馮 華，劉運超，陳玉梅，魏 薔，張改平，2

(1.河南省農業(yè)科學院 河南省動物免疫學重點實驗室，農業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；3.鄭州大學 生命科學院，河南 鄭州 450001)

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirustype，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病屬(Circovirusgenus)[1]。1974年由德國人Tischer在豬腎細胞(Porcine kidney cell)中發(fā)現(xiàn)，1982年被命名為豬圓環(huán)病毒，是迄今為止動物病毒中最小的DNA病毒[2-3]。PCV病毒呈20面體對稱，無囊膜，直徑為17～22 nm。病毒基因組是一條共價單股環(huán)狀DNA病毒，全長1 766～1 768 bp[4]，包含2個重要的開放閱讀框：ORF1全長904 bp，主要編碼與病毒復制有關的蛋白Rep和Rep′蛋白；ORF2全長702 bp或705 bp是區(qū)分不同PCV2亞型的主要區(qū)域，編碼結構蛋白cap，該蛋白是主要的免疫原蛋白。根據(jù)病毒的基因組成和抗原性的不同，病毒主要分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)。PCV2型主要侵染動物的免疫系統(tǒng)，降低動物免疫應答能力，造成免疫功能障礙，機體抵抗力下降，是能夠引起豬類多種臨床疾病的主要病原體，如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)和新生仔豬先天性震顫(Congenital tremors，CT)等[5-6]。近年來，PCV2在國內和國外迅速傳播，并且流行范圍不斷擴大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失[7]。

目前，PCV2的診斷和預防也成為近年來PCV研究的熱點。臨床上用來檢測PCV2的主要診斷方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、單層過氧化物酶試驗(IPMA)和常規(guī)PCR等。其中，ELISA、IFA和IPMA主要用于PCV2血清的檢測[8-10]，但是檢測過程復雜，消耗時間過長；雖然常規(guī)PCR檢測PCV2的方法已經廣泛應用于臨床樣品的檢測[11]，但是該方法不能實現(xiàn)對病毒量的精確分析，且靈敏度相對較低，易出現(xiàn)假陽性，無法檢測豬場的隱性感染。相比上述方法，熒光定量PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、可重復性好等優(yōu)點，能夠檢測到較低拷貝數(shù)的PCV2病毒，針對豬場的隱性感染能有效檢測，適合用于PCV2臨床樣品的檢測。許多學者建立了成熟的基于熒光定量PCR的PCV2臨床檢測方法。李鵬等[12]根據(jù)PCV2ORF1設計1對特異性引物建立了SYBR Green Real-time PCR檢測PCV2的方法，該檢測方法的靈敏度比常規(guī)PCR檢測方法高10倍，最低檢出量為10～100個拷貝/mL，與PRRSV、PRV、CSFV、PPV沒有交叉反應，特異性比較高。于靜等[13]建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏度比較高，可以達到10個拷貝/mL，在檢測的34份陽性臨床樣品中，檢測符合率為100%，明顯高于普通PCR方法的50%。郭慧娟等[14]建立的Taq Man熒光定量PCR檢測PCV2的方法最低可以檢測4.53×102個拷貝/mL，比普通PCR檢測方法高100倍，并且與其他病毒沒有交叉反應，重復性好，特異性高。

本試驗根據(jù)熒光定量PCR原理，設計針對PCV2ORF2序列設計特異性引物，通過對多種條件的優(yōu)化，擬建立一種快速、靈敏、特異的基于SYBRGreen熒光定量PCR(SYBRGreen Real-time qPCR)的PCV2診斷方法，旨在為PCV2臨床診斷及研究提供科學的診斷方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

病毒株、細胞株和載體：PCV2-zz毒株由河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室臨床分離得到，豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)為本實驗室保存。豬圓環(huán)病毒疑似病料為2015年河南省多個地區(qū)送檢的發(fā)病豬的脾臟和淋巴結。PK-15細胞、PMD19-T載體和JM109大腸桿菌由本實驗室保存。

主要試劑：SYBRGreen I PreMix聚合酶、DL2000 Marker、ExTaq酶等為大連寶生物工程公司產品；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、病毒基因組提取試劑盒等購自OMEGA公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自HyClone公司。

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2ORF2基因序列設計2對特異性引物(表1)。其中P1含有NheⅠ的酶切位點，P2含有PmeⅠ的酶切位點用于構建作為陽性標準品的載體pMD19T-ORF2和常規(guī)PCR擴增，擴增長度為702 bp；P3、P4為用于熒光定量PCR檢測的特異引物，擴增長度為122 bp。2對引物均由上海生工生物工程服務有限公司合成。

1.3 病毒DNA的提取

將臨床分離到的PCV2-zz接種到PK-15細胞上傳代，傳至第10代后，反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，收集病毒，使用OMEGA公司的病毒基因組提取試劑盒提取PCV2的DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pMD19T-ORF2陽性標準品的制備

以提取的PCV2的DNA為模板，利用特異性引物P1和P2對PCV2ORF2的基因進行擴增，PCR反應體系為25 μL：ExTaq12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加滅菌水補齊25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應結束后經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，利用膠回收試劑盒回收純化，并與pMD-19T載體連接，經過酶切、測序鑒定，構建的重組質粒pMD19T-ORF2，作為構建熒光定量PCR的陽性標準模板。

表1 用于pMD19T-ORF2構建、常規(guī)PCR和SYBRGreen Real-time qPCR的引物Tab.1 Primers used for pMD19T-ORF 2 construction，standard PCR and SYBRGreen Real-time qPCR

注：下劃線表示酶切位點。

Note:Underlined indicate restriction site.

