范 琪，馬彥妮，陳佰鴻，左存武，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

光與植物的正常生長(zhǎng)密不可分，它不僅是植物光合作用的原動(dòng)力，還能夠調(diào)控植物形態(tài)建成、生物周期節(jié)律、延緩植物衰老、物質(zhì)代謝以及基因的表達(dá)等過程[1-3]。

研究表明，藍(lán)光和紅光對(duì)植物的光形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育均有調(diào)節(jié)作用，但不同光質(zhì)對(duì)植物的作用效果不同，紅光能提高植物的光合效率并能促進(jìn)試管苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和不定根的形成[4]；此外，紅光能夠促進(jìn)植物形成愈傷組織，但當(dāng)其與藍(lán)光配比使用時(shí)，在一定范圍內(nèi)藍(lán)光比例越大導(dǎo)致葉片愈傷組織誘導(dǎo)率越低[5-6]。藍(lán)光能誘導(dǎo)植物葉片氣孔開啟，對(duì)葉綠素、碳水化合物和蛋白質(zhì)的形成以及光合節(jié)律等生理過程均有調(diào)控作用[7-8]。藍(lán)光不僅能促進(jìn)光合基因的表達(dá)，還有利于葡萄試管苗中白藜蘆醇的形成以及干物質(zhì)積累[9]。有報(bào)道認(rèn)為，組合光比單色光更能促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)，紅光和紅藍(lán)混合光能提高根系的誘導(dǎo)率，促使根系發(fā)育健壯[10]。然而，紅光與藍(lán)光配比比例對(duì)不同試管苗的作用效果不盡相同，因此，基因型不同的植物在不同發(fā)育階段對(duì)光質(zhì)的需求不同。

CONTANS(CO)是植物光周期途徑中的核心調(diào)控因子，是植物特有的多基因家族，在植物接收、傳導(dǎo)光信號(hào)的過程中，與植物其他光信號(hào)調(diào)控蛋白相互作用，以此調(diào)控植物一系列生理過程[11]。CO和CO-Like(COL)基因具有N端鋅指結(jié)構(gòu)B-box和C端CCT保守結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)對(duì)CO基因的功能具有重要作用[12]。在許多植物中發(fā)現(xiàn)了COL基因，擬南芥(Arabidopsisthaliana)有17個(gè)COL基因[13]，水稻(Oryzasativa)有16個(gè)[14]，番茄(LycopersiconesculentumMill.)中至少有4個(gè)基因[15]，而葡萄(VitisviniferaL.)中至少有14個(gè)推測(cè)的CO基因[16]。CO及COL在不同植物中的功能可能不同。在擬南芥中，COL1和COL2基因?qū)﹂_花時(shí)間無(wú)顯著影響[17]；COL3抑制植物開花，正調(diào)控?cái)M南芥光形態(tài)建成，促進(jìn)側(cè)根發(fā)育和芽的分化[18]；COL4受ABA和鹽脅迫的調(diào)節(jié)，是植物忍受非生物逆境脅迫中的重要調(diào)節(jié)因子[13]；短日照條件下COL5促進(jìn)植物開花[19]，而長(zhǎng)日照條件下COL9抑制開花[20]。

綜上，目前CO基因家族的研究主要集中于如何應(yīng)對(duì)非生物脅迫和響應(yīng)光周期從而調(diào)控植物開花的機(jī)制中[16]，但CO基因家族對(duì)不同光質(zhì)及轉(zhuǎn)光條件的響應(yīng)未見報(bào)道。本研究克隆獲得葡萄光質(zhì)應(yīng)答相關(guān)的基因CO4(葡萄CO4的分子式為C1253H1990N32403402S11)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同光質(zhì)處理下的表達(dá)規(guī)律，為葡萄光質(zhì)改良提供候選基因，并為深入研究葡萄試管苗感光機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為葡萄貝達(dá)(Vitisriparia×V.labrusca)試管苗，將其單芽莖段接種于GS[21]液體培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)于LED白光、紅光、藍(lán)光的人工氣候培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為28 ℃，220 μmol/(m2·s)光照16 h；23 ℃暗培養(yǎng)8 h。

DH5α、AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific(上海)公司；pGEM-Teasy載體、T4DNA、LigBuffer、普通PCR SuperMix購(gòu)自TaKaRa(大連)公司；Marker V購(gòu)自TransGen Biotech(北京)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 將在GS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的貝達(dá)試管苗放置于不同光質(zhì)及不同轉(zhuǎn)光條件下處理(表1)，35 d后用便攜式調(diào)制熒光儀(PAM-2100)在黑暗條件下測(cè)定試管苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，試管苗葉片總RNA的提取使用CTAB法[22]。

