馬玉，張龍，陳旭升，毛忠貴

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一種由放線菌生產(chǎn)的氨基酸同型聚合物，由25～35個(gè)L-賴氨酸殘基通過(guò)α-羧基與ε-氨基形成的ε-酰胺鍵連接而成[1]。ε-聚賴氨酸的水溶性好、熱穩(wěn)定性高，在中性和偏酸性條件下對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、酵母及其他真菌、病毒都有抑制作用，抗菌譜廣，為綠色生物防腐劑[2]。ε-聚賴氨酸由白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)發(fā)酵生產(chǎn)。關(guān)于ε-PL的提取，目前主要是采用離子交換技術(shù)和膜技術(shù)進(jìn)行分離，之前所有提取工藝的核心步驟均是離子交換樹(shù)脂，膜技術(shù)只是在固液分離方面有所應(yīng)用。最具借鑒意義的是2003年美國(guó)FDA公布的ε-PL提取工藝[3]。采用0.10 μm的微濾膜過(guò)濾作為固液分離方式，收集透過(guò)液經(jīng)過(guò)一道色譜層析(文件中未提及該色譜類型)，隨后使用三道離子交換柱進(jìn)行分離和精制，三道離子交換的順序依次為弱酸樹(shù)脂、強(qiáng)堿樹(shù)脂和強(qiáng)酸樹(shù)脂，將經(jīng)過(guò)三道離子交換的料液進(jìn)行活性炭除雜，最后經(jīng)過(guò)濃縮干燥得到ε-PL樣品。該工藝采用微濾膜進(jìn)行過(guò)濾，降低了離子交換樹(shù)脂污染的風(fēng)險(xiǎn)，最終可獲得高純度樣品，但該提取工藝關(guān)鍵的色譜、樹(shù)脂類型及使用條件沒(méi)有詳細(xì)的闡明，而且ε-PL的發(fā)酵液黏度大，幾乎不可能采用微濾膜直接過(guò)濾，推測(cè)該固液分離方式可能是針對(duì)固定化發(fā)酵模式，同時(shí)整個(gè)工藝操作程序繁瑣，收率不高。

國(guó)內(nèi)最近的關(guān)于ε-PL提取工藝是2015年甄斌提出的ε-PL絮凝劑提取工藝[4]。調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至1.5后加入絮凝劑，充分絮凝后使用板框過(guò)濾，收集過(guò)濾液依次進(jìn)行微濾和超濾，收集透過(guò)液，調(diào)節(jié)pH至8.5后使用弱酸陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附和洗脫，洗脫液調(diào)節(jié)pH至7.0進(jìn)行大孔樹(shù)脂SX-8脫色，脫色液使用1 kDa超濾脫鹽并收集截留液，最后使用冷凍干燥獲得樣品。過(guò)濾依次采用板框過(guò)濾、微濾和超濾，最終獲得十分澄清的料液，消除了樹(shù)脂污染的風(fēng)險(xiǎn)，采用大孔樹(shù)脂脫色大幅度降低了該步驟的ε-PL損失率，但最終獲得產(chǎn)品純度不高，并且同樣出現(xiàn)操作程序繁瑣的問(wèn)題?？紤]到ε-聚賴氨酸提取投資大、成本高、價(jià)格昂貴，限制了ε-PL的廣泛應(yīng)用。因此，對(duì)ε-PL分離提取方法進(jìn)一步的探索研究是有重要意義的。

