江月明 趙小敏 瞿欣

200233上海，亞什蘭（中國(guó)）投資有限公司

角質(zhì)層是機(jī)體抵御外界環(huán)境刺激的第一道屏障。環(huán)境污染物如顆粒物、紫外線和臭氧等侵害皮膚的重要機(jī)制是通過(guò)氧化損傷攻擊皮膚表層的不飽和脂質(zhì)，破壞皮膚最外層的保護(hù)層，產(chǎn)生活性羰基類物質(zhì)，如丙二醛、4-羥基壬烯醛、丙烯醛等。這類物質(zhì)超過(guò)機(jī)體的清除能力即出現(xiàn)羰基應(yīng)激，將誘導(dǎo)蛋白質(zhì)等生物大分子的羰基化修飾，使其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和功能喪失，從而加速皮膚衰老，或者引發(fā)皮膚的各種病態(tài)反應(yīng)［1?3］。Iwai等［4?6］指出蛋白羰基化會(huì)損傷角質(zhì)層的保水能力，影響皮膚透光率，改變皮膚的光學(xué)特性等。粉紅胡椒木提取物富含多酚類物質(zhì)槲皮苷和半乳糖苷，有很強(qiáng)的抗氧化特性［7?10］，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其通過(guò)維持角質(zhì)形成細(xì)胞活性，調(diào)控與表皮屏障相關(guān)的生物標(biāo)記物來(lái)增強(qiáng)皮膚屏障功能預(yù)防空氣污染。脂質(zhì)混合物（prolipid 141）主要成分為來(lái)源于植物的油水兩親分子物質(zhì)，可在皮膚表層形成穩(wěn)定的仿生脂質(zhì)的層狀凝膠相結(jié)構(gòu)，物理性增加皮膚屏障功能，預(yù)防污染損傷［11?12］。我們利用定制的污染模擬箱，以香煙煙霧模擬污染物，建立污染損傷模型，以角質(zhì)層蛋白羰基化水平表征皮膚的氧化損傷程度，在體評(píng)價(jià)粉紅胡椒木提取物和脂質(zhì)混合物對(duì)皮膚損傷的預(yù)防作用。

材料與方法

1.試劑和儀器：定制的污染模擬箱（上海利捷科學(xué)儀器有限公司），Atlas SUNTESTCPS+日光模擬測(cè)試箱（德國(guó)Atlas公司），D500 D?Squame按壓器（美國(guó)Cuderm公司），D100 D?suqame膠片（美國(guó)Cuderm公司），熒光素-5-氨基硫脲（fluorescein?5?thiosemicarbazide，F(xiàn)TZ，上海阿拉丁試劑公司），Image?Pro Analyzer 7.0圖像分析軟件（美國(guó)Mediacybernetics公司），粉紅胡椒木提取物溶液（商品名為Elixiance，美國(guó)亞什蘭集團(tuán)公司），脂質(zhì)混合物（商品名為Prolipid 141，美國(guó)亞什蘭集團(tuán)公司）。下文中提到的粉紅胡椒木提取物均為粉紅胡椒木提取物和丙二醇與水的混合溶液，脂質(zhì)混合物為甘油硬脂酸酯、山俞醇、棕櫚酸、硬脂酸、月桂醇、肉豆蔻醇和鯨蠟醇混合物。

2.受試者：入選標(biāo)準(zhǔn)為18～65歲健康志愿者，以室內(nèi)工作為主。排除標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)高度敏感或?qū)ο銦煙熿F敏感者；有光敏感病史者；面部和手臂有皮膚疾病者；存在任何影響皮膚表面形態(tài)的行為者，如行表皮剝脫術(shù)或使用含維A酸、果酸等外用制劑；面部或前臂屈側(cè)有瘢痕、色素斑等影響結(jié)果判斷者。根據(jù)上述條件共入選受試者79名，年齡（44.7±11.0）歲，均為室內(nèi)工作者，其中女性53名，年齡（44.1±10.5）歲；男性26名，年齡（45.9±12.2）歲。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。以下所有人體測(cè)試均基于赫爾辛基宣言，且已經(jīng)通過(guò)美國(guó)亞什蘭公司毒理學(xué)部門的毒理學(xué)安全性審核。

