王小坡 倪娜娜 熊競舒 宋昊 姜祎群 陳浩 曾學(xué)思 孫建方

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院病理科

Casitas B?lineage lymphoma（Cbl）?b 是 Cbl家族成員之一，屬于環(huán)指型泛素連接酶，在腫瘤發(fā)病中可通過其N-端酪氨酸激酶結(jié)合（TKB）結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合底物蛋白酪氨酸激酶，從而啟動底物泛素化降解，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控。Fan等［1］發(fā)現(xiàn)，Cbl?b可通過泛素化降解黏著斑激酶（FAK）使胃癌細(xì)胞解離，從而促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。Kang等［2］發(fā)現(xiàn)，Cbl/Cbl?b可作為連接蛋白與Smad3結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）?β信號通路，從而參與乳腺癌發(fā)病過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤組織及細(xì)胞中Cbl-b基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于色素痣組織及正常黑素細(xì)胞，并且可促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞株A375增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，但相關(guān)的分子基礎(chǔ)及信號通路仍不明確［3］。本研究中我們采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較Cbl?b shRNA慢病毒載體沉默A375細(xì)胞株及陰性對照A375細(xì)胞株蛋白表達(dá)差異，并對差異蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology）富集及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG）通路富集分析，探討Cbl?b參與黑素瘤發(fā)病的相關(guān)蛋白及可能機(jī)制。

材料與方法

一、材料

C18 Cartridge、C18上樣柱（EASY column SC001 traps150μM×20mm，RP?C18）、C18分析柱（EASY column SC200 150μM× 100mm，RP?C18）均來自美國Thermo公司，BCA定量試劑盒來自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠抗人Cbl?b單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，鼠抗人促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2（EphA2）、糖原合成酶激酶3（GSK3）β、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p?AKT）多克隆抗體均為美國Bioworld公司產(chǎn)品。Q?Exactive質(zhì)譜儀、Easy?nLC 1000納升級液相色譜（美國Thermo Fisher公司）。

A375細(xì)胞系（美國模式培養(yǎng)物保藏中心）由本所中心實驗室保存，在以往研究中構(gòu)建慢病毒shRNA Cbl?b A375細(xì)胞系（用shRNA Cbl?b慢病毒載體轉(zhuǎn)染72 h）及對照A375細(xì)胞系（用對照慢病毒載體轉(zhuǎn)染72 h）［4］。

二、試驗方法

1.轉(zhuǎn)染后A375細(xì)胞蛋白提取及電泳：轉(zhuǎn)染后72 h提取慢病毒shRNACbl?b沉默組及對照組A375細(xì)胞蛋白，蛋白樣品加入200μl SDT裂解液（4%SDS，100 mmol/L 二硫蘇糖醇，100 mmol/L Tris，pH8.5），超聲處理（100W，工作10 s，間歇10 s，循環(huán)10次）；沸水浴10min；14 000×g離心30min，取上清液；BCA法進(jìn)行蛋白定量。每組各取20μg樣品加入5×上樣緩沖液，沸水浴5min，14 000×g離心10 min取上清液，SDS?PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。

2.蛋白樣品酶解（filter?aided samplepreparation，F(xiàn)ASP）：每組取192μg蛋白裂解樣品，加入二硫蘇糖醇至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5min；加入200μl尿素緩沖液稀釋混勻，14 000×g離心15min（重復(fù)1次），棄濾液；加入100μl含50mmol/L碘乙酰胺的尿素緩沖液，振蕩1min，避光室溫孵育30min后14 000×g離心10min；加入100μl尿素緩沖液，14 000×g離心10min（重復(fù)2次）；加入100μl碳酸氫銨緩沖液，14 000×g離心10min（重復(fù)2次）；加入40μl含4μg胰酶碳酸氫銨的緩沖液，振蕩1min；37℃酶解16～18 h；換新收集管，14 000×g離心10 min，收集濾液；濾液經(jīng) C18?SD Extraction Disk Cartridge脫鹽處理，之后根據(jù)吸光度A280對肽段定量。

3.酶解產(chǎn)物的LC?MS/MS分析（上海中科新生命生物科技有限公司協(xié)助完成）：采用HPLC液相色譜系統(tǒng)EASY?nLC1000分離，流速為400 nl/min。采用Q?Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時長120min，檢測方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800質(zhì)量電荷比（m/z）。多肽和多肽碎片m/z按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜，激活方式為高能量碰撞解離（HCD），隔離窗口為2m/z。一級質(zhì)譜分辨率200m/z時為70 000，二級質(zhì)譜分辨率為17 500。