查閱相關(guān)資料，目前還沒(méi)有關(guān)于利用雙水相技術(shù)來(lái)初步萃取ε-PL的詳細(xì)研究。雙水相萃取技術(shù)是指一種或幾種物質(zhì)以適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)溶解在水中，在一定的條件下形成互不相溶的水溶液體系，如聚合物/聚合物/水、聚合物/無(wú)機(jī)鹽/水、聚合物/有機(jī)鹽/水、表面活性劑/表面活性劑/水、小分子有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽/水等體系[5]。雙水相萃取技術(shù)具有萃取條件溫和、處理量大、萃取率高、兩相分離快、能耗低、設(shè)備投資少等優(yōu)點(diǎn)，有望在生物化工、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域得到應(yīng)用[6]。本文深入研究了乙醇/硫酸銨雙水相體系對(duì)提取ε-PL的影響，雜質(zhì)的去除情況，并探究了多次萃取效果，嘗試研究出一條簡(jiǎn)便高效的ε-PL提取工藝路徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵液由本實(shí)驗(yàn)室自己提供，制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)[7]；聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，鄭州拜納佛生物工程有限公司；無(wú)水乙醇，分析純級(jí)，甲基橙，考馬斯亮藍(lán)G250以及其他一些藥品皆為分析純級(jí)別。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；切向超濾系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；AR224CN分析天平，奧豪斯儀器有限公司；FE20 pH計(jì)，瑞士 Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 ε-PL在雙水相體系中的分配系數(shù)篩選

發(fā)酵液先經(jīng)過(guò)14 000×g離心，除去菌體，保留上清液在4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ? g無(wú)機(jī)鹽，18 g離心清液體和6 g有機(jī)溶劑，漩渦振蕩5 min混勻，室溫靜置2 h。使用該方法比較不同雙水相體系對(duì)ε-PL的分離效果。其中ε-PL在上相濃度Ct和下相濃度Cb之比為ε-PL的分配系數(shù)(K)。

1.2.2 乙醇/硫酸銨雙水相相圖

采用濁度滴定法來(lái)獲得乙醇/硫酸銨雙水相相圖。將小三角瓶置于分析天平上，調(diào)零；加入一定量的50%濃度的硫酸銨溶液，記錄重量后調(diào)零；接著加入一定量的無(wú)水乙醇，邊振蕩邊滴加，直到混合物出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，顯示溶液中已經(jīng)形成不相容的兩相，記錄重量后調(diào)零；接著向混合物中加入去離子水直到溶液變澄清，表明水溶液已經(jīng)變成單相，記錄水重量后調(diào)零；接著再一次滴加無(wú)水乙醇，重復(fù)上述步驟。累計(jì)到一定數(shù)目的點(diǎn)后，分別以硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，得到乙醇/硫酸銨雙水相相圖[8]。

(1)

(2)

式中：ω1和ω2分別表示無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m1、m2和m3分別表示無(wú)水乙醇、硫酸銨和水的質(zhì)量。

考慮到ε-PL對(duì)相分離的影響作用，硫酸銨直接加入到ε-PL標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，按照上面提到的濁度滴定法獲得相圖。

1.2.3 乙醇和硫酸銨濃度對(duì)ε-PL分配系數(shù)的影響

取硫酸銨6 g加入到經(jīng)過(guò)離心后的發(fā)酵液中(pH 9.50)，硫酸銨最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。接著，加入無(wú)水乙醇構(gòu)建雙水相萃取ε-PL，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍20%～26.7%(該范圍外的濃度無(wú)法形成雙水相體系)，使用該方法來(lái)考察不同的乙醇濃度對(duì)ε-PL分配系數(shù)的影響。同樣的，在體系中維持20%的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，向體系中加入不同量的硫酸銨，使硫酸銨最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%～26.7%(該范圍外的濃度無(wú)法形成雙水相體系),考察不同硫酸銨濃度對(duì)分配系數(shù)的影響。

計(jì)算色素的去除率和蛋白質(zhì)的去除率，發(fā)酵液中原來(lái)總的色素量減去上相中的色素含量除以總的色素量為色素去除率，蛋白質(zhì)去除率的定義與之相同[9]。

1.2.4 乙醇和硫酸銨濃度的測(cè)定

硫酸銨濃度的測(cè)定依據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。乙醇濃度依據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 pH對(duì)ε-PL的分配系數(shù)的影響

