王瑩，孫二娜 ，隋馨瑤，趙亮,3，孫健，牛天嬌，張明，文鵬程*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083) 3(河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)研究中心，河北 三河，065200) 4(蒙牛高科乳制品(北京)有限責(zé)任公司，北京，101107) 5(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京，100048)

航天搭載是把菌株搭乘返回式衛(wèi)星送到太空，利用太空中特殊的環(huán)境誘變作用使菌株產(chǎn)生突變，主要是通過(guò)強(qiáng)輻射、微重力、高真空等太空綜合環(huán)境因素誘發(fā)其變異。因?yàn)榭臻g變異的突變頻率高、突變譜廣、變異幅度大同時(shí)變異性狀穩(wěn)定，所以航天誘變成為近年來(lái)發(fā)展迅速的新型微生物誘變育種技術(shù)[1]。航天誘變其有益突變可達(dá)2%～3%[2]，且有益變異的頻率比傳統(tǒng)的γ射線處理要明顯提高[3]。作為人工誘變的新途徑，航天誘變對(duì)豐富種質(zhì)資源、選育新品種具有重要的意義[4]。

嗜熱鏈球菌是原核微生物中的鏈球菌屬，是能夠利用乳糖的同型發(fā)酵生成乳酸的兼性厭氧菌，為革蘭氏陽(yáng)性菌[5]。嗜熱鏈球菌一般與德氏乳桿菌保加利亞亞種配合，作為發(fā)酵劑廣泛應(yīng)用于酸乳生產(chǎn)。嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸特性、代謝產(chǎn)物直接影響酸乳生產(chǎn)過(guò)程，以及風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等酸乳品質(zhì)。嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸速度快(主要在發(fā)酵前期產(chǎn)酸)，且能縮短凝乳時(shí)間[6]，提高生產(chǎn)效率，從而降低了酸乳的生產(chǎn)成本。菌株產(chǎn)生的胞外多糖不僅賦予酸乳特殊的風(fēng)味和口感，而且還能提高其穩(wěn)定性和持水性，從而減少酸乳在生產(chǎn)過(guò)程中穩(wěn)定劑的使用[7-8]。但是不同的嗜熱鏈球菌種直接會(huì)影響酸乳產(chǎn)品的質(zhì)量，而且不同的菌株發(fā)酵特性也有較大差異，所以篩選出優(yōu)良發(fā)酵性能的嗜熱鏈球菌是制備發(fā)酵劑及酸奶的基礎(chǔ)[9]。

嗜熱鏈球菌G2是從新疆奶疙瘩中篩選出的1株產(chǎn)酸快、凝乳早且黏度高的菌株，將其作為出發(fā)菌株并搭載神舟十一號(hào)返回式飛船進(jìn)行太空誘變處理，返回地面后進(jìn)行菌株分離純化，通過(guò)發(fā)酵及一系列產(chǎn)酸特性、產(chǎn)黏及產(chǎn)胞外多糖等指標(biāo)的研究，以期獲得具有優(yōu)良發(fā)酵性狀的突變株，并為優(yōu)良發(fā)酵劑菌種的選擇和發(fā)酵乳制品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

嗜熱鏈球菌G2凍干菌粉置于無(wú)菌搭載小管中，搭載前4 ℃保存。“神舟十一號(hào)”返回式飛船2016年10月17日發(fā)射，2016年11月18日返回地面，飛行過(guò)程中樣品置于飛船返回艙，返回地面后取出樣品，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院功能乳品實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 培養(yǎng)基

10%復(fù)原脫脂乳用于菌株發(fā)酵試驗(yàn)，M17培養(yǎng)基用于嗜熱鏈球菌的分離純化。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋；LXJ-IIB高速臺(tái)式離心機(jī)；UV-2102PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；DNP9082恒溫培養(yǎng)箱 ；SNB-2黏度計(jì)；pH計(jì)；Biocreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀；JEM 1200EX透射電子顯微鏡；SU8010場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品分離純化[10]

