蒙正群， 周麗軍， 羅怡琳， 冷依伊， 張鵬飛， 王 印, 2， 姚學(xué)萍， 耿 毅， 楊澤曉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130； 2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 溫江 611130)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種急性、高度傳染性和致死性兔疾病。RHDV感染兔后主要以呼吸系統(tǒng)出血、實(shí)質(zhì)器官淤血水腫、肝臟壞死、淤血及出血性變化為主要特征[1-2]。在流行初期，因?yàn)槠鋫鞑タ臁l(fā)病急、發(fā)病率及致死率高等特點(diǎn)，被稱為兔瘟。該病毒對(duì)于2月齡以上的兔子感染致死率極高。RHDV自1984年在江蘇省無錫市首次發(fā)現(xiàn)以來，在全國各省市迅速蔓延，同時(shí)在全世界范圍內(nèi)流行[3]。雖然RHDV基因序列較為保守，但是隨著時(shí)間的推移以及地域面積的擴(kuò)大，其基因組結(jié)構(gòu)一直處在緩慢變異中，自早期經(jīng)典RHDV(G1-G5)出現(xiàn)以來抗原變異株(RHDV a)、RHDVb相繼出現(xiàn)[4-7]。為了更好地對(duì)嵌杯狀病毒科兔病毒屬內(nèi)的相關(guān)病毒進(jìn)行分類，Le Pendu等[8]對(duì)RHD的幾種病毒進(jìn)行了重新命名，將RHDVa命名為GI.1a，經(jīng)典毒株中的G1命名為GI.1b，G2命名為GI.1c，G3～G5統(tǒng)一命名為GI.1d，RHDVb命名為GI.2。GI.2亞群病毒能夠感染歐洲野兔以及幼年兔，死亡率為5%～70%[9]。目前在中國未有GI.2的相關(guān)報(bào)道。

RHDV為單股正鏈RNA 兔嵌杯狀病毒，基因組全長約7.5 kb， 除全基因組RNA外，病毒還含有約2.2 kp的亞基因組[10]。RHDV的5′末端沒帽子結(jié)構(gòu)，經(jīng)共價(jià)結(jié)合VPg蛋白，3′末端有一個(gè)短的polyA尾巴，病毒基因組含2個(gè)開放閱讀框(ORF1和ORF2)，5′末端的ORF1從第10個(gè)核苷酸延伸至第7 041個(gè)核苷酸，約占整個(gè)基因的94%，編碼一個(gè)分子質(zhì)量約為 2.56×105的多聚蛋白。該多聚蛋白包括該病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白VP60，VP60蛋白與誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)，是新型診斷制劑、疫苗研制參考的重要部分[11-12]；同時(shí)VP60蛋白的編碼基因高度保守，為RHDV分離株分子流行病學(xué)調(diào)查的首選基因[13]。較短的閱讀框ORF2在3′末端編碼一個(gè)小結(jié)構(gòu)蛋白VP10，分子質(zhì)量約1.2×104。有研究結(jié)果表明VP10蛋白可顯著下調(diào)VP60的表達(dá)，調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制以及參與病毒粒子的釋放和侵染細(xì)胞的過程[14-15]。用大腸桿菌表達(dá)RHDV多聚蛋白內(nèi)不同區(qū)域的基因，并以這些表達(dá)產(chǎn)物所制備的一系列單抗來識(shí)別該多聚蛋白的酶解產(chǎn)物，經(jīng)放射免疫技術(shù)對(duì)VPg進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)ORF1的基因編碼的蛋白質(zhì)順序?yàn)镹H2-P16-P23-2C-P30-VPg-3C-3D-VP60-COOH，VP10編碼基因從ORF2 3′末端開始，起始于基因組的第7 025位核苷酸，至7 378位核苷酸為止，與ORF1有17個(gè)核苷酸重疊[16-17]。

本試驗(yàn)根據(jù)RHDV的基因順序，設(shè)計(jì)7對(duì)引物分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的2株RHDV的基因進(jìn)行RT-PCR，然后進(jìn)行克隆測(cè)序，使用軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接得到全基因堿基序列，并參考NCBI已登錄的RHDV毒株的VP60基因堿基序列、ORF2編碼基因堿基序列、全基因堿基序列對(duì)2株病毒進(jìn)行比對(duì)分析，旨在對(duì)RHDV的基因堿基序列的變異進(jìn)行監(jiān)測(cè)，豐富其流行病學(xué)資料，并對(duì)各基因序列比對(duì)方法進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料