3.人體不同部位蛋白羰基化水平檢測(cè)：健康受試者34名，年齡（40.1±11.1）歲，均為室內(nèi)工作者。其中女性21名，年齡（40.5±11.4）歲；男性13名，年齡（39.5±11.1）歲。先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定D?squame膠片取樣量對(duì)蛋白羰基化水平的影響：選取其中4名受試者，在其額部、面頰部、前臂屈側(cè)和腰背部分別用兩種不同的壓力采集D?squame膠片，每個(gè)部位均獲得兩片取樣量差異較大的樣本，共計(jì)32片角質(zhì)層樣本；精密天平稱量膠片采集前后的重量，差值即角質(zhì)層重量，再對(duì)各樣品蛋白羰基化水平進(jìn)行分析。分析顯示，角質(zhì)層重量與蛋白羰基化水平相關(guān)性很低（R2=0.039 5），見(jiàn)圖1。因此，D?squame膠片取樣量對(duì)于比較不同部位蛋白羰基化水平的影響微弱。之后，分別在受試者額部、面頰、前臂屈側(cè)和腰背部采集皮膚角質(zhì)層樣品，熒光標(biāo)記分析不同部位蛋白羰基化水平。

4.人體污染暴露：定制的污染箱可以把微細(xì)顆粒或者香煙等污染物泵入密封的箱體內(nèi)，并通過(guò)空氣循環(huán)對(duì)流使污染物在箱體里均勻分散。15名受試者，年齡（47.8±7.2）歲，均為室內(nèi)工作者，其中女性12名，年齡（49.2±7.5）歲；男性3名，年齡（42.3±1.5）歲。志愿者單側(cè)前臂用自來(lái)水內(nèi)外沖洗各30 s，并于等候區(qū)［環(huán)境溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%］適應(yīng)30min后，單側(cè)前臂屈側(cè)（含手掌）向上伸入污染模擬箱中暴露于以香煙煙霧模擬的空氣污染，確保暴露期間箱體內(nèi)PM10和PM2.5濃度均大于1 000μg/m3（實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)顯示，吸煙時(shí)面部附近顆粒物濃度可達(dá)1 200 μg/m3）［13］。分別于暴露后0、1、2、4、5 h用D?squame膠片采集前臂屈側(cè)角質(zhì)層樣本，即用鑷子夾取D?squame膠片平整貼于前臂屈側(cè)手腕到手肘之間的皮膚，用D?Squame按壓器（225 g/cm2）按壓10 s后，撕取并封存于靜電貼膜中，置于-80℃冰箱保存。

5.粉紅胡椒木提取物和脂質(zhì)混合物對(duì)皮膚損傷的短期預(yù)防作用：先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定角質(zhì)層自體熒光和相鄰區(qū)域蛋白羰基化水平的差異，即在前臂屈側(cè)相鄰區(qū)域取2片表層角質(zhì)層樣本，分別于熒光染色前后進(jìn)行顯微鏡拍照分析，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層自體熒光非常微弱，可以忽略不計(jì)。同時(shí)，相鄰區(qū)域皮膚的羰基化水平很接近，可以作為平行樣品對(duì)照。入選14名健康受試者，年齡（46.6±7.8）歲，均為室內(nèi)工作者，其中女性11名，年齡（47.8±8.5）歲；男性3名，年齡（42.3±1.5）歲。在每名受試者單側(cè)前臂屈側(cè)選取3處5 cm×5 cm區(qū)域，分別外用2mg/cm21%粉紅胡椒木提取物的水溶液（胡椒木組）、去離子水（對(duì)照組）或不涂任何樣品（空白組），并于等候區(qū)［環(huán)境溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%］適應(yīng)15min后將手臂置于污染模擬箱中暴露5 h，期間嚴(yán)格監(jiān)控受試者以避免任何影響測(cè)試結(jié)果的行為，從而保證試驗(yàn)的重復(fù)性。暴露前后采集各區(qū)域角質(zhì)層樣本，檢測(cè)皮膚蛋白羰基化水平。另選16名健康受試者，年齡（42.2±10.6）歲，均為室內(nèi)工作者，其中女性13名，年齡（42.2±11.8）歲；男性3名，年齡（42.3±1.5）歲。單側(cè)前臂屈側(cè)選取3處5 cm×5 cm區(qū)域后，分別外用2mg/cm2含5%脂質(zhì)混合物的乳液（脂質(zhì)混合物組）、不含脂質(zhì)混合物的安慰劑乳液（對(duì)照組）或不涂任何樣品（空白組）。暴露前和暴露5 h后采集各區(qū)域角質(zhì)層樣本，用于檢測(cè)皮膚蛋白羰基化水平。