搭載返回的G2凍干菌粉在無(wú)菌條件下稱取0.1 g菌粉至9.9 mL生理鹽水中，以10倍稀釋法從10-1稀釋到10-10，取5個(gè)稀釋梯度10-4～10-8，分別吸取稀釋液各1 mL，進(jìn)行平板稀釋，每個(gè)梯度做2個(gè)平行。平板在恒溫培養(yǎng)箱中42 ℃培養(yǎng)48 h，隨機(jī)挑選10個(gè)單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。在M17平板上進(jìn)行多次劃線純化并挑取單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種，進(jìn)行液體培養(yǎng)，作為搭載菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 脫脂乳培養(yǎng)基制備

10%脫脂乳粉10 mL于試管中，110 ℃滅菌10 min備用，將M17培養(yǎng)基培養(yǎng)的第2代菌接種于脫脂乳培養(yǎng)基待測(cè)。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定[11]

菌種以2%的接種量接種于新鮮的M17液體培養(yǎng)基中，42 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)、600 nm處測(cè)定菌液的吸光度值。

1.2.4 pH值測(cè)定[12]

用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。

1.2.5 酸度測(cè)定[13]

以0.5%酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用吉爾涅爾度(°T)表示。樣品取3個(gè)平行，取其平均值。

1.2.6 黏度測(cè)定[14]

采用SND-2黏度計(jì)在室溫下測(cè)定。讀數(shù)選擇停留時(shí)間較長(zhǎng)且偏大的數(shù)值記錄。樣品取3個(gè)平行，取其平均值。

1.2.7 活菌數(shù)測(cè)定[15]

吸取1 mL發(fā)酵液至9 mL 0.8%生理鹽水中，振蕩混勻后采用10倍稀釋，吸取1 mL稀釋液進(jìn)行平皿傾注，42 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，以測(cè)定發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)。

1.2.8 胞外多糖的分離與含量測(cè)定[16]

胞外多糖的提?。簩⒌诙尤?0%脫脂乳培養(yǎng)基中，發(fā)酵12 h，取10 mL發(fā)酵乳加入15%三氯乙酸，4 ℃下放置3 h，10 000 r/min離心30 min，取上清液備用。取上清液加入無(wú)水乙醇(1∶5,V∶V)，4℃放置12 h；將上清液與無(wú)水乙醇的混合液10 000 r/min離心30 min，棄上清，加入10 mL蒸餾水，即為待測(cè)樣品。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量；測(cè)定時(shí)吸取樣品1 mL，加入5%苯酚1 mL迅速搖勻，再加入5 mL濃硫酸冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.9 電鏡測(cè)試

1.2.9.1 掃描電鏡測(cè)試

取樣：取大量樣品離心(轉(zhuǎn)速 3 000～4 000 r/min)，去除上清液，加入適當(dāng) pH(7.2～7.4)的0.1 mol/L PBS清洗3遍；清洗時(shí)菌體溫柔懸浮。固定：2.5%戊二醛固定3 h，用PBS清洗2遍，每遍10 min，再用純水清洗2遍。梯度脫水：用乙醇的水溶液按體積分?jǐn)?shù)為 30%、50%、70%、80%、90%的梯度對(duì)樣品進(jìn)行脫水，每步 15 min，之后在100%乙醇的水溶液中脫水 15 min×2次；再將樣品置于乙醇和叔丁醇 1∶1(V∶V)混合液中15min；最后置樣品于叔丁醇中 15 min×2次。冷凍干燥：滴加處理好的樣品于5×5 mm的蓋玻片上，置-80 ℃冰箱冷凍后放入冷凍干燥機(jī)(或者臨界點(diǎn)干燥儀)中冷凍干燥。電鏡觀察：樣品充分干燥后，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.2.9.2 透射電鏡測(cè)試

取樣：取大量樣品離心(轉(zhuǎn)速 3 000～4 000 r/min)，去除上清液，加入適當(dāng) pH(7.2～7.4)的0.1 mol/L PBS清洗3遍；清洗時(shí)菌體溫柔懸浮。固定：2.5%戊二醛固定3 h，用PBS清洗2遍，每遍10 min。再用純水清洗2遍。梯度脫水。用乙醇的水溶液按體積分?jǐn)?shù)為 30%、50%、70%、80%、90%的梯度對(duì)樣品進(jìn)行脫水，每步 15 min，之后在100%乙醇的水溶液中脫水15 min×2次；再將樣品置于乙醇和叔丁醇 1∶1(V∶V)混合液中15 min；最后置樣品于叔丁醇中15 min×2次。之后進(jìn)行電鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，使用SPSS19.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，采用 ANOVA 進(jìn)行方差分析，采用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線

