于亞慧，楊 菊，張雨晨，張 林

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070；2.呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010090；3.內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

植物響應(yīng)外界脅迫時(shí)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化，產(chǎn)生Ca2+信號，Ca2+信號通過Ca2+傳感器的解碼和傳遞，引發(fā)下游一系列的生理反應(yīng)[1-2]。鈣依賴性蛋白激酶(CPKs)是植物中特有的Ca2+傳感器，含有EF手型結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合Ca2+[3-4]。擬南芥中CPK基因家族有34個成員，其中，CPK6基因位于第2條染色體上[5-6]。CPK6在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞和葉肉細(xì)胞中均有表達(dá)，在響應(yīng)外界刺激及感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擬南芥受到ABA(Abscisic Acid)脅迫時(shí)，CPK3和CPK6將共同作用，激活保衛(wèi)細(xì)胞上的S型陰離子通道和Ca2+滲透性ICa陽離子通道，調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉[7]。其中，在ABA濃度升高調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉過程中，CPK6還能介導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生和SLAC1的磷酸化[8]。但是CPK6在參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，對植物鈣依賴性生長的調(diào)節(jié)機(jī)制以及對缺鈣條件下植物體中H2O2積累的調(diào)控機(jī)制尚未明確。

植物受到外界各種不利刺激時(shí)，如病原體、干旱、鹽堿、低溫及空氣污染等[9]，能夠感知環(huán)境刺激的性質(zhì)、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，作出相應(yīng)的生理反應(yīng)[10]。在響應(yīng)這些生物或非生物脅迫過程中，植物體內(nèi)活性氧(ROS)信號和Ca2+信號協(xié)調(diào)參與，調(diào)控下游一系列生理生化反應(yīng)[11-14]。H2O2是ROS的一種，各種外界刺激會引發(fā)植物細(xì)胞快速產(chǎn)生H2O2[15]。H2O2是內(nèi)源性Ca2+濃度的調(diào)節(jié)因子，在應(yīng)答外界刺激時(shí)，H2O2的產(chǎn)生需要Ca2+內(nèi)流，從而激活定位在細(xì)胞質(zhì)膜上的NADPH氧化酶進(jìn)行應(yīng)答反應(yīng)[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，在植物免疫中，H2O2信號和Ca2+信號協(xié)同作用，共同引發(fā)下游生理過程[19]，但二者之間的協(xié)同機(jī)制目前尚不清楚。因此，通過研究植物響應(yīng)外界刺激時(shí)Ca2+信號引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)，及H2O2信號和Ca2+信號的協(xié)同作用機(jī)制，有助于更好地揭示植物適應(yīng)逆境的機(jī)制。

本研究以模式植物擬南芥為試驗(yàn)材料，研究了CPK6基因參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，對植物鈣依賴性生長的調(diào)節(jié)以及對缺鈣條件下植物體產(chǎn)生H2O2的調(diào)控，旨在為進(jìn)一步明確植物適應(yīng)缺鈣環(huán)境的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的哥倫比亞野生型擬南芥(Columbia ecotype，Col-0)種子、大腸桿菌菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101均由內(nèi)蒙古大學(xué)祁智教授實(shí)驗(yàn)室保存；擬南芥CPK6基因缺失突變體cpk6-2 (Salk_033392)和cpk6-3(Salk_025460)、表達(dá)載體pORER1購自美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心。EasyTaqPCR Supermix DNA聚合酶、pEASY-Blunt Simple Cloning Vector購自全式金公司；其他化學(xué)試劑購自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥cpk6突變體純合鑒定 在擬南芥SIGnAL(http：//signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)網(wǎng)站輸入cpk6突變體種子號，得到cpk6突變體純合鑒定所需的引物序列(表1)，所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用SDS方法提取Col-0和cpk6突變體幼嫩葉子的總DNA，用EasyTaqPCR Supermix DNA聚合酶進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

表1 純合鑒定引物序列Tab.1 Primer sequences used in homozygous verification

1.2.2cpk6突變體表型分析 將干燥好的cpk6突變體和Col-0 種子同時(shí)播種在CK和Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+缺失的固體培養(yǎng)基上，于4 ℃冰箱低溫處理3 d，然后置于培養(yǎng)室(光強(qiáng)：75～100 μmol/(m2·s)；光照周期：12 h光照/12 h黑暗；溫度：(23 ± 2)℃；相對濕度：60%～80%)豎直光照培養(yǎng)15 d。采集照片，分別測定cpk6突變體和Col-0的葉鮮質(zhì)量與根長，重復(fù)3～5次。