表1 不同光質(zhì)和轉(zhuǎn)光培養(yǎng)條件Tab.1 Treatment conditions of grape plantlets under different light conversion

1.2.2 基因克隆 PCR MIX、大腸桿菌菌株、pEASY-T1 Cloning Kit均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DL2000 Marker、DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)，熒光定量染料、SYBR Premix Ex Taq kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連 TaKaRa 公司。由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行引物的合成及測(cè)序。

葡萄CO4基因擴(kuò)增上游引物：5′-GCGGATCCATGGTAATTTTGTGTTTGTTATTAC-3′；下游引物：5′-GCGAGCTCAGTTACCTGACATA-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，與克隆載體pGEM-Teasy連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用X-gal和IPTG進(jìn)行篩選，選取單一菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過NCBI在線比對(duì)(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，篩選得到與其同源性較高的植物氨基酸序列，多序列比對(duì)用DNAMAN軟件完成，氨基酸序列同源性用Clustalx 1.83和MEGA 5.0軟件比較，然后用Maximum Likelihood法(參數(shù)為500)構(gòu)建進(jìn)化樹。

氨基酸分子量、殘基的數(shù)目、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)以及親、疏水性用Expasy工具(http：//ca.expasy.org/tools.protscale.htm)進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用SOPMA(http：//www.predictprotein.org/)進(jìn)行。蛋白質(zhì)跨膜域分析利用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)進(jìn)行。利用SignalP 4.1 server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽的分析。功能域分析使用InterPro：protein sequence analysis & classification(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行。

1.2.4 葡萄CO4基因在不同處理下的表達(dá)水平分析CO4上游引物：5′-TCTGTGCCGCTCTACC-3′；下游引物：5′-GCTCAACCTCCATCCC-3′，以葡萄看家基因UBQ為內(nèi)參基因。用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(LightCycler?96，Roche)分析不同處理后葡萄CO4基因表達(dá)水平。PCR總體系25 μL：1 μL cDNA模板，上下游引物分別0.8 μL，SYBR Green 熒光染料12.5 μL，ddH2O 9.9 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用軟件SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，分析差異顯著性使用Duncan法，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄CO4基因的克隆

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的貝達(dá)葡萄試管苗的總RNA，結(jié)果表明，條帶完整無(wú)降解，其純度契合本試驗(yàn)要求。以cDNA作為模板，設(shè)計(jì)特異性引物用于PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期蛋白(663 bp)相符合的驗(yàn)證序列。將陽(yáng)性菌液作為模板，擴(kuò)增出與目標(biāo)條帶大小一致的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)基因序列一致，GenBank登錄號(hào)為KY652090。

M. DNA Marker V；A-1、B-1.空白對(duì)照；A.葡萄CO4的目的條帶擴(kuò)增帶；B.葡萄CO4的菌液PCR擴(kuò)增帶。M.DNA Marker V；A-1，B-1.Blank control；A.Amplified target band of gene CO4；B.Bacteria PCR amplified band.

2.2 葡萄CO4基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 多序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建 本試驗(yàn)克隆得到1個(gè)葡萄CO4基因，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為747 bp，編碼248個(gè)氨基酸，包括1個(gè)起始密碼子ATG和1個(gè)終止子TGA(圖2)。

氨基酸序列同源性比對(duì)分析顯示(圖3)，葡萄CO4同其他物種相似度為76.11%，由高到低依次為可可樹(TheobromacacaoXP_007025812.1)為48.88%、棉花(GossypiumhirsutumL. KJB57663.1)為48.61%、山崳(EutremasalsugineumXP_006417372.1)同源性為48.59%、棗(ZiziphusjujubaMill. XP_015869465.1)為47.19%、大豆(GlycinemaxKHN00100.1)為39.34%、巨桉(EucalyptusgrandisXP_010052390.1)為38.70%、核桃(JuglansregiaAAY89231.1)為38.39%、油菜(BrassicanapusXP_013711185.1)為37.43%、木薯(ManihotesculentaOAY26084.1)為37.40%、醉蝶花(TarenayahasslerianaXP_010533861.1)為37.21%、擬南芥(ArabidopsisthalianaL. CAA39037.1)為37.16%、擬南芥(ArabidopsisthalianaL. NP_172592.1)為36.97%。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明，葡萄CO4基因含有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中，1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(Tyr21)，1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr236)，2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser85、Ser241)。

方框標(biāo)注為起始密碼子ATG及終止密碼子TGA；其中D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)為酸性氨基酸，K(賴氨酸)、R(精氨酸)和H(組氨酸)為堿性氨基酸，其余為中性氨基酸。The ATG start codon and TGA stop codon is marked in pane；Asp(D)and Glu(E)belong to acidic amino acids，Lys(K)，Arg(R)and His(H)are basic amino acids，and the rest of them are neutral amino acids.