以20%的硫酸銨和20%的無(wú)水乙醇構(gòu)建雙水相體系，考慮到調(diào)節(jié)pH時(shí)，無(wú)水乙醇會(huì)產(chǎn)生一定干擾[12]，所以硫酸銨溶于發(fā)酵液清液后，即用NaOH溶液調(diào)節(jié)該溶液pH值，溶液pH值依次為5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0?？疾觳煌膒H對(duì)ε-PL在雙水相體系中分配系數(shù)的影響。同時(shí)計(jì)算色素和蛋白質(zhì)去除率，以及ε-PL的回收率。

1.2.6 多次萃取的比較

在最佳的萃取條件下(硫酸銨和乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%和20%，pH 9.5，25 ℃),進(jìn)行第1次萃取。之后，向第1次萃取的上相加入相同體積并且組成成分相同的新鮮下相進(jìn)行第2次萃取，混合物振蕩5 min，靜置2 h待兩相分離。下面幾次萃取按照相同的方法進(jìn)行[13]。

1.2.7 分析方法

ε-PL濃度測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]方法。HPLC檢測(cè)純度采用文獻(xiàn)[14]的方法，TSK gel ODS-120T 色譜柱(φ 6 mm×25 cm),紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫40 ℃，流動(dòng)相為K2HPO41.7 g和Na2SO41.42 g溶于800 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.4后，用水定容至1 000 mL，取920 mL加入80 mL乙腈，進(jìn)樣量為20 μL。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[16]，色素測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[17]。分配系數(shù)(K)，ε-PL收率(Y)，Vr體積比按公式(3)、(4)和(5)計(jì)算：

乙醇/硫酸銨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%/20%)萃取ε-PL形成的雙水相圖1 ε-PL在乙醇/硫酸銨雙水相體系中的分配()Fig.1 Partitioning of ε-PL in aqueous two-phase system

(3)

(4)

(5)

式中:Ct和Cb分別代表的是上、下相中ε-PL的濃度;Vt和Vb分別代表上、下相的體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL在雙水相體系中的分配情況

表1表示的是ε-PL在雙水相體系有機(jī)相/無(wú)機(jī)鹽中的分配系數(shù)。

由表1可以知道，在乙醇/硫酸銨雙水相體系中ε-PL的分配系數(shù)要高于其他雙水相體系，達(dá)到18.27，收率為97.89。大部分的雙水相體系中，ε-PL的分配系數(shù)值的范圍為0.40～1.60之間。結(jié)果表明，相比較其他雙水相體系，在乙醇/硫酸銨雙水相體系中，ε-PL主要分配于上相，更容易回收。

表1 ε-PL在不同的雙水相體系中的分配系數(shù)(25℃,有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%/20%)Table 1 Partitions coefficients of ε-PL in different organic solvent/salt system

注：“-”表示體系不形成雙水相。

目前，相關(guān)資料文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系形成主要影響因素為有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽性質(zhì)，其次體系的溫度、pH值等外界因素也有一定的影響[18]。初步判斷，在溶液中，無(wú)機(jī)鹽會(huì)和有機(jī)溶劑競(jìng)爭(zhēng)水分子[18]。因此，水化能力較強(qiáng)的無(wú)機(jī)鹽更易爭(zhēng)奪水分，形成較強(qiáng)的相分離能力，即形成雙水相體系。在ε-PL的萃取實(shí)驗(yàn)中，可以基本得出雙水相形成能力的大小依次為：(NH4)2SO4、NaH2PO4、KCl、NaCl、Na3PO4，這與文獻(xiàn)中得到的結(jié)果相一致[19]。而相同的，極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性聚集更多的水分子。這也就能理解為什么乙醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系更易形成雙水相的狀態(tài)。而對(duì)于甲醇和其他一些無(wú)機(jī)鹽形成雙水相一般是比較困難的，這主要是因?yàn)榧状己退肿又g有很強(qiáng)的親和力，互溶能力強(qiáng)，不能形成雙水相。這也是其他有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽無(wú)法形成雙水相體系的原因，當(dāng)然，無(wú)機(jī)鹽的離子形式也有一定的影響。目的物ε-PL是一種親水性的聚合物，乙醇/無(wú)機(jī)鹽形成的雙水相中，乙醇相比較與其他有機(jī)溶劑有著更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)水分子的能力，所以該類體系中上相的水分子更多，所以ε-PL更易分配于上相，從表1數(shù)據(jù)結(jié)果也可以看到，乙醇/硫酸銨，乙醇/磷酸二氫鈉形成的雙水相體系，ε-PL的分配系數(shù)和收率都比其他形成的雙水相體系結(jié)果要高，尤其是乙醇/硫酸銨雙水相體系的萃取能力與效果更強(qiáng)。