4.數(shù)據(jù)庫檢索與定量分析：應(yīng)用MaxQuant軟件（版本號1.3.0.5）對質(zhì)譜原始文件進(jìn)行定量分析。主要參數(shù)如下：最大容許漏切位點(diǎn)為2，酶為胰蛋白酶，半胱氨酸脲甲基化修飾為固定修飾，甲硫氨酸氧化和蛋白N末端乙?；癁榭勺冃揎棧琈axQuant所得查庫文件使用Perseus軟件進(jìn)行分析（版本號1.3.0.4）。差異蛋白篩選標(biāo)準(zhǔn)為Cbl?b shRNA沉默組/對照組非標(biāo)定量強(qiáng)度＞2或＜0.5，同時滿足P＜0.05。

5.生物信息學(xué)分析：用Cluster 3.0軟件分析差異蛋白，Java Tree View軟件生成層次聚類熱圖。用Blast2GOCommand Line軟件分析基因本體條目生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組分富集情況；用KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）軟 件 分 析KEGG通路富集情況。

6.Western 印跡檢測 Cbl?b、EphA2、GSK3β、AKT、p?AKT蛋白表達(dá)：方法同文獻(xiàn)［4］。轉(zhuǎn)染后72 h提取shRNA沉默組和對照組總蛋白，蛋白變性、上樣，SDS?PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入鼠抗人Cbl?b單克隆抗體（1∶500）和EphA2（1∶500）、GSK3β（1∶500）、AKT（1∶800）、p?AKT（1∶800）多克隆抗體及鼠抗人GAPDH抗體（1∶1 000）孵育過夜等。用Image J軟件分析條帶灰度，以對照組條帶灰度值為1，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。Cbl?b shRNA沉默組和對照組間蛋白豐度比較采用兩樣本t檢驗（n=3）?；虮倔w及KEGG富集分析采用Fisher精確概率法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞蛋白提取及Cbl?b蛋白沉默效果

BCA法檢測陰性對照組蛋白濃度為（3.126±0.108）g/L，Cbl?b shRNA 組蛋白濃度為（6.024 ±0.227）g/L。由考馬斯亮藍(lán)圖譜看，各樣品條帶分離清晰，蛋白提取效果良好（圖1）。Western印跡表明，Cbl?b shRNA組Cbl?b蛋白相對表達(dá)量顯著降低（圖2）。

圖1 A375細(xì)胞提取蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 M：蛋白分子標(biāo)記物；1～3：陰性對照組；4～6：Cbl?b shRNA沉默組

圖2 Western印跡檢測Cbl?b在兩組A375細(xì)胞中的表達(dá)

二、蛋白質(zhì)鑒定及差異蛋白分析

本次共鑒定肽段23 579個，蛋白質(zhì)3 449個。所定量到蛋白質(zhì)序列信息批量提取自UniProtKB數(shù)據(jù)庫（版本號：201701）。兩組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)為74個，其中Cbl?b shRNA沉默組較對照組表達(dá)上調(diào)的蛋白52個，下調(diào)的蛋白22個。上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)排名前10位的蛋白分別見表1、2。

三、蛋白聚類分析

利用篩選的差異蛋白對Cbl?b shRNA重組慢病毒沉默組和對照組進(jìn)行層次聚類，結(jié)果顯示差異蛋白可以有效區(qū)分樣本，即挑選的差異蛋白合理、準(zhǔn)確（圖3）。

四、差異蛋白基因本體富集分析

前5位顯著富集生物學(xué)過程為整合素介導(dǎo)細(xì)胞黏附、單一生物代謝過程、整合素介導(dǎo)細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)靶向線粒體調(diào)節(jié)、核酸代謝過程；前5位顯著富集分子功能為DNA結(jié)合、2，2鐵硫簇合物結(jié)合、信號受體活性、鈣黏蛋白結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合；前5位顯著富集的細(xì)胞組分為核小體、DNA包裝復(fù)合體、光感器連接纖維、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體、胞外區(qū)部分。

表1 慢病毒Cbl?b shRNA沉默組A375細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的蛋白（n=3，與陰性對照組相比差異倍數(shù)排名前10位）

表2 慢病毒Cbl?b shRNA沉默組A375細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的蛋白（n=3，與陰性對照組相比差異倍數(shù)排名前10位）

圖3 差異蛋白對Cbl?b shRNA重組慢病毒沉默組和陰性對照組層次聚類熱圖 紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)

五、差異蛋白KEGG富集分析

前5位與黑素瘤相關(guān)的顯著富集通路包括葉酸生物合成、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏合連接、Wnt信號通路（圖4）。

六、Western印跡驗證部分差異蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

Cbl?b shRNA沉默組A375細(xì)胞EphA2表達(dá)下調(diào)（0.369），GSK3β表達(dá)上調(diào)（3.524）（圖5A）。Western印跡檢測結(jié)果與LC?MS/MS研究結(jié)果一致。