方框標(biāo)注葡萄CO4蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr236)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser241)。The CO4 threonine phosphorylation site(Thr236)and serine phosphorylation site(Ser241)were marked in pane.

將葡萄CO4蛋白氨基酸序列與其他12種植物中同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)葡萄CO4與巨桉(Eucalyptusgrandis)CO親緣關(guān)系最近，屬同一亞族(圖4)。

圖4 葡萄 CO4進(jìn)化樹分析Fig.4 CO4 gene in grapevine phylogenetic tree analysis

2.2.2 葡萄CO4基因的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 葡萄CO4編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要形式有α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)，主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋和延伸鏈結(jié)構(gòu)，其次為無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(表2)。

信號(hào)肽與跨膜域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，葡萄CO4為跨膜蛋白，有一個(gè)信號(hào)肽，并有4個(gè)跨膜區(qū)，分別在第28-50個(gè)氨基酸區(qū)、第60-79個(gè)氨基酸區(qū)、第145-167個(gè)氨基酸區(qū)和第177-199個(gè)氨基酸區(qū)。

葡萄CO4的分子式為C1253H1990N324O340S11，含量最高的氨基酸是亮氨酸Leu(12.1%)，含量最低的氨基酸是組氨酸His(1.2%)。葡萄CO4屬疏水性蛋白，其總平均疏水性為0.430；該蛋白有較好脂溶性，其脂溶指數(shù)為114.40。從蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性來看，葡萄CO4的不穩(wěn)定指數(shù)為43.17，屬于不穩(wěn)定蛋白(表3)。

表2 葡萄 CO4編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Tab.2 Protein secondary structure comparative analysis of CO4 gene in grapevine %

表3 葡萄CO4的理化性質(zhì)分析Tab.3 Physical and chemical characterization of CO4 protein in grapevine

2.3 葡萄CO4在不同光處理下的表達(dá)分析

葡萄CO4在不同光處理下的定量表達(dá)水平顯示(圖5)，葡萄CO4能夠積極響應(yīng)不同光處理信號(hào)。在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理下其表達(dá)量最高，是白光(對(duì)照)的5.39倍，差異顯著(P<0.05)；在白光轉(zhuǎn)紅光及紅光轉(zhuǎn)白光條件下，基因表達(dá)量與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)；在白光轉(zhuǎn)藍(lán)光和藍(lán)光轉(zhuǎn)白光的處理下其表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，分別為對(duì)照的54%和68%。在紅光和藍(lán)光的處理下，葡萄CO4的相對(duì)表達(dá)量顯著(P<0.05)高于對(duì)照，其中在藍(lán)光處理下表達(dá)量最高，為對(duì)照的2.86倍。

上述結(jié)果表明，葡萄CO4在不同光質(zhì)及轉(zhuǎn)光條件下的響應(yīng)不同，其中在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理下表達(dá)量上調(diào)最顯著，藍(lán)光處理次之，白光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理下其表達(dá)量顯著下調(diào)。

2.4 不同光照處理對(duì)貝達(dá)葡萄試管苗葉片熒光參數(shù)的影響

葡萄試管苗葉片熒光參數(shù)在不同光質(zhì)及轉(zhuǎn)光處理下不同，在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后Fv/Fm最高，差異顯著(P<0.05)；其次為白光；藍(lán)光及藍(lán)光轉(zhuǎn)白光處理下的Fv/Fm與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)；在紅光處理下Fv/Fm最低，且差異顯著(P<0.05)(圖6-A)。Fv/Fo在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后最高，其次為紅光處理，而在藍(lán)光、白光轉(zhuǎn)紅光、白光轉(zhuǎn)藍(lán)光、藍(lán)光轉(zhuǎn)白光處理后Fv/Fo均與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)(圖6-B)。qP在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后最高，在紅光轉(zhuǎn)白光、藍(lán)光轉(zhuǎn)白光處理后與對(duì)照均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，在紅光處理后最低，是對(duì)照的54%(圖6-C)。紅光處理后NPQ顯著高于對(duì)照(P<0.05)，為對(duì)照4.83倍；紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后NPQ最低，但與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖6-D)。

圖中不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著(P<0.05)。圖6同。Different small letters in the figure meant significant difference at 0.05 levels among treatments. The same as Fig.6.