各處理培養(yǎng)基成分如下：全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CK)：5 mmol/L MES，5 mmol KNO3，1/2 MS Fe鹽，1 mmol/L H3PO4，1 mmol/L MgSO4，1 mmol/L CaCl2，1/2 MS微量元素，1/2 MS Mn鹽，1%蔗糖，1%瓊脂糖；缺鈣培養(yǎng)基(0 mmol/L Ca2+)：不含CaCl2，其余同CK；缺鐵培養(yǎng)基(0 mmol/L Fe2+)：不含F(xiàn)e鹽，其余同CK；缺鎂培養(yǎng)基(0 mmol/L Mg2+)：5 mmol/L MES，5 mmol/L KNO3，1/2 MS Fe鹽，1 mmol/L H3PO4，1 mmol/L Na2SO4，1 mmol/L CaCl2，1/2 MS微量元素，1/2 MS Mn鹽，1%蔗糖，1%瓊脂糖；缺鋅培養(yǎng)基(0 mmol/L Zn2+)：1/2 MS微量元素(不含ZnSO4·H2O)，其余同CK；缺錳培養(yǎng)基(0 mmol/L Mn2+)：不含Mn鹽，其余同CK。所有培養(yǎng)基均用KOH調(diào)節(jié)pH值至5.7，高溫高壓滅菌。

1.2.3CPK6啟動子活性研究 以野生型擬南芥基因組DNA為模板，將CPK6基因的啟動子序列，克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector載體上，所用引物為：5′-CCGCGGTTTATTGTATGATTGTTATTATCCAAAATTTAGCG-3′和5′-GCTAGCGAAACAAACTCTCTCTATTTCACAACTT-3′，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中。將測序正確的CPK6啟動子進(jìn)一步整合到表達(dá)載體pORER1編碼gusA酶基因片段上游的SacⅡ和NheⅠ多克隆位點(diǎn)，獲得pCPK6∷GUS表達(dá)載體。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，通過花序侵染法侵染野生型擬南芥，收獲T1種子，經(jīng)過3次抗性篩選后獲得單基因插入的T3純合轉(zhuǎn)基因種子。

將穩(wěn)定表達(dá)pCPK6∷GUS的擬南芥T3轉(zhuǎn)基因種子播于全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CK)，4 ℃低溫處理3 d，豎直光照培養(yǎng)7 d，分別移至CK和Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+缺乏的固體培養(yǎng)基上。繼續(xù)豎直光照培養(yǎng)7 d后，采用組織化學(xué)法定位檢測GUS活性。具體試驗(yàn)方法如下：取待染色的植物材料浸入GUS染色液中，37 ℃黑暗處理12 h，GUS染色液配方(1 mL)：790 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、10 μL 100 mmol/L X-Gluc母液、100 μL 5 mmol/L鐵氰化鉀、100 μL 5 mmol/L亞鐵氰化鉀、1 μL TritonX-100；用磷酸緩沖液沖洗植物材料；于FAA固定液中室溫固定1 h，F(xiàn)AA固定液配方(100 mL)：50 mL無水乙醇，5 mL冰醋酸，10 mL 37%甲醛，35 mL蒸餾水；將植物材料依次用50%,70%,100%乙醇漂洗各30 min；最后置于30%甘油中保存，用解剖鏡觀察并采集照片。

1.2.4 擬南芥cpk6和Col-0總鈣量的測定 將干燥好的cpk6突變體和Col-0種子分別播于全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CK)，4 ℃低溫處理3 d，豎直光照培養(yǎng)7 d后，分別移至CK和缺Ca2+固體培養(yǎng)基上。繼續(xù)豎直光照培養(yǎng)3 d，收集植物材料，用1 mmol/L CuSO4溶液涮洗一遍，再用去離子水涮洗3遍，將根葉分離，用濾紙吸干表面水分；稱鮮質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)；105 ℃殺青30 min；80 ℃烘干至其質(zhì)量為恒定值；分別研磨植物的根和葉，置于2.0 mL離心管中稱其干質(zhì)量，記錄并編號；向每個離心管中加入1.5 mL 5%的HNO3，渦旋振蕩1 min；37 ℃裂解48 h；15 000 r/min離心30 min；取上清液至新的離心管，加入5%的HNO3稀釋至2.0 mL，用原子吸收光譜儀(TAS990)測定總Ca含量。

