勢，是目前干細胞移植的理想選擇。很多預臨床實驗都證實脂肪干細胞對缺血性心臟病有一定的治療效果[1-2]，但對于干細胞植入體內后的轉歸以及干細胞發(fā)揮作用的機制仍然不是很明確[3]。因此，提供一個簡單高效的干細胞標志方法，研究干細胞移植后在體內的存活率、遷移轉歸和分布已成為干細胞移植研究領域的熱點之一。而一個好的細胞標志物需具備不易洗脫、不易被代謝、標記后的信號容易被檢測等特點[4]。PKH26是目前應用較多的一種親脂性細胞標志物，已有文獻[5-6]報道了PKH26用于示蹤間充質干細胞以及神經干細胞的研究。該研究探討PKH26熒光素染料對脂肪干細胞的生物學特性的影響，為進一步研究干細胞的遷移轉歸及示蹤提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級新生SD大鼠8只，雌雄不限，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.2實驗試劑和設備PKH26熒光染料/二型膠原酶(美國Sigma公司)；低糖DMEM/胎牛血清(美國CORNING公司)；PBS(中國索萊寶公司)；雙抗(美國Gibco公司)； CD45/CD11b(美國BD公司)；CD34/CD29/CD44/CD105(英國Abcam公司)；成脂誘導液/成骨誘導液/成軟骨誘導液 (中國Cyagen公司)；CCK8試劑盒(日本DOJINDO公司)；流式細胞儀(型號:FACSCelesta,美國BD公司)；微量孔板分光光度計(型號：EPOCH TAKE3，美國Biotek公司)；DP70熒光顯微鏡、IX70倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；YT-CJ-2NB超凈工作臺(北京亞泰公司)；低速臺式離心機(北京白洋公司)。

1.3實驗方法

1.3.1脂肪間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的分離培養(yǎng) 取新生SD大鼠8只，雌雄不限，浸泡于體積分數75%的乙醇溶液中5 min，移入超凈工作臺，乙醚麻醉，小心剝離腹股溝區(qū)的皮下脂肪組織，用眼科剪小心剝除筋膜組織，轉移至PBS溶液中清洗2～3次，將洗凈的脂肪組織轉移至青霉素小瓶中，用眼科剪剪成 1～3 mm3，加入8 ml 0.1%的二型膠原酶，置于磁力攪拌器37 ℃消化30～40 min。加入培養(yǎng)液終止消化，1 700 r/min離心 5 min，棄上清液，用配制好的低糖DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃體積分數5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。48 h后換液去除未貼壁的細胞，細胞達80%融合時，用0.25%的胰酶消化傳代，按1 ∶3比例進行擴增傳代。

1.3.2PKH26標記ADSCs 胰酶消化P2代的ADSCs形成2×107個/cm2的細胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基，800 r/min離心5 min，吸棄上清液，使剩余液體低于25 μl，加入1 ml 試劑盒中稀釋液C，制備完全離散的細胞懸液。配制染色液：將4 μl的PKH26乙醇染料加入離心管中，再加入1 ml 稀釋液C制備染料溶液。盡快將離散的1 ml細胞懸液加入到配好的染液中，并用吸管均勻快速的混合，常溫孵育2～5 min，可輕輕顛倒混勻。加入2 ml的血清孵育1 min終止染色，再用4 ml含血清培養(yǎng)基稀釋終止的反應液，800 r/min離心10 min，吸棄上清液。再加入10 ml完全培養(yǎng)基，重復離心2次，每次800 r/min離心5 min，最后用10 ml完全培養(yǎng)基重懸到所需濃度，用合適的細胞濃度接種于培養(yǎng)瓶中，第2天在熒光顯微鏡下觀察細胞被標記的情況。

1.3.3ADSCs的免疫表型分析 胰酶消化P2代的ADSCs制成細胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基，800 r/min離心5 min，再用無血清培養(yǎng)基按照5.0×105個/ml密度進行重懸，吸取1 ml細胞懸液分別加入到7個15 ml聚丙烯離心管中，800 r/min離心5 min，吸棄上清液，留下約200 μl的液體，加入CD34-APC、CD45-PE、CD29-PE、CD44-APC、CD105-APC、CD11b-FITC室溫避光孵育20 min，加入PBS清洗未結合抗體，用流式細胞儀檢測各抗體的表達情況。