考慮到硫酸銨價(jià)格便宜，而乙醇的安全性能相對(duì)高等綜合因素，因而選擇乙醇/硫酸銨雙水相體系作為下一步實(shí)驗(yàn)的萃取ε-PL體系研究對(duì)象。

2.2 乙醇/硫酸銨雙水相相圖

為了研究合適的相組成比例，分別以ε-PL溶液和去離子水作為溶劑得出了乙醇/硫酸銨雙水相相圖。如圖2所示，在ε-PL溶液中得到的雙水相相圖，在相同的硫酸銨濃度條件下，乙醇濃度要比在去離子水中得到的雙水相相圖略微低一些，主要因?yàn)棣?PL的存在加強(qiáng)了兩相的形成。雙水相的形成不僅與成相有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽性質(zhì)有關(guān)，還與體系的pH值、溫度等外界條件有關(guān)。目前對(duì)于這一體系的相分離解釋主要是無(wú)機(jī)鹽，有機(jī)溶劑與水分子締合競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果[18]，在這里ε-PL的存在可能加強(qiáng)了這種締合競(jìng)爭(zhēng)的作用。由于相分離影響因素很多，所以這類體系的具體形成機(jī)理還有待進(jìn)一步探索。

圖2 乙醇/硫酸銨雙水相相圖Fig.2 Effect of ε-PL on phase diagram of ethanol/ammonium sulfate

圖3表示的是在乙醇/硫酸銨雙水相體系中成相位置，M為成相點(diǎn)，乙醇/硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%/20%，pH9.5。靜置分層形成兩相后，兩相中的乙醇和硫酸銨含量出現(xiàn)較大的變化。T代表上相中的乙醇和硫酸銨質(zhì)量組成，B代表下相中乙醇和硫酸銨的質(zhì)量組成情況，上相中乙醇和硫酸銨的含量分別為38.78%和8.12%。而下相中乙醇和硫酸銨含量分別為8.82%和27.31%。此時(shí)，ε-PL主要分配在上相。這可能主要是因?yàn)橄孪嘀杏捎跓o(wú)機(jī)鹽濃度較高，產(chǎn)生鹽析作用使ε-PL溶解度降低，所以不易分配于下相。其次ε-PL等電點(diǎn)為9.0[14]，在pH9.5時(shí)，ε-PL大都以電中性和少量負(fù)電狀態(tài)存在，而體系中由于電離作用，無(wú)機(jī)鹽產(chǎn)生的陰、陽(yáng)離子在兩相中進(jìn)行分配最終達(dá)到平衡時(shí)，會(huì)在上下相之間產(chǎn)生電位差，會(huì)驅(qū)使ε-PL分配于上相。點(diǎn)M為整個(gè)系統(tǒng)的組成，當(dāng)M點(diǎn)向下移動(dòng)時(shí)，系線長(zhǎng)度TB縮短，兩相差別減小，當(dāng)系線為零時(shí)，兩相差別消失而成為一相，即不分相。對(duì)于雙水相體系的形成，根本原因可能是因?yàn)閮上鄻O性大小產(chǎn)生差異，所以體系發(fā)生分離產(chǎn)生兩相，沒(méi)有互溶。介電常數(shù)通常用來(lái)預(yù)測(cè)溶液的極性性質(zhì)[20]，在實(shí)驗(yàn)中上相主要為38.87%的乙醇，其介電常數(shù)大約為60 F/m，而對(duì)于下相主要為27.31%的無(wú)機(jī)鹽溶液，其介電常數(shù)大約為78 F/m。可以看出上下相之間極性出現(xiàn)差異，產(chǎn)生兩相。對(duì)于雙水相的成相原因還有其他文獻(xiàn)給出一些解釋[7]。同時(shí)，根據(jù)“相似相溶”的原理，目的物極性大小可能更接近于上相，所以更易分配于上相。

