王丹丹，劉光輝，趙鈺瑋，張 健

新生兒缺氧性疾病是圍生期最常見的疾病之一，氧療能夠糾正低氧血癥和高碳酸血癥，維持良好的呼吸功能，是治療新生兒缺氧性疾病的重要措施。但目前證實高濃度氧氣可能會引起視網(wǎng)膜病變[1]和慢性肺部疾病[2]，越來越多的實驗數(shù)據(jù)表明，高氧可能引起或加重新生兒腦損傷，增加神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率[3]。谷氨酸(glutamate，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，過多的Glu通過激活谷氨酸受體引起興奮性毒性作用，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的損傷[4]。該研究擬對新生6 d大鼠給予暴露80%高濃度氧，建立新生大鼠高氧模型，以研究高氧狀態(tài)下腦組織內(nèi)Glu及其轉(zhuǎn)運體的變化，探討使用高濃度氧氣后神經(jīng)系統(tǒng)中Glu的代謝機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑

1.1.1實驗材料 清潔級健康新生6 d大鼠19 只，雄雌不限，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。高氧箱(美國BioSpherix公司，型號Ltd.P.O.Box279)；Glu及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)檢測試劑盒(南京翼飛雪生物科技公司)；GLAST、GLT-1、EAAC1、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2一抗(英國Abcam公司)；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京康為世紀生物科技有限公司)。

1.1.2新生大鼠高氧模型制備及分組 將新生6 d清潔級健康新生大鼠19只隨機分為高氧組和對照組，高氧組10 只，對照組9 只。高氧組與哺乳母鼠共置于高氧箱中24 h，持續(xù)通入100%醫(yī)用氧氣，并用數(shù)字測氧儀持續(xù)檢測箱內(nèi)氧氣濃度，維持箱內(nèi)氧氣濃度始終≥80%，對照組與哺乳母鼠置于同室空氣中飼養(yǎng)。造模結(jié)束后，分別取高氧組5 只和對照組4 只新生大鼠行ELISA實驗檢測兩組大鼠腦組織Glu/GABA比值變化；兩組剩余各5 只新生大鼠行Western blot法檢測兩組大鼠腦組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表達變化情況。

1.2方法

1.2.1標本采集及處理 將新生7 d大鼠用10%水合氯醛2.0 ml/只麻醉后，隨機取高氧組5 只、對照組4 只剪開大鼠右心耳，然后在大鼠左心室緩慢灌注磷酸鹽緩沖溶液(PBS)用于排出全身血液，然后迅速斷頭取腦，轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于Glu及GABA蛋白含量的檢測；另隨機取5 只迅速斷頭取腦，轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的檢測。

1.2.2Glu及GABA蛋白含量 取出凍存腦組織，稱取100 mg移入玻璃勻漿器，加入預冷的PBS，冰上充分研磨，將制備好的勻漿液以12 000 r/min離心5 min，收集上清液，采用ELISA法測定Glu及GABA的蛋白含量，嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達 使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸化抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白。吸取適量蛋白上樣至12%聚丙烯酰胺凝膠，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。一抗孵育過夜，適當濃度的二抗孵育1 h。添加ECL化學發(fā)光顯影液后曝光，掃描儀采集圖像，Quantity Oner軟件分析條帶灰度值，計算目標蛋白與內(nèi)參蛋白的比值。一抗為EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2，β-actin為蛋白內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠腦組織Glu/GABA比值變化高氧組腦組織內(nèi)Glu/GABA的比值2.69(2.43,3.08)較對照組1.06(0.57,2.03)明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.205，P=0.032)。

2.2兩組大鼠腦組織的谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白含量變化Western blot法檢測兩組腦組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表達變化情況。與對照組比較，谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2的蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.206、2.785、2.892、2.611，P=0.000 8、0.023 7、0.020 1、0.031 1),而EAAT1、GLUT3和VGLUT1的蛋白表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 Western blot法測定腦組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表達

A：EAAT1/β-actin;B:EAAT2/β-actin;C:EAAT3/β-actin;D:GLUT1/β-actin; E:GLUT3/β-actin;F:VGLUT1/β-actin;G:VGLUT2/β-actin;與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

3 討論

Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與機體正常情況下一系列的生理活動。在生理情況下，Glu的合成、分解、攝取和重吸收處于動態(tài)平衡中[5]。而在缺血、缺氧等病理情況下，Glu的攝取及轉(zhuǎn)運會發(fā)生障礙，引起Glu的堆積，而突觸間隙中的Glu的大量堆積會導致神經(jīng)元的毒性作用，最終可能導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡或壞死[6]，造成一定程度的腦損傷。Glu維持在神經(jīng)元細胞外的低濃度主要依賴于谷氨酸轉(zhuǎn)運體，Glu通過谷氨酸轉(zhuǎn)運體進入到神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，從而保護神經(jīng)元，避免興奮性毒性對神經(jīng)元的損傷作用[7]。另外有研究[8]表明，高氧會導致神經(jīng)元細胞外Glu濃度增高，可能是高氧導致腦損傷的機制之一。