1.2.5 H2O2檢測 將干燥好的cpk6突變體和Col-0種子分別播種于全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CK)和缺Ca2+固體培養(yǎng)基上，4 ℃低溫處理3 d，豎直光照培養(yǎng)17 d。通過DAB(Diaminobenzidine)染色檢測幼苗體內(nèi)H2O2積累，取cpk6突變體和Col-0幼苗分別浸泡于濃度為1 mg/mL的DAB溶液中；抽真空，直至溶液完全進(jìn)入幼苗，幼苗沉降到溶液底部；室溫避光染色12 h；用100%乙醇漂洗12 h，進(jìn)行脫色，期間更換100%乙醇數(shù)次；用去離子水清洗幼苗后放于60%甘油中保存；解剖鏡觀察，拍照。為進(jìn)一步研究該現(xiàn)象，將豎直光照培養(yǎng)17 d后的幼苗，通過DHR(Dihydrorhodamine-123)染色法檢測幼苗體內(nèi)H2O2積累，取cpk6突變體和Col-0幼苗，黑暗條件下，將其分別浸泡于濃度為1 mg/mL 的DHR溶液中；避光染色10 min；用去離子水清洗幼苗后制片，并使用蔡司LSM 710激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥cpk6突變體純合鑒定

為了獲得純合突變體，用SDS方法提取Col-0和cpk6幼嫩葉子的總DNA，利用T-DNA特異引物L(fēng)Bb1.3和CPK6基因特異引物L(fēng)P和RP進(jìn)行PCR檢測。對于野生型擬南芥(AA)，因無T-DNA插入，用LP/RP引物可擴(kuò)增出一條900～1 100 bp的特異性DNA片段，用LBb1.3/RP引物擴(kuò)增無DNA片段。而對于T-DNA插入的純合突變體擬南芥(aa)，用LBb1.3/RP引物進(jìn)行PCR，能夠擴(kuò)增出一條410～710 bp的DNA片段，用LP/RP引物擴(kuò)增無DNA片段。對于雜合體擬南芥(Aa)，用LP/RP引物能夠擴(kuò)增出一條900～1 100 bp的特異DNA片段，同時(shí)也能用LBb1.3/RP引物擴(kuò)增出一條410～710 bp的DNA片段[20]。

圖1 cpk 6-2和6-3純合突變體鑒定Fig.1 cpk 6-2 and cpk 6-3-homozygous-mutant-verification

結(jié)果顯示，野生型Col-0用LP/RP引物擴(kuò)增出一條1 000 bp左右的DNA片段，用LBb1.3/RP引物沒有擴(kuò)增出DNA片段。而cpk6突變體用LP/RP引物沒有擴(kuò)增出DNA片段，用LBb1.3/RP引物擴(kuò)增出一條600 bp左右的DNA片段(圖1)。表明鑒定的cpk6突變體均為純合植株，可繼續(xù)繁種進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 缺Ca2+條件抑制cpk6突變體生長

為了研究擬南芥CPK6基因在植物礦質(zhì)營養(yǎng)方面的功能，分析了cpk6突變體和Col-0在全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CK)和Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+缺失的固體培養(yǎng)基上的生長表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在全營養(yǎng)(CK)和Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+缺失條件下，不論是根長還是鮮質(zhì)量，cpk6突變體同Col-0相比都無顯著性差異，而在缺Ca2+條件下，相對于Col-0，cpk6突變體葉小發(fā)黃(圖2-A)，生長受到了明顯抑制。根據(jù)鮮質(zhì)量和根長的量化分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在缺Ca2+條件下，Col-0的鮮質(zhì)量為1.4 mg，根長為5.6 cm，cpk6突變體的鮮質(zhì)量為0.8 mg，根長為4.2 cm。與Col-0相比，cpk6突變體的鮮質(zhì)量減少了約42%(圖2-B)，根長短了約25%(圖2-C)。表明缺Ca2+條件抑制cpk6突變體生長。

A．典型苗照片；B．鮮質(zhì)量量化分析；C．根長量化分析；不同字母(a，b)代表同一培養(yǎng)條件下，Col-0、cpk6-2和cpk6-3在P<0.05水平上差異顯著。A.Typical seedlings photos；B. Fresh quality quantification analysis；C. Root length quantification analysis；The different letters (a, b) represent significant difference of Col-0，>cpk6-2 and cpk6-3 under the same treatment at P<0.05.