M-成相點(diǎn)；T-上相組成；B-下相組成圖3 乙醇/硫酸銨雙水相相圖和成相點(diǎn)Fig.3 The phase diagram and phase point of the aqueous phase carbonate ATPS

2.3 乙醇和硫酸銨濃度對(duì)ε-PL分配系數(shù)的影響

在固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的條件下，探究硫酸銨濃度對(duì)ε-PL分配系數(shù)和收率的影響。如圖4所示，隨著硫酸銨濃度的增加，ε-PL的分配系數(shù)(K)先減小后增大。這主要是因?yàn)殡S著體系硫酸銨濃度的增加,硫酸銨和乙醇競(jìng)爭(zhēng)水分子，上相中水的含量遞減，下相中水的含量增加，而ε-PL是親水性的物質(zhì)，更易趨向于水含量較大的相，因此分配系數(shù)K出現(xiàn)降低趨勢(shì)。但隨著硫酸銨濃度繼續(xù)增加，由于鹽析作用影響越來(lái)越大，所以分配系數(shù)K會(huì)出現(xiàn)回升的現(xiàn)象。

圖4 硫酸銨對(duì)ε-PL分配系數(shù)和收率的影響Fig.4 Effect of ammonium sulfate on partition coefficients and recovery of ε-PL

同時(shí)，檢測(cè)了在不同硫酸銨濃度條件下，蛋白和色素的去除情況。如圖5所示，隨著硫酸銨濃度的增加，蛋白和色素的去除率在增加，但硫酸銨濃度的變化對(duì)它們的影響不明顯。在ε-PL的生產(chǎn)提取中，色素主要來(lái)源于兩個(gè)方面，一是有機(jī)氮源、滅菌過(guò)程中的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，另外就是產(chǎn)生菌自身分泌的色素物質(zhì)[21]，發(fā)酵液中的色素可能多以水溶性帶負(fù)電荷的非極性大分子色素為主，與ε-PL結(jié)合較為緊密[22]。推測(cè)隨著硫酸銨濃度增加導(dǎo)致下相競(jìng)爭(zhēng)的水分子含量增加，而色素和蛋白質(zhì)都具有一定的親水性，所以二者易趨向于下相，去除率有所提升。ε-PL的回收率(Y)先減小后增大與分配系數(shù)K呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，這主要是因?yàn)樵谡麄€(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，雙水相兩相的相體積比變化很小。

圖5 硫酸銨對(duì)色素和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.5 Effect of ammonium sulfate on the removal rate of protein and pigment

同理，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%條件下，探究乙醇濃度對(duì)ε-PL分配系數(shù)和收率的影響。如圖6所示，隨著乙醇濃度的增加，ε-PL的分配系數(shù)和收率均呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。這主要是因?yàn)?，隨著乙醇含量的增加，上相的乙醇含量占的比重增加，相對(duì)應(yīng)的在上相中的水分子含量在減少，這就會(huì)導(dǎo)致親水性的ε-PL在上相中的含量減少，所以出現(xiàn)分配系數(shù)減少的情況。又由于，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩相體積的相體積比率變化很小，所以ε-PL收率基本是隨著ε-PL分配系數(shù)的變化而變化。同時(shí)，可以看出隨著乙醇濃度的增加，蛋白質(zhì)和色素的去除率變化呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，如圖7所示，隨著乙醇濃度的增加，蛋白的去除率在減少，而色素的去除率略微增大。當(dāng)然，二者的去除率大約都在35%～40%之間，變化不大。

圖6 乙醇對(duì)ε-PL分配系數(shù)和收率的影響Fig.6 Effect of ethanol on partition coefficients and recoveries of ε-PL

圖7 乙醇對(duì)色素和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.7 Effect of ethanol on the removal rate of protein and ε-PL