圖6不同處理對(duì)熒光參數(shù)的影響Fig.6 Effect of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters

3 討論

CO基因?qū)χ参锕庵芷谛盘?hào)傳導(dǎo)具有重要作用，CO蛋白能夠?qū)⑸镧娦盘?hào)和光信號(hào)相整合，并通過誘導(dǎo)FLOWERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)的表達(dá)，進(jìn)而促使植物開花[23]；CO基因還在芽休眠、株高伸長(zhǎng)、側(cè)枝(根)分化、果實(shí)成熟、光形態(tài)建成、生物和非生物脅迫抗性、塊莖發(fā)育等過程中起著重要作用[17，24]。有研究認(rèn)為，多數(shù)真核生物的磷酸化過程主要在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基中進(jìn)行，而Ser85是向光素1的磷酸化位點(diǎn)，向光素接收光信號(hào)后，可以通過自發(fā)磷酸化作用輸出光信號(hào)[25]。本研究中，克隆到的葡萄CO4基因含有2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser85和Ser241)，1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr236)，1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(Tyr21)，推測(cè)葡萄CO4能夠通過磷酸化反應(yīng)對(duì)不同光照條件進(jìn)行感知和應(yīng)答，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

CO基因的表達(dá)受光質(zhì)調(diào)控，光敏色素能通過影響CO基因編碼蛋白的穩(wěn)定性，以此調(diào)控CO基因的表達(dá)模式[18]。Imaizumi等[26]研究認(rèn)為，CO基因轉(zhuǎn)錄水平受光照控制，藍(lán)光受體基因FKF1在藍(lán)光刺激下通過降解CDF1的活性而促進(jìn)CO基因的轉(zhuǎn)錄。樊麗娜等[27]認(rèn)為，CO蛋白在紅光下不穩(wěn)定，在藍(lán)光下穩(wěn)定。本研究中，CO4在葡萄轉(zhuǎn)光培養(yǎng)中響應(yīng)敏感，紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光后葡萄CO4基因表達(dá)量顯著上調(diào)；在單色光紅光和藍(lán)光處理下，葡萄CO4表達(dá)量均高于白光，因此，藍(lán)光和紅光對(duì)誘導(dǎo)葡萄CO4的表達(dá)具有促進(jìn)作用。Sawa等[28]也認(rèn)為，藍(lán)光能夠促進(jìn)擬南芥CO基因轉(zhuǎn)錄，與本研究結(jié)果相近。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)值的變動(dòng)能夠反映植物的一系列光合生理特性，因此，可用來評(píng)估植物的光合能力；光質(zhì)是葉綠素?zé)晒鈪?shù)的一個(gè)重要影響因素，有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物的光合速率在紅光下高于藍(lán)光[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Fv/Fo、qP在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后均高于其他處理，NPQ在該處理下最低；藍(lán)光處理后的Fv/Fm、qP顯著高于紅光處理，推測(cè)紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光能夠提高貝達(dá)葡萄試管苗葉片PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)換效率；藍(lán)光比紅光更能促進(jìn)試管苗對(duì)光能的利用，且在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后促進(jìn)作用更為明顯。Bondada等[29]認(rèn)為，藍(lán)光促進(jìn)葉綠體的形成，紅光主要促進(jìn)光合產(chǎn)物的累積，這可能與藍(lán)光能夠促進(jìn)光基因psbA轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的積累有關(guān)，張文林等[30]對(duì)轉(zhuǎn)基因楊樹的研究中也認(rèn)為，藍(lán)光能夠提高PS Ⅱ的相對(duì)電子傳遞速率。此外，葡萄CO4表達(dá)水平、Fv/Fm、Fv/Fo、qP在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理后均分別高于紅光和藍(lán)光處理，且在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理與藍(lán)光轉(zhuǎn)紅光處理之間差異顯著。據(jù)報(bào)道，光敏色素或光受體誘導(dǎo)的反應(yīng)發(fā)生于植物生長(zhǎng)發(fā)育的一定時(shí)期和一定組織中，具有一定的時(shí)空效應(yīng)[31]。由此推測(cè)，紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光處理與藍(lán)光轉(zhuǎn)紅光處理間的差異是因?yàn)榧t光和藍(lán)光的光效應(yīng)具有時(shí)間順序差異，導(dǎo)致光能在植物光合系統(tǒng)中分布不平衡，但其中的作用機(jī)理尚未見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

本研究利用RT-PCR法克隆得到葡萄CO4基因，發(fā)現(xiàn)該基因受不同光質(zhì)調(diào)節(jié)，在紅光轉(zhuǎn)藍(lán)光條件下，相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照；同時(shí)，該光照條件可提高葡萄試管苗對(duì)光能的利用。在后期研究中，將對(duì)該基因所關(guān)聯(lián)的下游元件做深入分析，以期闡明葡萄CO4及其調(diào)控系統(tǒng)對(duì)光合信號(hào)的響應(yīng)，為深入研究葡萄試管苗CO基因感光機(jī)理及對(duì)光質(zhì)改良提供依據(jù)。