42 ℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h在600 nm處測(cè)定菌液的吸光度值。它能夠顯示細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的4個(gè)時(shí)期，即調(diào)整期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期[17-18]。通過(guò)利用紫外分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定菌液生長(zhǎng)曲線能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控菌體的生長(zhǎng)情況[19]。從表1和圖1可以看出，航天誘變得到的突變菌株B1-5、B2-1和B2-4生長(zhǎng)狀況與野生菌株G2大致相似，并沒(méi)有發(fā)生明顯改變，但是B1-1、B1-2、B1-3、B2-2、B2-5、B2-6和B2-7 OD600顯著低于野生菌株G2。因此，將B1-5、B2-1和B-4作為后續(xù)試驗(yàn)待測(cè)菌株。

表1 搭載菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定(OD600)Table 1 OD600 value within 24 h of Streptococcus thermophiles

注：同列字母不同，表示差異顯著(p<0.05)。

圖1 四株嗜熱鏈球菌發(fā)酵期間pH值的變化Fig.1 Change in pH during fermentation

2.2 pH值測(cè)定

嗜熱鏈球菌作為常用的乳酸菌發(fā)酵劑之一，能夠利用脫脂乳中的乳糖進(jìn)行同型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，從而使發(fā)酵乳中的pH降低,滴定酸度升高。由圖2可知，在發(fā)酵前4 h內(nèi)突變株與野生株的pH變化不大，主要是由于在4 h內(nèi)菌株正在處于延滯期，菌體活力較低，還沒(méi)有開始生長(zhǎng)[20]。從8 h開始，各菌株pH有所差異。當(dāng)發(fā)酵到12 h時(shí)，G2發(fā)酵乳平均pH值從pH 6.46下降到pH 4.46，B1-5、B2-1和B2-4發(fā)酵乳的平均pH值分別從pH 6.45、pH 6.48和pH 6.52分別下降到pH 4.66、pH 4.27和pH 4.25，其中B2-1和B2-4的發(fā)酵乳平均pH值顯著低于野生菌株G2(p<0.05)；到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)24 h時(shí)，G2發(fā)酵乳平均pH值下降到pH 4.35，3株突變株發(fā)酵乳平均pH值下降到pH 4.25、pH 4.09和pH 4.18，與野生株均沒(méi)有顯著性差異(p<0.05)。

圖2 四株嗜熱鏈球菌發(fā)酵期間滴定酸度的變化Fig.2 Change in sample acidity during fermentation

2.3 滴定酸度測(cè)定

由圖3可知，在發(fā)酵4 h時(shí)，野生株G2的滴定酸度從10 °T上升到40 °T，突變株B1-5、B2-1和B2-4的滴定酸度分別從15、20、20 °T升高到36、51、47 °T，且在4 h時(shí)發(fā)酵乳開始凝乳，利用乳糖生成乳酸使得酸度開始積累。當(dāng)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)24 h時(shí)，G2的滴定酸度達(dá)到92 °T，而突變株的滴定酸度分別是87.5、106和98.5 °T，且各菌株之間滴定酸度具有顯著性差異(p<0.05)。同時(shí)，從表2可知，B2-1的產(chǎn)酸速率最大，達(dá)到3.58 °T/h。

圖3 四株嗜熱鏈球菌發(fā)酵期間黏度的變化Fig.3 Change in sample viscosity during fermentation

表2 嗜熱鏈球菌發(fā)酵終點(diǎn)滴定酸度及產(chǎn)酸速率Table 2 Titration acidity at the end of the fermentation and acid-producing rate of Streptococcus thermophilus

