周文嬌 任杰 韓瓏 劉欣欣 湯坤龍 羅素菊

300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科（周文嬌、任杰、韓瓏、羅素菊），泌尿外科（湯坤龍）；天津市兒童醫(yī)院皮膚科（劉欣欣）

CC趨化因子配體27（CCL27）是皮膚發(fā)育和角質(zhì)形成細胞分化過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要因子之一［1］，研究表明，CCL27及其受體CCR10在銀屑病皮損的角質(zhì)形成細胞及血清中異常表達［2?6］。我們的前期［7?8］研究表明，白細胞介素22（IL?22）作為Th22細胞的效應(yīng)因子，可促進HaCaT細胞增殖，抑制HaCaT細胞凋亡和分化，并且可通過MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號通路誘導肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子（heparin?bingding epidermal?growth?factor?like growth factor）表達和抑制他扎羅汀誘導基因3（tazarotene?induced gene 3）表達。推測IL?22也可以通過這兩條信號通路對在角質(zhì)形成細胞分化過程中起重要作用的CCL27存在調(diào)控作用。本研究進一步探討銀屑病中IL?22對趨化因子CCL27表達的調(diào)控。

一、材料與方法

1.細胞株及主要材料：HaCaT細胞系由德國柏林自由大學本杰明·富蘭克林醫(yī)學中心惠贈，在實驗室長期保存。重組人IL?22（美國 Protein Specialists公司），抗人 CCL27/CTACK抗體（美國RD公司），抗β肌動蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），PD98059（MAPK?ERK1/2通路抑制劑）、AG490（JAK2/STAT3通路抑制劑）（美國Millipore公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibico公司），人CCL27酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（美國RD公司），超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2.免疫組化檢測銀屑病患者皮損中CCL27的表達：10例銀屑病組織標本來自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科病理組織蠟塊，男5例，女5例，年齡18～50歲（平均22.3歲），其中2例來自頸后部，8例來自軀干；5例健康人皮膚標本來自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院整形美容科，男3例，女2例，年齡20～36歲（平均23.5歲），其中1例來自面部，1例來自頸部，3例來自軀干。本研究獲得天津醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，受檢者均簽署知情同意書。采用超敏二步法免疫組化檢測，按產(chǎn)品說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、封片，顯微鏡下觀察。

3.細胞培養(yǎng)及分組：HaCaT細胞復(fù)蘇后，置于37℃、5%CO2孵箱中用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行消化，按1×105/Ml接種于6孔板中，待細胞70%～80%融合時，更換成含有0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓處理2 h，之后更換新的培養(yǎng)液，分為8組，對照組用PBS處理；干預(yù)組分別用12.5、25、50、100、200μg/L重組人IL?22干預(yù)；通路阻斷組先分別加入50μmol/L AG490或50μmol/LPD98059阻斷干預(yù)，2 h后各加入50μg/L（依據(jù)課題組前期研究［7?8］確定）IL?22。上述處理完成后，繼續(xù)于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。

4.Western印跡檢測CCL27蛋白表達：將上述各組HaCaT細胞用冷PBS洗3遍，每孔加100μl細胞裂解液和1μl蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF），于冰上裂解30min，收集細胞裂解液，4℃下離心（13 200×g）10min，取上清液。BCA法測蛋白濃度后進行Western印跡。用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為30μg，電泳90min，穩(wěn)流300mA，轉(zhuǎn)膜40min，加入抗人CCL27/CTACK抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG室溫孵育2 h，ECL顯色。蛋白條帶灰度值采用Image?pro plus3.0軟件分析，以CCL27與內(nèi)參β肌動蛋白的灰度值比值表示CCL27相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

5.ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中CCL27含量：取上述各組HaCaT細胞上清液，按試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm和570 nm處讀取吸光度A值，建立標準曲線，獲得樣品中趨化因子CCL27的含量。實驗重復(fù)3次。

6.統(tǒng)計學分析：計量資料用x±s表示。采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析和Dunnett?t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

1.CCL27表達：銀屑病患者皮損中，CCL27在表皮全層角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)中均有表達。而對照組中，CCL27主要表達于表皮基底層角質(zhì)形成細胞胞質(zhì)中，基底層以上表達較弱。見圖1。