2.3 缺Ca2+條件能夠增強(qiáng)CPK6啟動子在葉片中的活性

在一定的反應(yīng)條件下，β-葡聚糖苷酶(GUS)可將X-Gluc水解成藍(lán)色物質(zhì)，因此，具有GUS活性的部位呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點(diǎn)，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出GUS活性。通過GUS組織化學(xué)染色法，發(fā)現(xiàn)移苗至CK和Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+缺失培養(yǎng)基的幼苗，在葉片的生長點(diǎn)部位和根上呈現(xiàn)藍(lán)色，表明CPK6啟動子在葉片的生長點(diǎn)部位和根中有活性(圖3)。而移苗至缺Ca2+培養(yǎng)基的幼苗，不僅在葉片的生長點(diǎn)部位和根上呈現(xiàn)藍(lán)色，其葉片中呈現(xiàn)藍(lán)色的部位明顯增多(圖3)，表明缺Ca2+處理能夠明顯增強(qiáng)CPK6啟動子在葉片中的活性。

2.4 CPK6不參與擬南芥鈣的積累

擬南芥cpk6突變體出現(xiàn)低鈣敏感表型的原因，可能是由于植物體內(nèi)Ca元素的積累能力下降，從而影響其在低鈣條件下的生長發(fā)育。為了探究CPK6是否影響擬南芥對Ca元素的積累，通過原子吸收光譜法對cpk6突變體與Col-0體內(nèi)的總Ca含量進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在全營養(yǎng)(CK)條件下，cpk6突變體和Col-0葉中總Ca含量為5.9 μg/mg，根中總Ca含量為3.4 μg/mg(圖4)。在缺Ca2+條件下，cpk6突變體和Col-0葉中總Ca含量為3.6 μg/mg，根中總Ca含量為2.3 μg/mg(圖4)。表明cpk6突變體和Col-0在缺Ca2+條件下的總Ca含量明顯比在全營養(yǎng)(CK)條件下少，葉片中的總Ca含量減少了約39%，根中的總Ca含量減少了約32%，表明在缺Ca2+條件下，cpk6突變體和Col-0對Ca的積累明顯減少。在缺Ca2+條件和全營養(yǎng)(CK)條件下，cpk6突變體與Col-0之間的總Ca含量無明顯差異(圖4)。表明CPK6不參與擬南芥對Ca元素的積累。

A.典型全苗照片；B.典型葉照片。A.Typical whole seedling photos；B.Typical leaves photos.

A.葉中總鈣含量；B.根中總鈣含量；相同字母代表同一培養(yǎng)條件下，Col-0、cpk6-2和cpk6-3沒有顯著性差異(P>0.05)。A.The total content of calcium in leaves；B.The total content of calcium in roots;The same letter represents no significant difference of Col-0，cpk>-2 and cpk6-3 under the same treatment (P>0.05).

2.5 CPK6是介導(dǎo)缺Ca2+誘導(dǎo)植物積累H2O2的負(fù)調(diào)控因子

為了研究缺Ca2+環(huán)境對植物體內(nèi)H2O2積累的影響，對cpk6突變體和Col-0幼苗進(jìn)行DAB組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)cpk6突變體和Col-0在缺Ca2+條件下葉片及根中的紅褐色沉淀明顯比在全營養(yǎng)(CK)條件下多，表明缺Ca2+誘導(dǎo)植物積累H2O2(圖5)。在全營養(yǎng)(CK)下，cpk6突變體和Col-0相比，葉片及根中的紅褐色沉淀都無明顯差異。而在缺Ca2+條件下，與Col-0相比，cpk6突變體葉片及根中的紅褐色沉淀都明顯增多(圖5)，表明缺Ca2+條件下，cpk6突變體積累了更多的活性氧。

