蔡大偉 朱司祺 胡松梅 田亞岐 孫洋 陳曦 周慧

（1.吉林大學邊疆考古研究中心；2.陜西省考古研究院；3.山東省石刻藝術博物館；4.吉林市博物館）

馬的馴化是歐亞草原游牧文明興起、繁榮的關鍵，深刻地影響著人類社會的發(fā)展進程。在中國，家馬和馬車是商代晚期突然大量出現(xiàn)的，然而晚商之前有關馬的考古材料非常少。早期馴化階段的缺失和商代晚期家馬的“突然”出現(xiàn)，使中國家馬的起源引起了廣泛的爭論。一些學者認為中國家馬是從中亞草原地帶傳入的，甘青地區(qū)和北方草原地帶可能是其進入中國的主要通道[1,2]。也有學者認為中國家馬是由本土的普氏野馬馴化而來[3,4]，在馴化時間上存在“新石器時代中期”[5]、“龍山時期”[6]、“夏末商初”[7]等看法。近年來的古DNA研究顯示中國古代馬既有本地馴化的因素，也受到外來家馬基因流的影響，歐亞草原很可能是家馬及馴化技術由西向東傳播進入中國的一個主要路線。但是，由于缺乏西北地區(qū)家馬的DNA數(shù)據(jù)，家馬在中國的擴散路線尚不清楚。

秦公一號大墓位于鳳翔縣城南雍水河北岸平地上，于1976～1986年先后發(fā)掘十年。大墓規(guī)模龐大，遠遠超過先秦諸侯的墓葬，是中國發(fā)掘的最大的先秦墓葬。根據(jù)墓葬中出土的石磬上的銘文，考古學家推斷秦公一號大墓的墓主人為秦景公（？～前537年）。墓葬展

示了春秋晚期秦國的強大，隨葬物品豐富，墓葬規(guī)格很高，出土的黃腸題湊是周秦時代規(guī)格最高的葬具，并有183人的人殉[8]。2007年，陜西省考古研究院人員在秦公一號大墓西南側發(fā)現(xiàn)車馬坑，坑為東西向長方形豎穴，東西長17.5、南北寬3.1米，坑內(nèi)底部自東向西依次擺設了5組車馬，考古人員根據(jù)其有車無輪的情況，推斷其為正式陪葬坑之外的一個祭祀坑。這批車馬坑的出土，一方面對于我們了解先秦車制、車馬殉葬制度及祭祀制度諸多問題具有重要意義；另一方面，殉葬的馬匹對我們探索中國家馬的起源具有重要意義。本研究希望利用古DNA技術重建古馬的遺傳結構，通過對比分析，揭示陜西地區(qū)古代馬與其他地區(qū)古代馬之間的遺傳關系，為研究家馬在中國的擴散提供有價值的線索。

表一 秦公一號大墓取樣及樣本保存情況

表二 本研究所用擴增引物

一、材料和方法

1. 樣本來源及保存狀況

本研究樣品來自2007年7月至11月發(fā)掘的陜西鳳翔秦公一號大墓1號祭祀坑?？拥讝|西向依次擺設5組車（自東向西依次編號1～5號車），每組車前分別有挽馬工具。我們對每匹馬的門齒進行了采樣，進行古DNA分析（表一）。

2. 古代樣本處理

首先用毛刷除去樣本表面污垢，接著用電動打磨工具去除表層1～2 mm，然后用10%次氯酸溶液浸泡古代材料5～10min，在紫外線照射下晾干，隨后將樣品放入液氮冷凍粉碎 機 FREEZER/MILL6750（SPEXP CetriPrep，USA）之中，液氮冷卻，打磨成粉，－20℃冷凍保存。

3. 古DNA提取、擴增和測序

古DNA提取參照楊東亞等人的文獻進行[9]。

PCR擴增：依據(jù)馬的參考序列X79547[10]設計兩對套疊引物，擴增349bp (核苷酸位置15424—15772) 線粒體DNA片段（表二）。擴 增 反 應 均 在 Mastercycler? personal 熱 循 環(huán)儀 (Eppendorf，Germany） 上 進 行。50 μL反應體系中含 2.5 mM Mg2+，1X Buffer，0.2 mMdNTPs， 0.5 μM 正反引物，1U Taq 酶，2 μL模版。程序如下：95℃ 5 min，92℃ 1 min變性，50-55℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min，36個循環(huán)后，72℃ 延伸10 min，4℃保持。