在未成熟腦內(nèi)，興奮性氨基酸的過度釋放，會造成腦損傷。Glu和GABA是腦內(nèi)主要的興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在生理情況下，兩者保持動態(tài)平衡，Glu/GABA體現(xiàn)了兩者之間的動態(tài)平衡關系。Glu作為主要的興奮性氨基酸，在突觸間隙內(nèi)大量積聚，會導致NMDA受體過度激活，受體門控型離子通道開放，Ga2+、Na+大量內(nèi)流，K+外流，鈉水滁留，導致神經(jīng)元的急性腫脹、壞死。離子通道的大量開放使細胞內(nèi)Ga2+的濃度持續(xù)增高，造成細胞內(nèi)鈣超載:Ga2+可激活細胞內(nèi)一系列酶，包括蛋白激酶C、一氧化氮合酶、磷脂酶等,這一系列酶的激活導致了神經(jīng)元內(nèi)自由基增多、神經(jīng)元膜磷脂降解、神經(jīng)元骨架破壞，使神經(jīng)元凋亡或者壞死。本研究顯示，新生6 d的大鼠在高氧暴露24 h后，Glu/GABA的比值明顯升高，說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性氨基酸與抑制性氨基酸之間的動態(tài)平衡關系被打破，興奮性氨基酸在突觸間隙內(nèi)大量積聚，NMDA受體過度激活，興奮性毒性作用造成神經(jīng)元的凋亡、壞死。且有研究[9]顯示，Glu/GABA的比值越高，興奮性毒性對神經(jīng)元的損傷越重。本研究顯示高氧后Glu/GABA的比值明顯升高，可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元造成了損傷作用。

谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達降低，導致了Glu在突觸間隙中的堆積。EAAT1、EAAT2、EAAT3是高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體，主要表達于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞膜上，是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Glu濃度的主要轉(zhuǎn)運蛋白，成人腦組織中約有90%的Glu轉(zhuǎn)運都依賴于EAAT2來完成[10]。GLUT1、GLUT3是腦型葡萄糖轉(zhuǎn)運體，主要是將葡萄糖跨血腦屏障轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元內(nèi)[11]，且葡萄糖通過GLUT1和GLUT3跨過細胞膜是易化擴散的過程。VGLUT1、VGLUT2是低親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體，主要分布于囊泡膜上，能夠特異地將神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運進入突觸囊泡內(nèi)[12]。每個囊泡中轉(zhuǎn)運體蛋白的數(shù)量和囊泡外谷氨酸濃度決定了Glu進入囊泡的流速，影響著囊泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的最高水平[13]。本實驗檢測了兩組新生大鼠腦組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表達水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組比較，高氧組EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義；而高氧組EAAT1、GLUT3和VGLUT1與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。這個結(jié)果說明新生大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運體在高氧中轉(zhuǎn)運谷氨酸的能力降低，且隨著氧氣濃度的增加，谷氨酸轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運Glu的能力越低，腦損傷越嚴重[14]。同樣有研究[8,15]表明，高氧后或者是在Glu堆積的情況下，谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1、EAAT2、EAAT3、GLUT1、GLUT3、VGLUT1和VGLUT2的蛋白表達水平會降低。

本實驗顯示，高氧組新生大鼠腦組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2、EAAT3、GLUT1和VGLUT2的蛋白表達水平均降低，GLUT1表達的降低，減少了葡萄糖從血液跨過血腦屏障進入腦組織的數(shù)量，使腦組織處于缺乏能量的狀態(tài)；當新生大鼠在高氧中， EAAT2和EAAT3的表達降低，且EAAT2和EAAT3轉(zhuǎn)運谷氨酸是一個耗能的過程，使谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2和EAAT3轉(zhuǎn)運谷氨酸的能力愈發(fā)降低；在生理情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的Glu主要儲存于突觸前膜神經(jīng)元的囊泡內(nèi)， VGLUT2的表達降低，不能有效地將Glu儲存于突觸囊泡內(nèi)，加重了突觸間隙內(nèi)Glu的堆積，這與本研究顯示的高氧組Glu/GABA的比值升高相一致。

綜上所述，高氧可導致新生大鼠腦組織內(nèi)的Glu增高，其機制與轉(zhuǎn)運體EAAT2、EAAT3、GLUT1、VGLUT2的蛋白表達下降有關，Glu增加可能是高氧造成腦損傷的原因之一。