綜上所述，可以得出在乙醇/硫酸銨雙水相體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度為20%/20%條件下，可以獲得最大的ε-PL分配系數(shù)和收率，而對(duì)于繼續(xù)降低乙醇/硫酸銨體系濃度無(wú)法形成雙水相。因此，選擇乙醇/硫酸銨體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%/20%進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

2.4 pH值對(duì)ε-PL分配系數(shù)的影響

圖8-b表示的是不同pH條件下,蛋白和色素去除率的變化情況?？梢钥吹絧H的變化對(duì)色素的去除率影響不大，而對(duì)蛋白的去除作用影響較大。前文中已提到，發(fā)酵液中的色素可能多以水溶性帶負(fù)電荷的非極性大分子色素為主，與ε-PL結(jié)合較為緊密[22]。ε-PL的等電點(diǎn)為9.0左右[14]，隨著pH的增加，ε-PL的帶電狀態(tài)也在變化，但整體而言還是多以電中性居多，少量帶有負(fù)電荷，所以色素和ε-PL的結(jié)合量仍然較多，所以pH的變化對(duì)色素的去除影響不大。對(duì)于發(fā)酵液中的雜蛋白，推測(cè)多為堿性蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量分布在6.64萬(wàn)以下，1.43萬(wàn)以下分子質(zhì)量約占1/4，最后基本通過(guò)后續(xù)的膜技術(shù)去除掉[22]。所以蛋白質(zhì)去除率在增加，這應(yīng)該是由于pH的逐步增加，改變了許多堿性蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，使得蛋白質(zhì)分布發(fā)生變化，最終導(dǎo)致了蛋白質(zhì)去除率的改變。

圖8 不同pH條件下ε-PL分配系數(shù)和收率的變化情況Fig.8 (a) Effect of pH on partition coefficients and recovery of ε-PL and on the removal rate of protein and pigment

綜上可得，最佳的ε-PL雙水相萃取條件，乙醇/硫酸銨體系，質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度分別為20%/20%，在pH為9.5條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

2.5 多級(jí)萃取

為了考察對(duì)蛋白和色素等雜質(zhì)的進(jìn)一步去除效果，在前面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出來(lái)的最佳條件下進(jìn)行了多級(jí)萃取，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，pH 9.5條件下，進(jìn)行萃取。已知經(jīng)過(guò)一步萃取，蛋白去除率達(dá)到57.23%,色素去除率37.68%。分離出經(jīng)過(guò)第1次萃取的上相，在保持萃取的最優(yōu)雙水相體系乙醇/硫酸銨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%/20%)條件下，加入新的構(gòu)成相同的下相，進(jìn)行第2次萃取。收集第2次萃取的上相，加入新鮮構(gòu)成相同的下相，進(jìn)行第3次萃取，同樣的，依次進(jìn)行下面的萃取。

表2 利用雙水相對(duì)ε-PL多級(jí)萃取結(jié)果(25 ℃)Table 2 Multi-stage extraction of sodium carbonate/ethanol ATPS(25 ℃)

注：表中萃取0次，即起始的發(fā)酵液上清。

由表2可知，隨著萃取次數(shù)的增加，ε-PL的分配系數(shù)在減小，另外由于兩相體積比也在略微減少，可以看出ε-PL的收率也在減小，當(dāng)進(jìn)行第4次萃取時(shí)，收率減少到92.01%。可以看出，當(dāng)進(jìn)行完第4次萃取時(shí)，損失率明顯加大，然而蛋白和色素去除率并沒(méi)有明顯的增加。發(fā)酵液中雜蛋白多以堿性蛋白為主[22]，經(jīng)過(guò)3次最優(yōu)條件下萃取，可以說(shuō)基本被去除掉，所以進(jìn)行第4次萃取時(shí)蛋白的去除率變化很小了。而對(duì)于其中的色素，前文也已提到，色素多以水溶性帶負(fù)電荷的非極性大分子色素為主，一般與目的物ε-PL結(jié)合的較為緊密，所以可以看出，在每一次的萃取過(guò)程中色素的去除率都不高[22]。但是，每一次構(gòu)建新的雙水相體系時(shí)，都會(huì)引入新鮮的去離子水，而色素又具有一定的親水性，所以隨著萃取次數(shù)增加，色素也得到一定的去除，在進(jìn)行3次萃取后，與ε-PL結(jié)合不是很緊密的色素基本得到了去除，當(dāng)再進(jìn)行第4次萃取時(shí)，與ε-PL結(jié)合很緊密的色素去除基本很少了。因此，鑒于以上原因，采用該雙水相體系萃取ε-PL的最佳次數(shù)為3次。而對(duì)于每次萃取乙醇的損失率大約在31%，損失較大，后期可以通過(guò)蒸餾等方法進(jìn)行回收。

