賀繼剛，韓金秀，撒亞蓮，嚴(yán) 丹，李貝貝

隨著醫(yī)學(xué)科技進(jìn)步，抗免疫排異藥物不斷更新，免疫基礎(chǔ)、臨床研究的進(jìn)展，器官移植已成為終末器官衰竭治療的手段之一。目前抑制免疫排異反應(yīng)主要有兩種方法：① 藥物抑制，包括嗎替麥考等；② 生物抑制法。目前認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)可以抑制器官排異反應(yīng)[1]。但因?yàn)锽MSCs的安全性一直以來(lái)未得到有效證實(shí)，其臨床應(yīng)用受到限制。吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO) 可在胎盤(pán)和淋巴組織中廣泛表達(dá)，是除肝臟外唯一能催化色氨酸循犬尿酸分解途徑代謝的催化限速酶，在哺乳動(dòng)物組織與細(xì)胞，尤其是胎盤(pán)和淋巴組織中廣泛表達(dá)。它能夠催化降解色氨酸有效促進(jìn)移植物存活[2]。課題組前期已經(jīng)證實(shí)過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs可以有效抑制免疫排異反應(yīng)[3]。外泌體(exosome)是直徑介于50～100 nm的囊泡，其是以出芽方式從細(xì)胞上產(chǎn)生的鱗片狀囊泡，它擁有多項(xiàng)生物功能，能使細(xì)胞在不必直接作用下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞遠(yuǎn)距離生物信息傳導(dǎo)，目前其已成為研究熱點(diǎn)[4]。該研究通過(guò)提取過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs分泌的exosome試圖證明外泌體在抑制免疫排異反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康4周齡SPF級(jí)Wistar及SD成年雄性大鼠各70只，購(gòu)自成都達(dá)碩科技實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2主要試劑和儀器大鼠液相芯片試劑盒TGFBMAG-64K-03及RECYTMAG-65K-07(美國(guó)密理博公司)；流式細(xì)胞儀BD Accuri C6 (美國(guó)BD公司)；小動(dòng)物活體成像儀(美國(guó)冷泉港公司)；心臟彩超EPIQ 7C(荷蘭飛利浦公司)；抗OX62大鼠色疫磁珠(德國(guó)美天旎公司)。其它試劑見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。

1.3方法

1.3.1大鼠BMSCs培養(yǎng)及鑒定 全骨髓培養(yǎng)，胰酶消化傳代至第7代。取生長(zhǎng)至P7代BMSCs，并檢測(cè)細(xì)胞黏附分子29(CD29)、細(xì)胞歸巢因子-44(CD44)、CD90、CD73、CD45、CD11b、造血干祖細(xì)胞表面抗原(CD34)。

1.3.2過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs構(gòu)建 利用慢病毒GV308構(gòu)建IDO載體并使用強(qiáng)力霉素作為基因開(kāi)啟劑實(shí)現(xiàn)大鼠BMSCs過(guò)表達(dá)IDO，分兩組：陰性對(duì)照組(NC組)，過(guò)表達(dá)IDO組(OE組)，每組包含3組細(xì)胞。而后根據(jù)文獻(xiàn)[4]采用定量PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染2 d后IDO基因表達(dá)量。

1.3.3建立腹腔異位心臟移植模型 根據(jù)文獻(xiàn)[5]建立腹腔異位心臟移植模型。并采用心臟彩超EPIQ 7C評(píng)估建模3 d后移植心臟射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)、短軸縮短率(fractional shortening,FS)改變。

1.3.4Exosome提取及檢測(cè) 按照SBI公司ExoQuick-TC說(shuō)明書(shū)提取exosome并利用電鏡檢測(cè)分泌出的exosome形態(tài)[6]。

1.3.5心臟彩超評(píng)估移植心臟心功能和小動(dòng)物活體成像評(píng)估心臟熒光強(qiáng)度 提取各組細(xì)胞分泌的exosome。經(jīng)Dir預(yù)染后。經(jīng)尾靜脈注射到腹腔異位移植心臟術(shù)后3 d的大鼠模型中。共分為過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組、空載體-BMSCs-exosome組、BMSCs-exosome組，每組3只大鼠，每只大鼠經(jīng)由尾靜脈注射400 μl(800 mg/ml)的exosome，將嗎替麥考組(給予嗎替麥考喂養(yǎng)2 d)及未處理組做為對(duì)照組，每組3只大鼠。并采用二維心臟超聲評(píng)估移植心臟心功能和采用小動(dòng)物活體成像評(píng)估移植心臟熒光強(qiáng)度。