2株RHDV SCH04、Sch07肝臟組織由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)大腸桿菌DH5α、EZNAOR Gel Extraction Kit、2×TaqPCR MasterMix、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)和膠回收試劑盒等購自天根生化科技北京有限公司，RNA提取相關(guān)的試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD19-T載體等購自寶生物(大連)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中RHDV的各基因堿基序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)7對(duì)引物(表1)，7對(duì)引物分別擴(kuò)增RHDV的P16、P13、2C-like NTPase、P29、VPg、3C-like 蛋白酶、3D-like 蛋白酶、VP60蛋白和VP10蛋白的編碼基因，且擴(kuò)增的基因堿基序列相互有部分重疊，覆蓋了病毒整個(gè)基因組。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 RHDV基因組RT-PCR擴(kuò)增

參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行RHDV RNA提取，用Reverse Transcription System試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，以表1中的引物進(jìn)行分段擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50.0 μl)：cDNA模板2.0 μl，2×TaqPCR MasterMix 25.0 μl，去離子水20.0 μl，上、下游引物各1.5 μl。PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用EZNAOR Gel Extraction Kit 試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物。

表1RHDV各基因片段擴(kuò)增引物序列

Table1Primersequencesforthegenesegmentsamplificationofrabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV)

基因引物名稱引物序列(5'→3')位置P16-23P1GTGAAAATTATGGCGGCTATGTCGCGC1～1 123P2TGGGGACGGAGTCCTCAAA2C-LP1AAGAGGTTGTTTGACAC1 087～2 239P2CAAAGTACTGTTTCCACATVPgP1AGTGAGCACCCCGACGTGGCCTC2 135～3 368P2CAGCCACTGCCATTGTGTCTCAT3C-LP1TATGACAATGACTATGAGGG3 316～3 778P2CAGAAGAAGTTTGATGTTTC3D-LP1CAAAGGGAGTTTATGAAAC3 746～5 316P2TTTGCCCTCCATAACATTCVP60P1TGTGAATGTTATGGAGGGCAAA5 308～7 044P2ACGCTGGCACCTGCAAGTCCCAVP10P1ACACTCGTGTTCAACCTGGGG6 994～7 437P2TTATAGCTTACTTTAAACTAT

1.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定

將PCR純化產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆菌，經(jīng)菌液PCR進(jìn)一步篩選驗(yàn)證陽性克隆。驗(yàn)證正確的每個(gè)片段至少送3個(gè)陽性克隆到3家公司(生工生物工程上海股份有限公司、成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司、華大基因科技有限公司)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列同源性和遺傳進(jìn)化分析

使用DNAStar中的MegAlign軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并登錄GenBank下載國內(nèi)外31株參考毒株(表2)，根據(jù)文獻(xiàn)[8]、[18]、[19]、[20]中兔出血癥病毒的分型方法，對(duì)參考毒株的相關(guān)序列進(jìn)行截取，使用MegAlign軟件對(duì)兩毒株的全基因組堿基序列、VP60基因堿基序列以及ORF2編碼基因堿基序列進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建進(jìn)化樹。

表2參考RHDV毒株信息

Table2InformationofreferenceRHDVstrains

毒株 登錄號(hào)地區(qū)年份毒株 登錄號(hào)地區(qū)年份BS89X87607意大利 2004RossiEF558584德國2007SDZ29514法國1993STR2012KF677011波蘭2004FRGM67473-1991GRZ2004KP144791波蘭2004AST/89Z49271西班牙-CD/ChinaAY523410中國吉林2004Eisenhutten-stadtEF558578德國2007JX/CHA/97DQ 205345西班牙1997-DQ189077巴林島2005IN-05EU003578美國2005PD1989KP144789波蘭1989WHNRHDQ280493中國2009DD06EF363035德國2007Iowa2000AF258618美國2000HYDJF412629中國哈爾濱2005Hokkaido/2002AB300693日本2002WikaEF558574德國2007CBEstoi13-7KM115680葡萄牙2013JenaEF558576德國2007CBCoruche14-2KM115698葡萄牙2014NZ61EF558580新西蘭2007Rij06-12KP129395西班牙2014MALKU882093波蘭 1994Tar06-12KP129397西班牙2014V351U54983澳大利亞19967-13_BarrancosKF442963葡萄牙2014NY-01EU003581美國2001Algarve1KF442961葡萄牙2013NJ-2009HM623309中國南京2004