6.粉紅胡椒木提取物的長(zhǎng)期預(yù)防作用：選擇上海市污染相對(duì)最嚴(yán)重的冬季（測(cè)試期間平均大氣污染指數(shù)AQI為105，PM2.5為98），健康受試者20名，年齡（53.9±7.7）歲，均為室內(nèi)工作者，其中女性10名，年齡（52.6±5.7）歲；男性10名，年齡（55.2±9.5）歲。采用雙盲半臉測(cè)試，隨機(jī)選擇左右半臉?lè)謩e外用含1%粉紅胡椒木提取物的自配乳液（主要成分為水、棕櫚酸異辛酯、乳木果油、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、PEG?100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、粉紅胡椒木提取物、丙烯酸/乙烯基吡咯烷酮交聯(lián)共聚物等）和不含粉紅胡椒木提取物的安慰劑乳液，均為每日早晚2次。受試者來(lái)訪第1天（未使用產(chǎn)品）和使用產(chǎn)品56 d后，采用D?Squame膠片在受試者的面頰部和額部分別采集角質(zhì)層樣本，測(cè)定蛋白羰基化水平。

7.蛋白羰基化水平檢測(cè)［14］：將帶角質(zhì)層樣本的D?squame膠片浸入40μmol/L熒光素-5-氨基硫脲溶液中，室溫置于暗處1 h。熒光染色后，取出膠片用PBS溶液沖洗3次，帶膠側(cè)朝上置于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察并隨機(jī)選取3個(gè)視野拍攝照片（放大倍數(shù)：25和100；FTZ激發(fā)波長(zhǎng)492 nm，入射波長(zhǎng)516 nm）。采用Image Pro Plus 7.0軟件對(duì)25×圖像進(jìn)行分析，僅選取熒光顯色區(qū)域，計(jì)算其平均熒光強(qiáng)度，以其代表蛋白羰基化水平。

圖2 身體不同部位蛋白羰基化水平（×100）綠色區(qū)域?yàn)闊晒鈽?biāo)記的角質(zhì)層羰基化蛋白，顏色越亮代表蛋白羰基化水平越高

圖3 前臂屈側(cè)暴露于香煙煙霧不同時(shí)間后皮膚蛋白羰基化水平（×100） 綠色區(qū)域?yàn)闊晒鈽?biāo)記的角質(zhì)層羰基化蛋白，顏色越亮代表蛋白羰基化水平越高

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用JMP10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析多樣本間差異，兩樣本間做LSD?t檢驗(yàn)。長(zhǎng)期人體測(cè)試中左右面頰的蛋白羰基化水平比較采用配對(duì)樣本單尾t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.人體不同部位蛋白羰基化水平（平均熒光強(qiáng)度）：34名受試者面頰和額部高于手臂和腰背部，且熒光強(qiáng)弱的分布更不均勻，見(jiàn)圖2。面頰、額部、手臂和腰背部蛋白羰基化水平分別為26.3±7.1、22.9±7.9、14.7±4.9和12.6±4.2（F=37.768，P ＜0.001），手臂部顯著高于腰背部（t=2.031，P=0.046）。從科學(xué)性和可操作性綜合考慮，在之后的測(cè)試中，選用受試者前臂屈側(cè)暴露于污染模擬箱中。

2.污染暴露對(duì)皮膚蛋白羰基化水平的影響：15名受試者將前臂屈側(cè)暴露于香煙模擬的污染箱中后，隨暴露時(shí)間增加，蛋白羰基化水平持續(xù)增加，且與時(shí)間線性相關(guān)（R2=0.995 9），在暴露前和暴露1、2、4、5 h后分別為14.5± 3.67、20.2± 4.46、25.5±4.00、29.4±5.30和34.3±7.80，各時(shí)間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.278，P ＜0.001），見(jiàn)圖3。