測序：PCR擴增產(chǎn)物通過2% 瓊脂糖(Biowest，German)凝膠電泳檢測，使用QIAEX?Ⅱ GEL Extraction Kit 凝膠回收試劑盒(QIAGen，Germany) 純化PCR產(chǎn)物。純化產(chǎn)物用ABI PRISM? 310全 自 動 遺 傳 分 析 儀（Applied Biosystems，USA）通過Dyeprimer試劑盒進行正反雙向直接測序。

4. 污染的防止

所有實驗都是在專門的古DNA實驗室中完成。PCR前和PCR后實驗操作分別在兩個相距很遠的、獨立的實驗樓中進行。每次實驗前，實驗室都要經(jīng)過紫外線長時間照射，對超凈臺進行紫外線照射和通風至少30min，并隨時用DNA 去除劑擦拭。進行實驗時，實驗人員穿著雙層防護服，戴一次性帽子、口罩、雙層手套，使用高壓滅菌的一次性實驗耗材。通過設置DNA抽提和PCR擴增空白對照，來判斷實驗步驟和實驗試劑是否有污染。最后，對于同一個實驗樣本，不同實驗人員要進行多次DNA抽提和PCR擴增重復操作，確保實驗結果的準確性。

二、結果和分析

1. 秦公一號墓古代馬DNA序列和世系歸屬

在秦公一號大墓出土的10個樣本中，F(xiàn)X3、FX8、FX10未能成功提取DNA，其余7個樣本均成功提取DNA并獲得可靠的古DNA序列。其中FX4、FX5 成功獲得349bp序列，F(xiàn)X1、FX2、FX6、FX7、FX9成功獲得201bp序列（表三）。與參考序列X79547相比共檢測出22個變異位點，所有堿基變異位點全部是轉(zhuǎn)換，無顛換，無插入發(fā)生（表四）。

表三 秦公一號墓古代馬實驗結果

表四 秦公一號墓古代馬DNA序列和世系歸屬

線粒體DNA被廣泛應用于家馬的起源研究中, Jansen[11]等將現(xiàn)代家馬劃分為7個線粒體DNA世系A—G，其中幾個較大的世系可以進一步劃分為多個亞組，世系A共有7個亞組A1—A7，世系B和C各有2個亞組B1—B2和C1—C2，世系F和D各有3個亞組F1—F3和D1—D3。根據(jù)變異位點分析，F(xiàn)X1和FX2分別屬于D1和D2亞組，F(xiàn)X4屬于A1亞組，F(xiàn)X5屬于B2亞組（表四）。由于缺乏后段的信息，推測FX6、FX7、FX9屬于A世系，具體的亞組信息需要進一步的實驗來補全序列驗證。

2. 秦公一號大墓古代馬與現(xiàn)代馬的遺傳關系

為了追蹤秦公一號大墓古代馬與現(xiàn)代家馬的遺傳關系，我們利用BLAST程序在美國國家生物技術信息中心(NCBI) 的DNA序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）中進行共享序列搜索，即搜尋與這些古代序列完全匹配的共享序列。FX1、FX4、FX5、FX6、FX9在GenBank中搜索到了完全相同的共享序列，而FX2和FX7沒有搜索到完全一致的共享序列。圖一顯示了古代馬的共享序列在世界各地的分布情況，F(xiàn)X1主要分布在歐洲，尤其是伊比利亞半島，在東亞等地有少量分布。FX4主要分布在西南西伯利亞、中亞和東亞。FX5所共享的單倍型數(shù)量較少，主要分布在中東、中亞、北亞和東亞。FX6在歐亞大陸分布最為廣泛，在歐洲、阿拉伯半島、中亞、北亞和東亞均有分布，表明FX6是現(xiàn)代家馬的主要基因型。FX9主要分布在中亞、北亞和東亞地區(qū)。

