白志元，張瑞軍，武國(guó)平，連世超，楊玉花，衛(wèi)保國(guó)

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，山西 太原 030031)

大豆高產(chǎn)育種一直以來(lái)都是育種工作者的重要目標(biāo)之一。雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象在生物界普遍存在，利用雜種優(yōu)勢(shì)成為提高社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益必不可少的工具[1]。水稻、玉米、谷子、高粱等作物已利用雜種優(yōu)勢(shì)大幅度提高了產(chǎn)量，在主要作物中，大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用研究相對(duì)滯后[2]。大豆是嚴(yán)格的自花授粉作物，天然異交率不到1%。隨著大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的發(fā)現(xiàn)，大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用成為可能[3-4]，該項(xiàng)研究對(duì)提升我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)具有戰(zhàn)略性意義。目前，我國(guó)在該領(lǐng)域處于世界領(lǐng)先水平，國(guó)內(nèi)多家單位已實(shí)現(xiàn)了雜交大豆生產(chǎn)的三系配套體系，其中，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、安徽省阜陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院已審定了雜交大豆品種[5-8]。

雜交大豆產(chǎn)業(yè)化有2項(xiàng)瓶頸技術(shù)：高效繁種制種技術(shù)和強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的篩選。山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所雜交大豆課題組對(duì)這2項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了有效的攻關(guān)，形成了雜交大豆生產(chǎn)所需的規(guī)范繁種制種技術(shù)[9]，制定了《大豆雜交種制種技術(shù)規(guī)程》、《大豆雜交種種子》山西省地方標(biāo)準(zhǔn)；審定了山西省首個(gè)雜交大豆品種-晉豆48號(hào)[8]。然而，本課題組在高產(chǎn)組合的篩選上仍不理想，沒(méi)有明顯突破。大豆雜交育種研究表明，親本的親緣關(guān)系對(duì)大豆雜種優(yōu)勢(shì)有著重要的影響[10-11]。遺傳多樣性能反映品種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，能對(duì)作物的育種應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。許多研究表明，SSR標(biāo)記具有簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性高和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，并具有很好的穩(wěn)定性，在大豆遺傳多樣性研究中已得到廣泛應(yīng)用[12-16]。

本研究選用64對(duì)覆蓋大豆20條染色體的SSR標(biāo)記，對(duì)本課題組現(xiàn)有主要的32份雜交大豆親本(包括15份保持系與17份恢復(fù)系)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，以期為山西三系雜交大豆育種中保持系與恢復(fù)系的篩選、遺傳改良以及強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的選育等方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用本課題組自育的14個(gè)不育系對(duì)應(yīng)的保持系和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的NJCMS3A對(duì)應(yīng)的保持系NJCMS3B，共15份材料；恢復(fù)系為17份材料，具體名稱如表1所示。

表1 供試保持系與恢復(fù)系名稱Tab.1 The name of the maintainer and restorer of the test

1.2 基因組DNA的提取

取大豆幼嫩葉片，在液氮中研磨后，采用CTAB[17]法提取葉片DNA，并檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。

1.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

選用分布在大豆20條染色體上的64對(duì)SSR引物進(jìn)行分析，該引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。PCR反應(yīng)采用10 μL體系：2.5 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L Primer 2 μL，10×PCR Buffer 1 μL，5 U/μLTaqPolymerase 0.1 μL，10 ng/μL模板 DNA 5 μL，ddH2O 1.4 μL。PCR反應(yīng)在美國(guó)Bio-Bad 1000-系列PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，優(yōu)化的退火溫度(依引物退火溫度而定)退火30 s，72 ℃延伸30 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染、拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)每對(duì)SSR產(chǎn)物的銀染結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，有擴(kuò)增條帶表示為“1”，無(wú)條帶者表示為“0”。材料間的遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)按 Nei等[18]的方法計(jì)算，遺傳相似性聚類(lèi)按遺傳相似系數(shù)的值以不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)，利用NTSYS-PC2.1軟件繪制聚類(lèi)圖。

多態(tài)性信息量(Polymorphism information content)PIC計(jì)算公式如下。

式中，Pij表示位點(diǎn)i的第j個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率[19]，PIC值位于0～1，其中，0代表該位點(diǎn)無(wú)多態(tài)性，1代表有較多的等位位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