圖1 CC趨化因子配體27（CCL27）在健康人皮膚及銀屑病皮損中的表達（DAB染色）

2.IL?22干預(yù)及阻斷MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3信號通路后HaCaT細胞中CCL27蛋白表達：Western印跡檢測顯示，12.5～200μg/L IL?22干預(yù)組和對照組HaCaT細胞CCL27表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=314.722，P＜0.01），且IL?22干預(yù)組均顯著高于對照組（P＜0.01）。IL?22+AG490組、IL?22+PD98059組與50 μg/L IL?22組間CCL27表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=358.706，P＜0.01），且前兩組均顯著低于50μg/L IL?22組（均P＜0.01）。見圖2、表1。

圖2 白細胞介素22（IL?22）對HaCaT細胞CC趨化因子配體27（CCL27）表達的影響 1：對照組；2 ～ 6：分別為12.5、25、50、100、200 μg/L IL?22組；7：50 μg/L IL?22+AG490組；8：50 μg/L IL?22+PD98059組

表1 Western印跡法與ELISA法檢測不同濃度白細胞介素22（IL?22）對HaCaT細胞CC趨化因子配體27表達的影響（±s）

表1 Western印跡法與ELISA法檢測不同濃度白細胞介素22（IL?22）對HaCaT細胞CC趨化因子配體27表達的影響（±s）

注：n=3。a與對照組比較，P＜0.01；b與50 μg/L IL?22組比較，P＜0.01

組別對照組12.5 μg/L IL?22 25 μg/L IL?22 50 μg/L IL?22 100 μg/L IL?22 200 μg/L IL?22 50 μg/L IL?22+AG490 50 μg/L IL?22+PD98059 Western印跡法0.413±0.013 0.491±0.013a 0.620±0.019a 0.623±0.014a 0.802±0.052a 1.138±0.013a 0.411±0.019b 0.280±0.012b ELISA法（ng/L）26.370±0.490 33.403±0.748a 34.710±0.980a 37.486±0.748a 38.473±0.753a 39.783±1.020a 27.586±0.288b 35.846±0.757b

ELISA檢測顯示，12.5～200μg/L IL?22干預(yù)組與對照組CCL27分泌量差異有統(tǒng)計學意義（F=108.307，P＜0.01），且IL?22干預(yù)組均顯著高于對照組（P＜0.01）。IL?22+AG490組和IL?22+PD98059組與50μg/L IL?22組間差異亦有統(tǒng)計學意義（F=208.192，P＜0.01），且前兩組均顯著低于50μg/L IL?22組（P＜0.01）。見表1。

三、討論

本研究結(jié)果示，12.5～200μg/L IL?22干預(yù)處理后HaCaT細胞中CCL27表達水平升高，同時IL?22也可以促進HaCaT細胞分泌CCL27；加入信號通路阻斷劑后CCL27表達均較未加抑制劑組減少。表明IL?22對CCL27的合成與分泌有促進作用；MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3信號通路在其中發(fā)揮了重要作用。

目前研究認為，CCL27是皮膚發(fā)育和角質(zhì)形成細胞分化調(diào)節(jié)的重要因子之一［1］，主要由皮膚表皮角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生，大部分表達于胞質(zhì)中，在銀屑病患者皮損中CCL27mRNA和蛋白含量比銀屑病非皮損區(qū)顯著升高，并且在銀屑病患者血清中CCL27水平升高［5?6］，CCL27與CCR10結(jié)合，趨化淋巴細胞進入皮膚，在T細胞介導的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

對皮膚T細胞淋巴瘤的研究表明，血清IL?22水平與血清乳酸脫氫酶、可溶性IL?2受體及CCL27有關(guān)［9］。有研究表明，T細胞來源的TNF?α以及IL?1β可誘導CCL27表達，而IL?17可抑制人正常皮膚角質(zhì)形成細胞中CCL27表達［10］。這些炎癥因子都是銀屑病發(fā)病的重要因子，IL?22是銀屑病發(fā)病的另一重要炎癥因子，因此我們推測，IL?22在銀屑病患者體內(nèi)可以干擾表皮CCL27的表達，進而影響角質(zhì)形成細胞增殖和分化及表皮炎癥浸潤。結(jié)合前期研究［7?8］和本研究結(jié)果，我們推測IL?22可能通過MAPK?ERK1/2和JAK2/STAT3這兩條信號通路影響CCL27表達。在銀屑病患者皮損中，CCL27與其受體CCR10結(jié)合，在銀屑病的角質(zhì)形成細胞和淋巴細胞的相互作用中繼續(xù)發(fā)揮作用，從而刺激表皮角質(zhì)形成細胞的異常增殖、分化及炎癥浸潤［11］，其具體機制有待進一步研究。