1.3.4ADSCs成脂誘導及鑒定 胰酶消化P2代PKH26標記和未標記的ADSCs,以2×104個/cm2的密度接種于六孔板中，每孔加入2 ml低糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸棄完全培養(yǎng)液，每孔加入2 ml配好的成脂誘導A液(A液基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰胺、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、羅格列酮、地塞米松)，誘導3 d后，吸掉六孔板中的A液，加入2 ml配好的成脂誘導B液(B液基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰胺、胰島素)，24 h后，吸棄B液，換回A液繼續(xù)誘導，A液和B液交替誘導3～4次(8～10 d)。誘導結束后，吸走六孔板中的成脂誘導培養(yǎng)基，用PBS洗1～2次，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸棄甲醛溶液，每孔加入1 ml配好的油紅O染液染色30 min，顯微鏡下觀察染色結果。

1.3.5脂肪干細胞成骨誘導及鑒定 胰酶消化P2代PKH26標記和未標記的ADSCs,以2×104個/cm2的密度接種于六孔板中，每孔加入2 ml低糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸棄完全培養(yǎng)液，每孔加入2 ml配好的成骨誘導液(基礎培養(yǎng)基、血清、雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松),之后每隔3 d換一次成骨誘導液，直至誘導3周。誘導結束后，吸走成骨誘導培養(yǎng)基，用PBS洗1～2次，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸棄甲醛溶液，每孔加入1 ml茜素紅染液染色3～5 min，顯微鏡下觀察染色結果。

1.3.6脂肪干細胞成軟骨誘導及鑒定 胰酶消化P2代PKH26標記和未標記的ADSCs，用配制的預混液(基礎培養(yǎng)基、地塞米松、抗壞血酸、ITS添加物、丙酮酸鈉、脯氨酸)以5.0×105個/ml的密度進行重懸，吸取1 ml細胞懸液轉移至15 ml的離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml的成軟骨誘導液(預混液，TGF-β3)，擰松離心管蓋，將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后小心更換誘導液，直至誘導28 d。誘導結束后，軟骨球經4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后切片，染色前先脫蠟和脫水，用阿利新藍染液，染色30 min，自來水沖洗2 min后水性封片劑封片，顯微鏡下觀察染色效果。

1.3.7CCK8檢測ADSCs的增殖能力 胰酶消化P2代PKH26標記和未標記的ADSCs，以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100 μl培養(yǎng)液，接種后連續(xù)培養(yǎng)6 d，每天在相同時間選擇6個孔(3個標記的ADSCs，3個未標記的ADSCs)加入10 μl的CCK8液，再在培養(yǎng)箱中孵育3 h，最后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(optical density,OD)。以3個孔OD值的平均值為縱坐標，對應的培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制出ADSCs的生長曲線。

2 結果

2.1ADSCs光鏡下的形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的ADSCs，細胞在未貼壁時大多呈圓形，折光性強，24 h后基本貼壁，細胞貼壁呈長梭形、多角形(圖1A)，48 h后，可傳P1代培養(yǎng)，傳代后細胞仍呈長梭形，輪廓清晰，呈旋渦狀或放射狀排列生長(圖1B)。當細胞融合度達到80%～90%時，傳P2代培養(yǎng)，傳代后細胞排列緊密，呈魚群樣生長(圖1C)。細胞用PKH26標記后形態(tài)無明顯變化，熒光顯微鏡下可見紅色熒光染料呈顆粒狀均勻的分布于ADSCs的細胞膜上(圖1D)。

2.2ADSCs免疫表型鑒定結果培養(yǎng)至P2代，流式細胞儀分析的結果顯示：95.3%的細胞CD44陽性，95.0%的細胞CD105陽性，94.6%的細胞CD29陽性，而僅有0.2%的細胞CD34陽性，5.4%的細胞CD45陽性，0.2%的細胞CD11b陽性，證實培養(yǎng)的是ADSCs，見圖2。

圖1 原代培養(yǎng)ADSCs的生長情況和PKH26標記ADSCs后的形態(tài) ×100A：P0代ADSCs；B：P1代ADSCs；C：P2代ADSCs；D：PKH26標記的ADSCs