3. 秦公一號大墓古代馬序列在中國古代遺址中的分布情況

為了探索秦公一號墓古代馬與其他地區(qū)古代馬的關系，我們調(diào)查了秦公一號墓古代馬在中國13個古代遺址[12～17]中的分布情況（圖二、表五）。基于考古發(fā)掘資料分析，這些遺址的年代不盡相同。首先，大山前遺址的時代最早，屬于中國北方青銅時代早期夏家店下層文化（年代距今2000～1500 BC）。其次是西周時期（年代距今1046～771 BC）的陜西少陵原遺址和棗樹溝腦遺址，以及青海卡約文化（年代距今1000～800 BC）豐臺遺址。最后，所有其他的遺址都屬于春秋戰(zhàn)國時期，年代距今500 BC。FX1、FX2、FX7在其他古代遺址中均無發(fā)現(xiàn)，為秦公一號大墓古代馬所獨有的單倍型。FX4、FX5、FX6和FX9在其他古代遺址中有分布，其中FX6序列分布最廣泛，在豐臺遺址、忻州窯子墓地、小雙古城墓地以及毛園民宅均有分布；其次是FX4和FX9在棗樹溝腦、忻州窯子墓地、新店子墓地均有發(fā)現(xiàn)；而FX5則僅出現(xiàn)在棗樹溝腦遺址和于家莊墓地中。從時間上看，秦公一號大墓部分古代馬在西周時期就已經(jīng)在西北地區(qū)，并在春秋戰(zhàn)國之際出現(xiàn)在寧夏、內(nèi)蒙古地區(qū)，這一結果一方面反映了古代馬的基因連續(xù)性，另一方面反映了不同地區(qū)的馬群存在廣泛的交流，可能與地區(qū)間的人群文化貿(mào)易交流活動有關。

圖一 秦公一號大墓樣本共享序列在世界分布圖

圖二 本研究涉及的考古遺址的地理位置分布圖

表五 秦公一號墓古代馬在13個古代遺址中的分布

三、討論

1. 秦公一號大墓古代馬的母系來源

考古和基因證據(jù)表明，家馬是在距今5500年前在中亞草原被馴化的[18,19]，但是家馬和馬車從商代晚期才開始在中國大量出現(xiàn)，而且從馬車的構造看，中國馬車與西方馬車在形制上基本相同，很可能與馴化的家馬同時從西方傳入[20]，連接東西方的歐亞草原通道和經(jīng)由新疆及河西走廊的綠洲之路是家馬進入中國兩條主要傳播路線。在所獲得的7個古代馬DNA序列中，F(xiàn)X1屬于D1亞組，而FX2屬于D2亞組。世系D1亞組的建立者最早出現(xiàn)在南西伯利亞阿勒泰地區(qū)（900BC）[15]，稍晚的時候在內(nèi)蒙古涼城縣忻州窯子墓地（500BC）[14]和哈薩克斯坦Berel遺址（300BC）[21]出現(xiàn)。世系D2亞組的建立者最早出現(xiàn)在青銅時代中歐摩爾多瓦Miciurin遺址（1500～1000 BC），在鐵器時代出現(xiàn)在圖瓦（619～609 BC）、 蒙古（400～300 BC）[15]。FX5屬于世系B2亞組，該組的建立者最早也是出現(xiàn)在Miciurin遺址，稍晚的時候在寧夏于家莊墓地以及哈薩克斯坦Berel遺址也曾出現(xiàn)。從D1、D2和B2的出現(xiàn)時間和地點看，有一個明顯的由西向東傳播的趨勢，考慮到中亞草原是家馬的起源中心，我們的研究表明秦公一號大墓部分古代馬的母系來自歐亞大陸西部，西北地區(qū)是家馬進入中國的一條重要通道。