2 結(jié)果與分析

2.1 RHDV SCH04株和Sch07株基因組的擴(kuò)增測(cè)序

2株RHDV經(jīng)常規(guī)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)后，電泳結(jié)果顯示2株RHDV擴(kuò)增出的分段基因片段大小與各基因預(yù)期片段大小一致(圖1、圖2)。將2毒株各基因擴(kuò)增片段分別克隆到pMD-19T載體中進(jìn)行測(cè)序，采用DNAStar的MegAlign 程序?qū)蚪M分段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接并上傳GenBank，SCH04株基因組全長7 439 bp(GenBank登錄號(hào)為KX844830)，Sch07株基因組全長7 438 bp(GenBank登錄號(hào)KY171748)。

M：DL2000 marker; 1：VP60; 2：3D-L; 3：VPg; 4：2C-L; 5：P16-P23; 6：3C-L; 7：VP10。圖1 RHDV SCH04 株基因的分段PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of RHDV SCH04 gene segments

M：DL2000 marker; 1：VP60; 2：3D-L; 3：VPg; 4：2C-L; 5：P16-P23; 6：3C-L; 7：VP10。圖2 RHDV Sch07 株基因的分段PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of RHDV Sch07 gene segments

2.2 2株RHDV各基因的同源性比較分析

2.2.1VP60核苷酸序列分析 將2株病毒的VP60基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示核苷酸及其編碼氨基酸同源性均為99.7%。SCH04、Sch07的VP60基因核苷酸序列與表2中的31株RHDVVP60基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示，SCH04、Sch07除了與6株GI.2病毒株同源性(79.1%～79.9%)稍低外，與其余的毒株同源性均在89.0%以上，這說明RHDV的衣殼蛋白基因核苷酸序列相當(dāng)保守。參比的33株RHDVVP60 基因有2個(gè)大分枝GI.1和GI.2，GI.1包括抗原變異株GI.1a以及經(jīng)典毒株(GI.1b～GI.1d)2個(gè)分枝，SCH04、Sch07同屬于抗原變異株GI.1a 分枝，且與日本株Hokkzido2002、美國株NY-01親緣關(guān)系很近，同屬于一個(gè)基因群；另一個(gè)為GI.2分枝，GI.2分枝的毒株2010年在歐洲國家暴發(fā)，分枝6株參考毒株均分離自2013-2014年，從進(jìn)化樹可以看出GI.2分枝內(nèi)毒株與經(jīng)典毒株以及抗原變異株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

*為測(cè)序毒株。圖3 基于VP60基因繪制的兩毒株與參考毒株的進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree of the two strains and the reference strains based on the VP60 genes

2.2.2 ORF2編碼基因核苷酸序列的比對(duì)分析 使用MegAlign軟件對(duì)33株RHDV的ORF2進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示2株RHDV的核苷酸、氨基酸同源性均為99.2%，SCH04與31株參考毒株核苷酸同源性為84.2%～96.9%，Sch07與31株毒株同源性為 84.7%～97.2%。進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖4)與以VP60基因核苷酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹稍有差異，ORF2基因進(jìn)化樹中經(jīng)典GI.1a RHDV毒株分為2個(gè)主要分枝，但是SCH04、Sch07兩毒株的遺傳距離還是最近，且與日本株Hokkzido2002、美國株NY-01同為一個(gè)基因群，這與以VP60基因構(gòu)建進(jìn)化樹的分析結(jié)果相同。

*為測(cè)序毒株。圖4 基于ORF2編碼基因繪制的兩毒株與參考毒株的進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the two strains and the reference strains based on the ORF2 encoding genes