注：同列字母不同，表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 活菌數(shù)測(cè)定

活菌數(shù)是評(píng)價(jià)發(fā)酵乳制品的重要指標(biāo)之一，同時(shí)也是篩選優(yōu)良發(fā)酵劑的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[21]。當(dāng)乳酸菌的活菌數(shù)大于106CUF/mL時(shí)，才會(huì)有乳酸菌在腸道中存活而發(fā)揮其保健作用[22]。從表3看出，嗜熱鏈球菌在發(fā)酵至24 h期間活菌數(shù)都有不同程度的上升，說(shuō)明在發(fā)酵期內(nèi)，菌株活力良好。在發(fā)酵至16 h時(shí)，嗜熱鏈球菌數(shù)量基本保持穩(wěn)定。

2.5 黏度測(cè)定

在酸乳發(fā)酵過(guò)程中，嗜熱鏈球菌可以通過(guò)酶的作用利用脫脂乳中的糖類形成一種活性物質(zhì)胞外多糖(EPS)，它是酸乳中天然的增稠劑，它與EPS達(dá)到含量呈正相關(guān)[23]。圖4可以看出，黏度隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵0～4 h期間，pH和滴定酸度變化較小,黏度變化不大，當(dāng)發(fā)酵8 h時(shí)，其pH下降到4.6左右，酪蛋白達(dá)到了等電點(diǎn)開始發(fā)生變性，酪蛋白分子團(tuán)的直徑變大，黏度開始上升[24]。從圖中看可以看出，突變株B2-1和B2-4的黏度顯著高于野生株G2。

表3 菌株發(fā)酵期間活菌數(shù)的變化Table 3 Changes in viable cell count during fermentation

注：同列字母不同，表示差異顯著(p<0.05)。

圖4 三株嗜熱鏈球菌胞外多糖含量Fig.4 Contents of EPS in Streptococcus thermophiles

2.6 胞外多糖含量測(cè)定

有報(bào)道稱胞外多糖具有改善腸道微環(huán)境、增強(qiáng)人體免疫力等多種生理功能，能夠提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)保健功能[25-26]。而嗜熱鏈球菌是酸乳發(fā)酵過(guò)程中主要的產(chǎn)多糖菌株[27]。從圖5中可知，突變株B1-5、B2-1和B2-4中的胞外多糖含量為396.14、409.35和398.80 mg/L，顯著高于野生株G2的含量385.11 mg/L(p<0.05)。胞外多糖能夠使酪蛋白分子之間更容易形成大分子，使分子直徑變大，從而增加黏度，改善酸乳品質(zhì)[24]。

圖5 野生株(左)與突變株(右)掃描電鏡(SEM)形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Microcopic observation under scanning electron microscopy

圖6 野生株(左)與突變株(右)透射電鏡(TEM)形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Microcopic observation under transmission electron microscopy

2.7 電鏡測(cè)試

嗜熱鏈球菌菌落表面比較光滑，為白色或者淡黃色，革蘭氏染色均呈陽(yáng)性。通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡可以看到，嗜熱鏈球菌以2個(gè)卵圓型為1對(duì)的球菌連成長(zhǎng)鏈。本試驗(yàn)中的野生株與突變株在形態(tài)上沒(méi)有明顯差異。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)來(lái)自航天誘變的10株嗜熱鏈球菌進(jìn)行篩選并進(jìn)行脫脂乳培養(yǎng)基42 ℃ 24 h發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵期間的pH值、滴定酸度、活菌數(shù)、黏度及胞外多糖含量等指標(biāo)，分析了4株嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)酸特性，初步篩選出1株優(yōu)良性狀的嗜熱鏈球菌。在42 ℃發(fā)酵期間，4株均在發(fā)酵開始后pH值迅速下降，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間約在12 h；其中突變株B2-1的pH值下降到4.09，滴定酸度為106 °T，且產(chǎn)酸速率最快，黏度及胞外多糖含量也顯著高于野生菌株G2，但是在發(fā)酵期間活菌數(shù)變化不大。因此，通過(guò)航天誘變有可能改變嗜熱鏈球菌的發(fā)酵性能，從而得到具有優(yōu)良性狀的菌株，為乳制品開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。