2.3PKH26標記前后ADSCs分化能力情況成脂誘導后的3 d可見細胞逐漸回縮成多角形，并可見少量的脂滴，誘導8 d后的油紅O染色可見細胞內脂滴呈紅色(藍色箭頭,圖3A和圖3D)。成骨誘導后3 d，細胞逐漸變?yōu)殚L梭形，約10 d左右可見少量的鈣結節(jié)沉積，誘導21 d后可見大量的鈣結節(jié)，茜素紅染色可見橘紅色的鈣結節(jié)(黃色箭頭，圖3B和圖3E)。成軟骨誘導72 h后可見細胞逐漸聚集肉眼可見的小團，誘導14 d后細胞團逐漸透明成軟骨形態(tài)，阿利新藍染色后可見軟骨組織中的內酸性粘多糖(紅色箭頭，圖3C和圖3F)。通過對比圖3A和圖3D，圖3B和圖3E，圖3C和圖3F發(fā)現，PKH26對ADSCs的成脂、成骨、成軟骨的分化能力無影響。

2.4ADSCs已標記與未標記的增殖能力比較CCK8結果分析顯示，細胞在第2～4天生長速度最快，處于對數生長期，之后進入平臺期，細胞生長曲線見圖4。分光光度計測定標記前后的細胞在各時間點的吸光度值見表1，統(tǒng)計分析結果顯示，細胞在標記前后各時間點的吸光度值的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 P2代ADSCs流式細胞儀檢測結果

表1 PKH26標記前后的細胞在各時間點的OD值

圖3 PKH26標記前后ADSCs成脂、成骨、成軟骨誘導分化結果A、D：PKH26標記前后的ADSCs成脂誘導后油紅O染色(藍色箭頭：紅色脂滴)×100；B、E：PKH26標記前后的ADSCs成骨誘導后茜素紅染色(黃色箭頭：橘紅色的鈣結節(jié))×100；C、F：PKH26標記前后的ADSCs成軟骨誘導后的阿利新藍染色(紅色箭頭：軟骨組織中的內酸性粘多糖)×400

圖4 PKH26標記和未標記的ADSCs生長曲線對照組：未用PKH26標記的ADSCs的生長曲線;PKH26組:PKH26標記后的ADSCs的生長曲線

3 討論

目前研究比較多的細胞標志物有BrdU、放射性同位素、綠色熒光蛋白以及PKH26[7-8]。其中PKH26作為一種親脂性熒光染料，能夠不可逆地均勻的結合在細胞膜脂質雙分子層上，熒光顯微鏡下可見紅色熒光(激發(fā)光波長551 nm)。另外，熒光保留時間長，標記細胞種類廣泛，被標記的細胞在細胞分裂后，熒光染料也可均勻的分布于兩個子細胞中，而且標記后對細胞的生物學功能和增殖活性無影響，已成為研究細胞的遷移轉歸及示蹤的理想標志物。本研究從新生SD大鼠腹股溝區(qū)的皮下脂肪分離培養(yǎng)得到ADSCs，經流式細胞儀和成脂、成骨、成軟骨鑒定了ADSCs的免疫表型和多向分化的能力，結果均符合ADSCs的生物學特征[9-10]。用PKH26成功標記ADSCs后，光鏡下的結果顯示PKH26熒光素染料標記的ADSCs與未標記的ADSCs在形態(tài)上無明顯差異。在標記24 h后熒光顯微鏡下也可觀察到ADSCs細胞膜上均勻分布的強紅色熒光。將PKH26標記的ADSCs進行成脂、成骨、成軟骨誘導后發(fā)現PKH26并不影響ADSCs的多向分化能力，CCK8檢測結果顯示PKH26標記后對ADSCs的增殖活性無明顯影響。

近幾年大量文獻報道了關于PKH26標記細胞后示蹤其在體內遷移轉歸的研究。例如，Garikipati et al[11]通過將PKH26標記的間充質干細胞植入大鼠心肌梗死模型中，用于示蹤間充質干細胞移植后在梗死區(qū)域的停留率。同樣的， Tang et al[12]也通過將PKH26標記的心臟干細胞移植于老鼠心肌梗死模型中，用于研究血管內皮生長因子對移植的心臟干細胞的影響。另外，Huang et al[13]將PKH26標記的ADSCs注入大腦中動脈梗塞的老鼠體內，研究ADSCs在移植后的體內分布情況。國內學者薛改 等[14]通過PKH26標記人臍帶間充質干細胞，觀察人臍帶間充質干細胞移植在肝硬化大鼠體內后的遷移情況，通過對PKH26標記的人臍帶間充質干細胞進行傳代培養(yǎng)發(fā)現每次傳代后細胞熒光會逐漸衰減，但體外標記一次熒光可維持至20 d左右。這為干細胞的體內示蹤研究提供了依據，研究者可通過活體熒光機追蹤或者熒光顯微鏡下觀察熒光信號的分布，再結合相應的組織免疫熒光進行進一步分析。