本研究用分布于大豆20條染色體的64對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)32份雜交大豆親本(包括15份保持系與17份恢復(fù)系)進(jìn)行多態(tài)性分析。從表2可以看出，試驗(yàn)共檢測(cè)出357個(gè)等位基因變異，單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)變化為2～12個(gè)，平均為5.578個(gè)。其中，Satt358、Satt380這2對(duì)引物等位位點(diǎn)最多，均為12個(gè)，引物Satt211等位位點(diǎn)最少，為2個(gè)。SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息指數(shù)PIC變幅為0.368～0.900，平均為0.666。

表2 64對(duì)SSR引物及所在染色體、等位變異數(shù)和PIC值Tab.2 The chromosome loci amplified allele number and PIC value of 64 SSR primers

2.2 保持系與恢復(fù)系SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

從表3可以看出，用分布于大豆20條染色體的64對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，15份保持系共檢測(cè)出322個(gè)等位變異，單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)變化為2～9個(gè)，平均為5.031個(gè)，其中，Satt358、Satt380、Satt292這3對(duì)引物等位位點(diǎn)最多，均為9個(gè)，Satt211、Satt213、Satt527這3對(duì)引物等位位點(diǎn)最少，均為2個(gè)；SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.370～0.868，平均為0.661，以引物Satt380最高，引物Satt211最低。17份恢復(fù)系共檢測(cè)出320個(gè)等位變異，單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)變化為2～12個(gè)，平均為5個(gè)，其中，引物Satt380等位位點(diǎn)最多，為12個(gè)；SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.329～0.904，平均為0.630，以引物Satt380最高，引物Satt460最低。

表3 64對(duì)SSR引物分別在15份保持系、17份恢復(fù)系中等位變異數(shù)和PIC值Tab.3The amplified allele number and PIC value of 64 SSR primers in 15 maintainers and 17 restorers

2.3 保持系間的遺傳差異與遺傳關(guān)系

根據(jù)SSR 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算保持系間的遺傳相似系數(shù)(GS)，GS值變幅為0.491～0.857，平均為0.637。其中，B4(NJCMS3B)和B13(PI486355B)的遺傳相似系數(shù)最小，為0.491；B12(KunitzB)和B15(GR8836B)的遺傳相似系數(shù)最大，為0.857。

利用NTSYS-PC2.1軟件通過(guò)UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，以GS值0.61為標(biāo)準(zhǔn)，15份保持系共聚成兩類(lèi)(圖1)。其中，第Ⅰ類(lèi)包括B1(JD24B)、B2(H3B)、B3(JY20B)、B5(JY34B)和B13(PI486355B)共5個(gè)保持系，其余10個(gè)保持系被聚在第Ⅱ類(lèi)。在相似系數(shù)0.65處，第Ⅱ類(lèi)又可分為3個(gè)亞類(lèi)，其中，第Ⅰ亞類(lèi)含有B4(NJCMS3B)和B8(YC30B)共2個(gè)保持系，第Ⅱ亞類(lèi)包括B9(UnionB)、B10(OmahaB)、B12(KunitzB)、B15(GR8836B)、B14(DefianceB)和B11(RENDB)共6個(gè)保持系，第Ⅲ亞類(lèi)含有B6(Z17B)和B7(WD28B)共2個(gè)保持系。

圖中序號(hào)與表1中名稱對(duì)應(yīng)。圖2同。The name of the sequence number in the graph is shown in Tab.1. The same as Fig.2.

2.4 恢復(fù)系間的遺傳差異與遺傳關(guān)系

根據(jù)SSR統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算恢復(fù)系間的遺傳相似系數(shù)(GS)，GS值變幅為0.494～0.969，平均為0.669。其中，C15(JD78)和C17(TH40)的遺傳相似系數(shù)最小，為0.494；C6(TH21)和C7(TH19)的遺傳相似系數(shù)最大，為0.969。

利用NTSYS-PC2.1軟件通過(guò)UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，以GS值0.65為標(biāo)準(zhǔn)，17份恢復(fù)系共聚成兩類(lèi)(圖2)。其中，第Ⅰ類(lèi)包括C1(T02064-17)、C3(WQ08-1)、C2(WQ117-1)、C4(L04Q088-1)、C8(TH119-99)、C9(TH3)、C10(ZZ045387 9-1)、C5(Pella)、C15(JD78)、C6(TH21)、C7(TH19)和C11(ZZ06818)等12個(gè)恢復(fù)系，其余5個(gè)恢復(fù)系被聚在第Ⅱ類(lèi)，分別為C16(TH46)、C17(TH40)、C12(F97211-76)、C13(F9721-6)和C14(TH10)。