2.2.3 全基因比對(duì)分析 使用MegAlign軟件進(jìn)行SCH04和Sch07毒株與31株參考RHDV毒株的序列分析，結(jié)果顯示SCH04與Sch07核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列同源性均為99.8%，與31株參考株的核苷酸序列同源性都在 78.3%～97.0%。SCH04、Sch07的全基因序列全長分別為7 439 bp、7 438 bp，與參考毒株相比，在病毒基因的末端非編碼區(qū)7 400 bp位置分別出現(xiàn)2個(gè)和1個(gè)腺嘌呤核苷酸的插入突變。全基因組進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖5)顯示，33株全基因核苷酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹與VP60核苷酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹分枝結(jié)構(gòu)差異較大，全基因核苷酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹有2個(gè)分枝，一個(gè)分枝由葡萄牙分離的4株GI.2毒株7-13_Barrancos、Algarve1、CBEstoi13-7和CBCoruche14-2組成，另一分枝包括3個(gè)支分枝，分別是經(jīng)典毒株(GI.1b～GI.1d)、抗原變異株GI.1a和2株西班牙分離的GI.2毒株Rij06-12和Tar06-12。大分枝GI.1a中由14株RHDV組成2個(gè)小分枝。經(jīng)典毒株由GI.1b、 GI.1c、 GI.1d組成2個(gè)大分枝。但是SCH04、Sch07受試RHDV毒株的遺傳進(jìn)化結(jié)果與以VP60和ORF2編碼基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建的進(jìn)化樹的分析結(jié)果一致。

*為測(cè)序毒株。圖5 RHDV全基因組分子進(jìn)化樹Fig.5 The phylogenetic tree of all full-sequenced RHDV strains

3 討 論

本研究采取分段擴(kuò)增測(cè)序方法進(jìn)行RHDV基因組擴(kuò)增。與常規(guī)測(cè)定RHDV全基因序列的方法[21]比較，本試驗(yàn)的方法可以更加方便地獲取RHDV的全基因，測(cè)序的片段小，測(cè)序結(jié)果更加準(zhǔn)確，不僅可以達(dá)到RHDV全基因組核苷酸序列測(cè)定目的，同時(shí)對(duì)于RHDV 3D、3C樣蛋白質(zhì)等的分析研究工作可直接提供具體基因片段[22-24]。我們通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的2株RHDV SCH04、Sch07毒株全基因核苷酸序列進(jìn)行分段擴(kuò)增并測(cè)序，經(jīng)拼接成功獲得不包括polyA 的全基因核苷酸序列，分別為7 439 bp和7 438 bp，將2株全基因核苷酸序列上傳GenBank，進(jìn)行同源性比對(duì)和基于不同基因片段的遺傳演變分析，不僅豐富了RHDV的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)資料，而且為后續(xù)RHDV毒力相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

目前RHDV遺傳進(jìn)化分析主要建立在VP60基因核苷酸序列基礎(chǔ)上，把RHDV分為GI.1和GI.2基因群，GI.1包括經(jīng)典毒株(GI.1b～ GI.1d)和抗原變異株GI.1a[25-27]。本研究通過對(duì)31株RHDV全基因核苷酸序列、VP60基因核苷酸序列、ORF2編碼基因核苷酸序列的同源性進(jìn)行比對(duì)分析，并通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析毒株之間的親緣關(guān)系，結(jié)果表明VP60基因核苷酸序列是極為保守的基因片段，與以往相關(guān)研究的結(jié)果一致。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：基于VP60基因和ORF2編碼基因的分枝結(jié)構(gòu)較全基因更能清楚地顯示RHDV GI.1和GI.2基因群的區(qū)別，VP60基因進(jìn)化樹和ORF2編碼基因進(jìn)化樹均顯示各毒株遺傳距離差異不大，這一結(jié)果表明ORF2編碼區(qū)基因也可以作為RHDV遺傳演變研究的參考基因，并且ORF2編碼區(qū)基因比VP60基因核苷酸序列(約1 740 bp)更短(約355 bp)，在克隆分析操作過程中可能更加方便。

本試驗(yàn)中2株RHDV均屬于抗原變異株GI.1a，全基因核苷酸序列、VP60基因核苷酸序列和ORF2編碼基因核苷酸序列進(jìn)化樹顯示RHDV分群與時(shí)間有關(guān)系，時(shí)間對(duì)RHDV 的變異影響程度顯著高于地理區(qū)域的影響。比對(duì)結(jié)果顯示2株病毒全基因核苷酸序列同源性為99.8%，進(jìn)化樹顯示親緣關(guān)系最近，與31株參考毒株全基因核苷酸序列的同源性相似。同時(shí)2株病毒在基因核苷酸序列末端非編碼區(qū)的同一位置均出現(xiàn)堿基插入突變的現(xiàn)象，推測(cè)可能與堿基穩(wěn)定性較差有關(guān)，因?yàn)樵摲蔷幋a區(qū)處于病毒基因組末端。2株RHDV基因組末端堿基的插入突變，是否影響病毒的致病性以及VP60乃至全基因的表達(dá)調(diào)控，有待進(jìn)一步研究。