1.3.6受體大鼠脾臟細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)檢測(cè) 取受體大鼠完整脾臟組織，制備脾臟單細(xì)胞懸液。按Miltenyi公司的Anti-DC(OX62) Microbeads rat試劑盒說(shuō)明書(shū)操作陽(yáng)選OX62+細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62的表達(dá)。同時(shí)對(duì)陰選OX62-細(xì)胞檢測(cè)CD3、CD4、CD8表達(dá)及Treg細(xì)胞數(shù)量。

1.3.7移植心臟石蠟包埋切片與蘇木精-伊紅(HE)染色 取移植心臟組織進(jìn)行脫水，浸蠟，包埋，連續(xù)切片，伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心臟顯色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1大鼠BMSCs鑒定結(jié)果超過(guò)90%大鼠BMSCs可以表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD73。但不表達(dá)CD45、CD11b、CD34。

2.2RT-PCR檢測(cè)IDO基因的表達(dá)結(jié)果定量PCR結(jié)果顯示，大鼠BMSCs中，OE組IDO基因表達(dá)豐度為NC組的62 906.27倍(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs中并加入基因開(kāi)啟劑DOX 2 d后IDO基因的表達(dá)與NC組比較：*P<0.05

2.3心臟彩超評(píng)價(jià)移植心臟可見(jiàn)腹腔異位心臟移植模型建立3 d，移植心臟仍然跳動(dòng)，局部形成血栓，見(jiàn)圖2。

圖2 腹腔異位移植心臟3 d后復(fù)查心臟彩超結(jié)果黃色箭頭指向的是形成的血栓；紅色箭頭指向的是移植心臟

2.4掃描電鏡檢測(cè)exosome結(jié)果可見(jiàn)BMSCs分泌出的exosome表現(xiàn)為白色，大小為介于50～100 nm的顆粒。見(jiàn)圖3。

圖3 ExoQuick-TC法提取exosome電鏡圖片 ×4 500

2.5心臟彩超評(píng)估注射exosome后移植心臟心功能異位腹腔移植心臟模型建立3 d后，通過(guò)受體大鼠尾靜脈注射各種BMSCs分泌的exosome，采用心臟彩超評(píng)估移植心臟心功能改變，可見(jiàn)給予過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs分泌的exosome處理后2 d，移植心臟的EF、FS均有顯著提高，與其余各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.6采用小動(dòng)物活體成像評(píng)估注射exosome后移植心臟熒光強(qiáng)度大鼠心臟移植模型建立3 d后給予受體大鼠注射過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome、空載體-BMSCs-exosome、BMSCs-exosome后2 d完成小動(dòng)物活體成像，將嗎替麥考組及未處理組做為對(duì)照組。可見(jiàn)過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組移植心臟局部熒光強(qiáng)度與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

2.7流式細(xì)胞技術(shù)評(píng)估注射exosome后受體大鼠脾臟細(xì)胞表面抗原分子過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA、CD45RA+CD45RB表達(dá)量最低，與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組CD274表達(dá)量最高，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組Treg細(xì)胞量最高，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

將上述CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、Treg表達(dá)行單因素方差分析：CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB的表達(dá)及Treg細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖4 給予干預(yù)措施2 d后評(píng)價(jià)移植心臟局部熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)1.過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組；2.空載體-BMSCs-exosome組；3.BMSCs-exosome組；4.嗎替麥考組；5.未處理組；與空載體-BMSCs-exosome組比較：***P<0.001；與BMSCs-exosome組比較：###P<0.001；與嗎替麥考組比較：▽▽▽P<0.001；與未處理組比較：△△△P<0.001

表1 給予exosome處理2 d后移植心臟功能評(píng)價(jià)

與空載體組比較：*P<0.05；與BMSCs組比較：#P<0.05；與嗎替麥考組比較：▽P<0.05；與建模未處理組比較：△P<0.05

圖5 給予干預(yù)措施2 d后流式檢測(cè)脾臟細(xì)胞抗原分子表達(dá)與空載體-BMSCs-exosome組比較：*P<0.05；與BMSCs-exosome組比較：#P<0.05；與嗎替麥考組比較：▽P<0.05；與未處理組比較：△P<0.05；與正常組比較：▼P<0.05