圖2 17份恢復(fù)系的遺傳多樣性聚類(lèi)結(jié)果Fig.2 Dendrogram of cluster analysis based on genetic similarity coefficient between 17 restorers

3 討論

SSR分子標(biāo)記是分子輔助育種、材料基因型鑒定、種屬間親緣關(guān)系和遺傳多樣性等研究的有力工具。王彩潔等[13]對(duì)中國(guó)自20世紀(jì)40年代以來(lái)大豆主產(chǎn)區(qū)東北和黃淮海地區(qū)大面積種植的89個(gè)大豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，平均等位變異數(shù)為5.48個(gè)，等位變異的變化為1～14個(gè)，黑龍江北部、黑龍江中南部、吉林遼寧地區(qū)和黃淮海地區(qū)大面積種植品種標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(PIC)依次為0.414，0.469，0.522和0.562。Wang等[20]研究結(jié)果顯示，40份山西大豆育成品種、地方品種和野生資源平均位點(diǎn)的等位變異數(shù)為6.55，PIC為0.585～0.850，平均為0.78。Diwan等[21]對(duì)北美大豆品種的35個(gè)祖先親本多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，平均每個(gè)SSR引物的等位變異數(shù)為10.1，PIC為0.64～0.91，平均為0.8。本研究64對(duì)引物對(duì)32份雜交大豆親本材料共檢測(cè)出357個(gè)等位基因變異，單個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)變化為2～12個(gè)，平均為5.578個(gè)，位點(diǎn)多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.368～0.900，平均為0.666。本研究多樣性信息含量結(jié)果介于中外學(xué)者之間，主要是由于本試驗(yàn)材料除黃淮與東北材料外，還有一些美國(guó)材料。上述結(jié)果也進(jìn)一步證明，SSR標(biāo)記檢測(cè)是研究大豆品種資源遺傳差異的有效手段之一。

崔艷華等[14]對(duì)96份黃淮夏大豆進(jìn)行遺傳多樣性分析，聚類(lèi)結(jié)果表明，96份材料呈現(xiàn)一定的地理分布規(guī)律。王彩潔等[13]研究表明，同一區(qū)域內(nèi)大面積種植品種的同質(zhì)化現(xiàn)象相當(dāng)明顯。本研究在聚類(lèi)分析中也發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)結(jié)果與地理來(lái)源具有一定相關(guān)性，地理來(lái)源相近的材料聚為一類(lèi)，如保持系聚類(lèi)中第Ⅱ類(lèi)中第Ⅱ亞類(lèi)的6個(gè)保持系皆來(lái)自于美國(guó)。此外，對(duì)系譜來(lái)源不清或者血緣不直接相關(guān)的種質(zhì)劃分到相應(yīng)的類(lèi)群，如保持系第Ⅰ類(lèi)中B2(H3B)和B13(PI486355B)；恢復(fù)系第Ⅰ類(lèi)中C9(TH3)、C6(TH21)，第Ⅱ類(lèi)中C16(TH46)等材料，這將對(duì)保持系、恢復(fù)系材料的利用、種質(zhì)創(chuàng)制及從地理來(lái)源有目的地篩選保持系與恢復(fù)系具有很現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。此外，本研究保持系的多態(tài)性信息含量(PIC)0.661高于恢復(fù)系的0.630，保持系間的平均遺傳相似系數(shù)(GS)0.637低于恢復(fù)系的0.669，這也與筆者在篩選保持系和恢復(fù)系的結(jié)果一致，保持材料比恢復(fù)材料容易找到。

多年來(lái)，山西雜交大豆育成的組合及品種在單產(chǎn)、抗性等方面未取得較明顯突破，其重要原因之一在于不育系、保持系及恢復(fù)系遺傳基礎(chǔ)狹窄。近年來(lái)，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所雜交大豆課題組在大豆種質(zhì)資源的擴(kuò)增改良方面取得了一定的成效，拓寬了雜交大豆的親本材料，但種質(zhì)基礎(chǔ)仍相對(duì)狹窄。因此，在今后的育種工作中，應(yīng)繼續(xù)從全世界種質(zhì)資源中篩選不育系、保持系及恢復(fù)系種質(zhì)作為研究的基礎(chǔ)材料；同時(shí)，還須加大利用資源，拓寬雜交大豆不育系、保持系及恢復(fù)系的遺傳基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)山西雜交大豆育種的新突破。