七、沉默Cbl?b表達(dá)對AKT、p?AKT表達(dá)的影響

Western印跡檢測表明Cbl?b shRNA沉默組A375細(xì)胞AKT表達(dá)水平與對照組類似（1.04），p?AKT表達(dá)水平（0.453）降低，見圖5B。

圖4 差異蛋白顯著富集的KEGG條目統(tǒng)計圖 點(diǎn)的大小表示通路中差異表達(dá)基因條數(shù)多少，點(diǎn)的顏色對應(yīng)不同的negLog10_Pvalue范圍

圖5 Western 印跡檢測A375細(xì)胞中EphA2、GSK3β（5A）及AKT、p?AKT（5B）蛋白表達(dá) EphA2：促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2；GSK3β：糖原合成酶激酶3β；AKT：蛋白激酶B；p?AKT：磷酸化蛋白激酶B

討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)通過凝膠電泳、質(zhì)譜等技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)反映生物體內(nèi)發(fā)生的全部過程及變化。從這些龐大而復(fù)雜的實驗數(shù)據(jù)中尋找生物體的改變以及引起這些改變的源頭和機(jī)制，是蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)的主要任務(wù)。使用siRNA沉默目的基因進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)分析，可以了解與特定基因功能喪失相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)的整體變化［5?6］。本研究采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)成功鑒定74個在Cbl?b shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株與空白慢病毒載體轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞株間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中52個蛋白質(zhì)在Cbl?b shRNA沉默組表達(dá)上調(diào)，22個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。

基因本體是生物學(xué)的統(tǒng)一化工具，包括3大獨(dú)立的本體：分子功能、生物過程和細(xì)胞組分。我們對差異蛋白集合基因本體條目富集分析發(fā)現(xiàn)，顯著富集分子功能包括DNA結(jié)合、2，2鐵硫簇合物結(jié)合、信號受體活性、鈣黏蛋白結(jié)合等，這與顯著富集的生物學(xué)過程細(xì)胞黏附及細(xì)胞代謝過程相一致，這些過程與功能均在腫瘤的增殖、侵襲中起重要作用。我們對差異蛋白-KEGG條目富集分析發(fā)現(xiàn)，黑素瘤相關(guān)的顯著富集通路主要包括葉酸生物合成、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏合連接、Wnt信號通路、Hippo信號通路、葉酸拮抗、氧化磷酸化、PI3K?Akt信號通路等。葉酸生物合成通路及葉酸拮抗劑抵抗通路值得關(guān)注，因為膳食葉酸攝入對雌激素受體陰性的乳腺癌有保護(hù)作用［7］；此外，許多研究表明，葉酸在生物甲基化和核苷酸合成中具有核心作用，可以調(diào)節(jié)癌變［8］。多種通路與細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理有關(guān)，如黏合連接、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用信號通路與黑素瘤密切相關(guān)［9］。另外，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如Wnt、Hippo、PI3K?AKT信號通路與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10?13］。因此，敲除黑素瘤 A375 細(xì)胞株Cbl?b可能通過多種信號通路影響黑素瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移。

由于GSK3β可通過Wnt/β聯(lián)蛋白和Hedgehog信號通路負(fù)性調(diào)節(jié)癌基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，因此GSK3β是抑制腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展的抑癌基因。Eph家族是受體酪氨酸激酶家族成員中最大亞族，EphA2是EphA亞家族中的一員。在乳腺癌、卵巢癌和黑素瘤等腫瘤中EphA2均高表達(dá)，并且可通過非配體依賴途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［14?15］。我們選擇這兩個蛋白通過Western印跡驗證蛋白質(zhì)組學(xué)可靠性，結(jié)果表明，Western印跡實驗結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。

我們發(fā)現(xiàn)，在黑素瘤A375細(xì)胞株中，Cbl?b沉默后，EphA2表達(dá)下降，因此Cbl?b與EphA2可能共同促進(jìn)黑素瘤進(jìn)展。EphA2可通過多種信號通路參與腫瘤發(fā)病，如 JAK/STAT、Ras/MAPK、PI3K/AKT和integrins/FAK/paxillin/Rho等［16］。沉默 Cbl?b表達(dá)可阻斷AKT的磷酸化過程，從而抑制PI3K?AKT信號通路的過度活化。

綜上所述，我們利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析Cbl?b沉默A375細(xì)胞后差異蛋白表達(dá)，共鑒定72個Cbl?b相關(guān)蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白涉及多種生物學(xué)功能及信號通路。因此推測Cbl?b可能通過多種信號通路參與黑素瘤發(fā)病過程，其中Cbl?b激活EphA2/PI3K/AKT信號通路可能是黑素瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制之一，其他信號通路仍值得深入研究。