2. 秦與北方游牧民族的交流

春秋時期，秦與戎狄之間存在廣泛的貿(mào)易交流活動，例如在關中地區(qū)可以見到狄人遺存中非常有代表性的器物——虎飾牌、虎形銅器、花格劍與銅釜[22]。田亞岐指出東周時期關中秦墓也受到了戎狄文化因素的影響，體現(xiàn)了秦與戎狄文化的相互影響和交融[23]。出于戰(zhàn)爭的需要，馬成為最重要的家畜。秦國的地理位置使其可以很容易的從鄰近的游牧民族那里引進優(yōu)良的馬匹。秦人與北方游牧人群的關系可以從其飼養(yǎng)的馬匹可窺一斑。FX4、FX6和FX9在春秋戰(zhàn)國時期出現(xiàn)在內(nèi)蒙古忻州窯子、小雙古城、新店墓地。這三個墓地都位于北方農(nóng)牧交錯帶上，普遍流行用牛、馬、羊殉牲，呈現(xiàn)典型的游牧人群特征。古代馬FX5出現(xiàn)在寧夏于家莊墓地，該墓地也是游牧人群墓地。無論是與鳳翔臨近的寧夏地區(qū)，還是遙遠的內(nèi)蒙古地區(qū)都飼養(yǎng)相同的馬，表明秦人與北方游牧人群存在廣泛的貿(mào)易交流活動，同時也反映出古人在遺傳育種上強烈的選擇性。

圖三 中國古代馬序列在土庫曼阿哈爾捷金馬中的分布圖

3. 汗血寶馬引入時間的探討

張騫出使西域時，在大宛國（今費爾干納盆地）發(fā)現(xiàn)了汗血馬，歸來時說：“西域多善馬，馬汗血，其先天馬子也”。目前的科學研究表明，傳說中的“汗血寶馬”，實際上就是土庫曼斯坦特產(chǎn)的“阿哈爾捷金馬（Turkoman Akhal-teke）”。 許多世界著名的馬種如純血馬、阿拉伯馬、特雷克納馬都有阿哈爾捷金馬的血統(tǒng)。汗血馬作為一種珍貴、優(yōu)良的馬種，必定是古人重要的貿(mào)易對象，而秦國優(yōu)越的地理位置使其很容易與游牧人群進行馬匹的貿(mào)易交流，作為強大的秦國君主的陪葬車馬坑，一定會選擇最好的良馬殉葬，因此能否在秦公一號大墓中發(fā)現(xiàn)汗血馬的蹤跡是我們關注的焦點問題。在共享序列搜索中，我們發(fā)現(xiàn)FX5的共享序列較少，主要是中亞馬、阿拉伯馬、北亞蒙古馬和中國馬。值得注意的是，F(xiàn)X5與兩個現(xiàn)代土庫曼阿哈爾捷金馬序列（DQ327958、EU093049）完全相同。FX4的共享序列主要集中在西南西伯利亞和中亞，其中也兩個阿哈爾捷金馬序列（DQ327950、EU093051）這種情況引起了我們的注意，為了揭示中國古代馬與阿哈爾捷金馬的母系遺傳關系，我們選擇了現(xiàn)代土庫曼阿哈爾捷金馬的序列DQ327950–DQ327967，GQ119632-GQ119636，EU093045-EU093063作為對比，進行了中介網(wǎng)絡分析（圖三）。中介網(wǎng)絡圖顯示西周時期陜西棗樹溝腦和青海豐臺遺址，以及春秋戰(zhàn)國時期寧夏于家莊、內(nèi)蒙古新店子、忻州窯子、小雙古城、井溝子的古代馬都與土庫曼阿哈爾捷金馬有關系，這表明汗血馬的基因型很早就已經(jīng)出現(xiàn)在西北地區(qū)，這遠遠早于漢代張騫出使西域的時間，這進一步驗證了早在漢代之前，我國與西方就已經(jīng)有了經(jīng)濟文化交流。

值得注意的是，中國古代馬的基因型也出現(xiàn)在其他品種的家馬之中，盡管這可能與古代先民培育馬種的過程中選擇良馬有關，但中國古代馬與汗血馬的關系還需要進一步的研究，今后的古DNA全基因組研究有望為我們更清晰地揭示出中國古代馬與汗血馬的關系。

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