圖4 粉紅胡椒木提取液對(duì)皮膚蛋白羰基化的抑制作用（×100） 綠色區(qū)域?yàn)闊晒鈽?biāo)記的角質(zhì)層羰基化蛋白，顏色越亮代表蛋白羰基化水平越高

3.粉紅胡椒木提取物和脂質(zhì)混合物對(duì)皮膚損傷的預(yù)防作用：短期的人體污染暴露實(shí)驗(yàn)顯示，與空白組及對(duì)照組相比，胡椒木組香煙煙霧引起的皮膚損傷降低，見(jiàn)圖4。其中，胡椒木組（14名）暴露后角質(zhì)層蛋白羰基化水平升高值為9.7±5.2，低于空白組和對(duì)照組（19.0±10.0、18.5±7.3，F(xiàn)=6.302，P=0.004），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為3.156、2.986，P值分別為0.001 5、0.002 4）。16名受試者5%脂質(zhì)混合物乳液處理的區(qū)域暴露后角質(zhì)層蛋白羰基化水平升高值為5.8±4.9，低于空白組和對(duì)照組（17.4± 8.8、15.9± 6.4，F(xiàn)=13.580，P ＜0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為4.792、4.170，均P＜0.001）。受試者試驗(yàn)中未發(fā)生不良反應(yīng)。

4.粉紅胡椒木提取物的長(zhǎng)期預(yù)防作用：20名受試者與使用前相比，使用56 d后，面頰部提取物側(cè)和安慰劑側(cè)角質(zhì)層蛋白羰基化水平變化值分別為-3.6±8.5和1.5±7.8，與安慰劑側(cè)相比，提取物側(cè)面部蛋白羰基化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.156，P=0.022），14例受試者提取物側(cè)蛋白羰基化水平低于安慰劑側(cè)。受試者試驗(yàn)中未發(fā)生不良反應(yīng)。

討 論

隨著空氣污染日益成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，越來(lái)越多的研究揭示空氣污染對(duì)皮膚的影響及其損傷機(jī)制［15?17］，但是鮮少提及具體的評(píng)價(jià)方法。歐萊雅（中國(guó)）有限公司的一項(xiàng)研究利用污染導(dǎo)致角質(zhì)層不飽和脂質(zhì)減少的機(jī)制，將高效液相色譜法測(cè)定的角鯊烯含量作為評(píng)價(jià)角質(zhì)層脂質(zhì)屏障受損的標(biāo)記［18］。我們首次將角質(zhì)層蛋白羰基化水平作為污染對(duì)皮膚損傷程度的標(biāo)記物。盡管脂質(zhì)屏障是最先遭到氧化損傷的對(duì)象，但是皮膚的修復(fù)機(jī)制可以抵御輕度的氧化損傷，持續(xù)過(guò)度的氧化損傷，才會(huì)進(jìn)一步攻擊蛋白和DNA等［19］，進(jìn)而引起外源性老化。因此，蛋白的羰基化修飾是皮膚更深層次的氧化損傷。相較于脂質(zhì)屏障受損標(biāo)記物角鯊烯，它能更準(zhǔn)確全面地反映皮膚的損傷程度。但本研究未設(shè)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，因而尚須進(jìn)一步研究證實(shí)。蛋白羰基化水平作為衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的通用指標(biāo)，有較多的測(cè)定方法，包括傳統(tǒng)的分光光度法、儀器分析法、Western印跡和酶聯(lián)免疫方法等［20］。我們采用一種直觀簡(jiǎn)便的蛋白羰基化檢測(cè)方法，即通過(guò)膠帶剝離法采集樣本，并以熒光標(biāo)記法結(jié)合Image?Pro Analyzer 7.0軟件分析D?squame膠片的熒光強(qiáng)度來(lái)表征角質(zhì)層蛋白羰基化水平。傳統(tǒng)的分光光度法采用2,4-二硝基苯肼對(duì)角質(zhì)層羰基化蛋白進(jìn)行衍生化，需要毫克級(jí)蛋白且需經(jīng)多次沉淀、洗滌和復(fù)溶，不僅操作步驟繁瑣，而且容易造成蛋白損失［20］。本方法基于同等原理，通過(guò)熒光素-5-氨基硫脲的肼基與角質(zhì)層蛋白的羰基結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記，相比之下更簡(jiǎn)便且能以圖像的形式直觀反映角質(zhì)層的損傷程度［14］。