2.6 HPLC分析

通過(guò)液相分析可以得知，經(jīng)過(guò)3次萃取可以去除大部分雜質(zhì)。圖9-c表示的是起始發(fā)酵液液相圖，通過(guò)對(duì)比可以得出，雜質(zhì)主要分配于下相被去除(圖9-a所示)，最后ε-PL主要被分配在上相，占主要成分被收集(圖9-b所示)，雜質(zhì)的含量在逐漸減少。通過(guò)液相圖9-a可以看出，在第3次萃取時(shí)，ε-PL在下相中的含量要明顯高于第1次和第2次萃取的下相，說(shuō)明ε-PL的損失率在持續(xù)增加，根據(jù)表2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)也可以得到證明，最后在進(jìn)行第4次萃取時(shí)的ε-PL損失接近9%，損失率進(jìn)一步增大。因此，進(jìn)行3次萃取是獲得ε-PL的較好方案。

a-每次萃取下相的液相圖(215 nm)；b-每次萃取上相的液相圖(215 nm)；c-發(fā)酵液的液相圖(215 nm)虛線表示ε-PL的出峰時(shí)間點(diǎn)圖9 3次萃取Fig.9 HPLC graphs of ε-PL from ATPE

收集經(jīng)過(guò)3次萃取之后的上相，利用前期工作篩選出的超濾膜進(jìn)一步脫鹽除雜，獲得超濾液可以進(jìn)行活性炭脫色并真空干燥最后獲得產(chǎn)品，如圖10-a所示。最后，ε-PL的收率和純度分別可以達(dá)到68.28%和92.39%。純度92.39%距國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)95%還有一點(diǎn)差距，主要雜質(zhì)是色素和雜蛋白，可以再通過(guò)去除色素和去蛋白的工作純化，需后續(xù)繼續(xù)研究。

a-本實(shí)驗(yàn)最后提取的干燥成品；b-符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的ε-PL合格樣品圖10 最后干燥成品Fig.10 The dry sample of the extracted ε-PL

3 總結(jié)

利用雙水相萃取技術(shù)可以很好的從發(fā)酵液中萃取回收ε-PL，本文中探究了多個(gè)有機(jī)溶劑/無(wú)機(jī)鹽的雙水相萃取體系，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得到乙醇/硫酸銨雙水相體系要優(yōu)于其他雙水相體系，并優(yōu)化了萃取條件，在pH 9.5,乙醇/硫酸銨質(zhì)量濃度分別為20%/20%條件下，1次萃取收率可以達(dá)到98%左右，分配系數(shù)達(dá)到18.33左右。在此基礎(chǔ)上探究了多次萃取的效果，并最終確定進(jìn)行3次萃取作為最佳方案，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)3次萃取后，雜質(zhì)被大量的去除，ε-PL被濃縮收集，收率達(dá)到96%左右，純度由最初的19.53%提升到40%左右。為了進(jìn)一步除雜脫鹽，收集3次萃取后的上相成分，利用超濾膜進(jìn)行脫鹽處理，最后的收率和純度分別達(dá)到68.28%和92.39%，蛋白質(zhì)和色素的去除率分別可以達(dá)到86.56%和60.01%。可見(jiàn)，雙水相萃取技術(shù)對(duì)于ε-PL的分離提取是個(gè)有價(jià)值的思路。