圖6 HE染色評(píng)估移植心臟炎性細(xì)胞侵襲結(jié)果 ×400A：過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組；B：空載體-BMSCs-exosome組；C：BMSCs-exosome組；D：?jiǎn)崽纣溈冀M；E：未處理組；F：正常組

2.8移植心臟蘇木素-伊紅染色結(jié)果未處理組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)心肌數(shù)量高于其余各組，而過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome處理組炎性細(xì)胞數(shù)量少于其它各組。見(jiàn)圖6。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以調(diào)節(jié)免疫排異反應(yīng)，目前研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)以下途徑完成：① MSCs不表達(dá)主要組織相容性抗原-Ⅱ及細(xì)胞表面免疫協(xié)同分子，但可持續(xù)不斷表達(dá)低水平MHC-Ⅰ分子。② MSCs可抑制B、T淋巴細(xì)胞的增生和激活。也能通過(guò)細(xì)胞因子(如：IL-6、M-CSF)影響樹(shù)突狀細(xì)胞的功能及成熟。③ MSCs也能分泌抗炎因子和改變損傷組織處免疫細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)，從而保護(hù)炎癥處組織免除排異反應(yīng)損傷[7]。

IDO可通過(guò)三條主要途徑實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)：① IDO能分解色氨酸并產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物犬尿氨酸，而淋巴細(xì)胞通過(guò)攝取犬尿氨酸使細(xì)胞進(jìn)入G1期促進(jìn)細(xì)胞凋亡；② IDO通過(guò)消耗色氨酸激活免疫細(xì)胞中抑制免疫敏感轉(zhuǎn)錄信號(hào)途徑[8]；③ IDO也可通過(guò)在DCs上直接表達(dá)出IDO做為細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)分子[9]。IDO的功能可不依賴(lài)IDO酶活性。通過(guò)IDO與Src原癌基因抗體同族第二域(SHP-1/SHP-2)與磷酸酯酶(phosphatase)互相接觸，激活I(lǐng)DO中免疫調(diào)節(jié)區(qū)域而發(fā)揮抗免疫排異作用。IDO-SHP復(fù)合體是轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)發(fā)揮對(duì)血漿樹(shù)突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫排異的關(guān)鍵因素[10]。

前期研究[4]證實(shí)過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs可以有效抑制免疫排異反應(yīng)。但經(jīng)過(guò)基因改造的BMSCs應(yīng)用于臨床仍然遙遙無(wú)期。因而我們將目光聚焦于外泌體。exosome是一種大小介于50～100 nm囊泡，其內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)及RNA。早期認(rèn)為其是一種細(xì)胞代謝產(chǎn)物，細(xì)胞可以以外泌體的形式扔掉自身不需要的蛋白和RNA,exosome可以通過(guò)在細(xì)胞與細(xì)胞不直接接觸下遠(yuǎn)距離進(jìn)行細(xì)胞間生物信號(hào)傳導(dǎo)包括免疫信號(hào)傳導(dǎo)[11]。研究[12]顯示當(dāng)細(xì)胞暴露于一種應(yīng)激條件下能夠改變與免疫有關(guān)的miRNA，同時(shí)也證實(shí)，exosome中有HSP72和miRNA的表達(dá)。Wang et al[13]報(bào)道外泌體中富含的miRNA能夠與mRNA 5’端連接，從而抑制目標(biāo)基因表達(dá)。因此，一條miRNA可以與多條mRNA相互作用從而抑制免疫蛋白表達(dá)。本研究也證實(shí)免疫細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)發(fā)生改變。

研究采用二維心臟超聲檢測(cè)，可見(jiàn)過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組移植心臟EF、FS較其他各組有顯著提高；小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)移植心臟局部熒光強(qiáng)度，可見(jiàn)過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組中移植心臟具有更強(qiáng)熒光強(qiáng)度；流式細(xì)胞檢測(cè)免疫細(xì)胞表面抗原分子改變，可見(jiàn)過(guò)表達(dá)IDO-BMSCs-exosome組受體大鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD40、CD86、CD80、主要組織相容性抗原II、CD45RA、CD45RA+CD45RB表達(dá)降低，而CD274(PDL-1)表達(dá)增高。Treg細(xì)胞的數(shù)量增多。HE染色檢測(cè)移植心臟局部淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少。