我們引入定制污染模擬箱，以香煙煙霧模擬空氣污染，在體評(píng)價(jià)污染對(duì)皮膚的損傷。由于污染模擬箱在皮膚損傷研究方面的應(yīng)用較少，因而這類儀器尚待進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。香煙煙霧的組成類似于空氣污染中的化石燃料燃燒產(chǎn)物，且已被證實(shí)是室內(nèi)PM污染的主要因素［21?22］。同時(shí)，香煙煙霧在呼吸道和心血管疾病方面表現(xiàn)出與空氣污染類似的健康風(fēng)險(xiǎn)［23］，以其作為模擬污染物具有一定的代表性。對(duì)污染模型的影響因素進(jìn)行評(píng)估，證實(shí)角質(zhì)層自體熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響，且相鄰區(qū)域皮膚羰基化水平較為接近，因而在短期暴露測(cè)試中，將相鄰區(qū)域作為平行樣品的對(duì)照區(qū)域。人體不同部位由于在污染空氣和紫外線中暴露程度不同，羰基化水平也存在顯著性差異，面頰和額部為嚴(yán)重曝光部位，其蛋白羰基化水平最高，手臂為次級(jí)曝光部位，腰背部為非曝光部位，蛋白羰基化水平最低。人體長(zhǎng)期曝光部位的蛋白羰基化水平更高是綜合因素作用的結(jié)果，空氣污染物協(xié)同紫外線可加劇皮膚的氧化損傷［24］。基于以上研究，利用該污染模型通過(guò)短期模擬加速暴露實(shí)驗(yàn)評(píng)估粉紅胡椒木提取物和脂質(zhì)混合物對(duì)皮膚損傷的預(yù)防作用，結(jié)果顯示，粉紅胡椒木提取物和脂質(zhì)混合物組皮膚暴露后角質(zhì)層蛋白羰基化水平升高值顯著低于空白組和對(duì)照組。同時(shí)，我們選擇污染嚴(yán)重的冬季，通過(guò)長(zhǎng)期測(cè)試發(fā)現(xiàn)，受試者使用含1%粉紅胡椒木提取物的乳液8周后，面部蛋白羰基化水平顯著低于安慰劑側(cè)，進(jìn)一步證實(shí)粉紅胡椒木提取物對(duì)皮膚損傷有持續(xù)預(yù)防作用。粉紅胡椒木提取物中富含的槲皮苷和半乳糖苷賦予其很強(qiáng)的抗氧化特性，可在短期污染暴露中即時(shí)減輕空氣污染物的氧化損傷，且在長(zhǎng)期使用后，粉紅胡椒木提取物還可能通過(guò)調(diào)控與表皮屏障相關(guān)的生物標(biāo)記物，如調(diào)節(jié)與皮膚代謝相關(guān)的非編碼RNA促進(jìn)表皮分化［25?26］，同時(shí)促進(jìn)緊密連接蛋白、鈣黏蛋白、內(nèi)披蛋白、半胱天冬酶等標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)皮膚自身的屏障功能抵御空氣污染［27］。脂質(zhì)混合物在生理溫度下可以模擬角質(zhì)層脂質(zhì)的有序?qū)訝罱Y(jié)構(gòu)，同時(shí)其隨溫度變化的特性也和角質(zhì)層脂質(zhì)很接近［28］，因此外用含脂質(zhì)混合物的乳霜后，可在皮膚表層鋪展形成穩(wěn)定的仿生脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而物理性增強(qiáng)皮膚屏障，即時(shí)預(yù)防空氣污染損傷。

利益沖突聲明本試驗(yàn)與亞什蘭（中國(guó)）投資有限公司存在利益關(guān)系。本研究中心隸屬于亞什蘭（中國(guó)）投資有限公司，實(shí)驗(yàn)所有資源和資金均由亞什蘭（中國(guó)）投資有限公司提供