A. 典型全苗照片；B. 典型葉照片。A. Typical whole seedling photos；B. Typical leaf photos.

為進(jìn)一步研究該現(xiàn)象，對cpk6突變體和Col-0幼苗進(jìn)行DHR染色，發(fā)現(xiàn)在全營養(yǎng)(CK)條件下，cpk6突變體和Col-0根部所發(fā)射出的綠色熒光強(qiáng)度較弱，且二者之間無明顯差異，表明產(chǎn)生的H2O2較少(圖6)。缺Ca2+條件下，cpk6突變體根部所發(fā)射出的綠色熒光強(qiáng)度明顯高于Col-0(圖6)。再次證明，缺Ca2+處理使得cpk6突變體根中H2O2的積累量明顯高于Col-0。綜上所述，CPK6是介導(dǎo)缺Ca2+誘導(dǎo)植物積累H2O2的負(fù)調(diào)控因子。

圖6 cpk6和Col-0幼苗H2O2熒光探針DHR染色Fig.6 H2 O2 fluorescent probe DHR staining ofcpk6andCol-0seedlings

3 討論與結(jié)論

植物缺鈣時(shí)，生長發(fā)育會受到嚴(yán)重影響，表現(xiàn)出植株小，葉子發(fā)黃等性狀。有研究表明，擬南芥CPK6能夠感應(yīng)Ca2+濃度變化，參與多種Ca2+介導(dǎo)的信號通路，在植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[21-22]。本研究對在外界環(huán)境營養(yǎng)脅迫下，CPK6基因缺失突變體的生長情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥CPK6基因使植物的生長受缺Ca2+抑制。進(jìn)而探索cpk6突變體缺Ca2+敏感表型形成的機(jī)理，對CPK6啟動子的活性進(jìn)行檢測。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，缺Ca2+處理能夠增強(qiáng)CPK6啟動子在葉片中的活性，推測擬南芥CPK6基因使植物的生長受缺Ca2+抑制可能與CPK6在葉中的表達(dá)量有關(guān)。為了研究突變體和野生型在缺Ca2+條件和全營養(yǎng)(CK)條件下總鈣含量的差別，采用原子吸收光譜法進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)缺Ca2+條件并非通過影響cpk6突變體內(nèi)Ca元素的積累而影響植物的生長。

植物受到外界刺激時(shí)，會影響自身生長和發(fā)育，導(dǎo)致植物體內(nèi)代謝紊亂，在植物組織細(xì)胞中積累過量活性氧，引起氧化脅迫[23-24]。據(jù)前人研究，馬鈴薯鈣依賴性蛋白激酶家族中，CPK4 和CPK5可以使NADPH氧化酶磷酸化進(jìn)而正調(diào)控H2O2的產(chǎn)生，而擬南芥中與馬鈴薯CPK4、CPK5同源性最高的鈣依賴性蛋白激酶是CPK6[25]。本研究對在缺Ca2+條件下，擬南芥組織細(xì)胞中活性氧的積累量進(jìn)行分析，根據(jù)DAB組織化學(xué)染色和H2O2熒光探針DHR染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥CPK6是介導(dǎo)缺Ca2+誘導(dǎo)植物積累H2O2的負(fù)調(diào)控因子，說明植物適應(yīng)氧化脅迫的能力與植物的抗逆性密切相關(guān)。早有研究發(fā)現(xiàn)植物在應(yīng)答外界脅迫刺激時(shí)，H2O2信號和Ca2+信號通路之間協(xié)同作用，但它們相互作用的機(jī)制目前仍不清楚[19]。為了研究H2O2的積累是否會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生變化，本研究在擬南芥Col-0和cpk6突變體內(nèi)表達(dá)了Ca2+依賴的水母發(fā)光蛋白(AEQ)，在外加H2O2的條件下，檢測細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的動態(tài)變化，但經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)一直沒有確定合適的H2O2處理濃度。下一步將深入分析原因，研究低Ca2+條件誘導(dǎo)植物積累H2O2的機(jī)制，以及H2O2和Ca2+信號通路之間在應(yīng)對外界脅迫時(shí)的協(xié)同機(jī)制，進(jìn)一步探索植物對低Ca2+環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。綜上所述，CPK6基因參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，對CPK6的研究有助于揭示植物對缺鈣環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。