1.5 SYBRGreen Real-time qPCR反應條件的優(yōu)化

為了獲得熒光定量PCR的最佳反應條件，本試驗以pMD19T-ORF2作為模板對熒光定量PCR的各反應條件進行了優(yōu)化，包括對引物(P3/P4)的工作濃度、退火溫度等條件的優(yōu)化。分別以終濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmol/L的引物進行熒光定量PCR檢測，根據(jù)Ct值和擴增曲線確定引物的最佳工作濃度；并分別以55，58，60，62，64 ℃作為退火溫度對熒光定量PCR進行相應的優(yōu)化，根據(jù)Ct值獲得最佳的退火溫度。

1.6 SYBRGreen Real-time qPCR標準曲線的建立

利用紫外分光光度計測定pMD19T-ORF2濃度，計算重組質粒的拷貝數(shù)，調整質粒濃度并將其從3×108個拷貝/mL 10倍系列稀釋到3×102個拷貝/mL作為陽性標準品，每個濃度做3個重復，以起始標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值(lg)為橫坐標，以Ct值為縱坐標做回歸曲線，建立PCV2檢測的標準曲線，并對該反應的溶解曲線進行分析。

1.7 SYBRGreen Real-time qPCR方法的檢測限分析

以稀釋后的pMD19T-ORF2(3×108～3×102個拷貝/mL)為模板，分別用P1/P2、P3/P4引物進行普通PCR和熒光定量PCR，并對2種方法的檢測限進行分析。

1.8 SYBRGreen Real-time qPCR方法的特異性檢測

利用病毒基因組提取試劑盒分別提取PPV和PRV的DNA，提取PRRSV和CSFV的RNA并反轉錄成cDNA；分別以其為模板，采用SYBR Green Real-time qPCR方法進行檢測，并以pMD19T-ORF2(3×108～3×104個拷貝/mL)為模板作為陽性對照，設立空白對照組，以檢測該方法的特異性。

1.9 SYBRGreen Real-time qPCR方法的重復性試驗

以不同拷貝數(shù)的陽性標準品作為模板，進行組內和組間重復性試驗。選取3×107，3×106，3×105個拷貝/mL 這3個濃度的標準品為模板進行該熒光定量PCR，每個濃度做3個重復，平行做3次。根據(jù)結果依次對Ct值的平均值±標準差和變異系數(shù)進行數(shù)據(jù)分析。

1.10 臨床樣品的檢測

本次用來檢測的臨床樣品為34份，利用病毒基因組提取試劑盒提取相關DNA，用建立的PCV2 SYBR Green熒光定量PCR進行檢測，并對檢測結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 pMD19T-ORF2陽性標準品的制備

2.1.1 PCR擴增產物鑒定 以PCV2-zz DNA為模板，用P1和P2引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠結果顯示，目的片段大小約為702 bp，與預測的結果相一致(圖1)。

M.DL2000；1.PCV2-CAP 擴增產物。M.DL2000；1.PCR product of PCV2-CAP.

2.1.2 重組質粒酶切產物鑒定 將從感受態(tài)細胞JM109中獲得的pMD19T-ORF2重組質粒進行雙酶切鑒定，酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示在702 bp處有目的條帶出現(xiàn)，表明目的片段成功插入pMD-19T載體中(圖2)。另外，測序結果與預期的片段相一致。

M.DL10000；1.雙酶切產物。M.DL10000；1.Double digests.

2.2 SYBRGreen Real-time qPCR反應條件的優(yōu)化

本試驗對熒光定量PCR反應的引物濃度和退火溫度進行了優(yōu)化，結果表明，在引物的最佳終濃度為0.2 μmol/L，最適退火溫度為55 ℃。因此，25 μL反應體系包括SYBRGreen I PreMix聚合酶12.5 μL，上下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板1 μL，超純水10.5 μL；最適反應條件為：94 ℃，10 s；94 ℃變性5 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。

2.3 SYBRGreen Real-time qPCR標準曲線的建立

以10倍系列稀釋的pMD19T-ORF2(3×108，3×107，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102個拷貝/mL)作為模板進行熒光定量PCR擴增反應，通過對Ct值結果的分析，建立PCV2擴增標準曲線，線性回歸方程為y=-3.092 2x+31.304，其斜率為3.092 2，相關系數(shù)是0.998 5，結果顯示，其線性結果好(圖3)。從熒光定量PCR溶解曲線的分布圖3可以看出，溶解曲線的特征峰比較單一，并且擴增產物的溶解溫度在77～79 ℃，說明熒光定量PCR的擴增沒有形成引物二聚體，也沒有出現(xiàn)非特異性產物。

2.4 常規(guī)PCR與SYBRGreen Real-time qPCR靈敏度的對比

同樣以濃度為3×108～3×102個拷貝/mL 的pMD19T-ORF2為模板，P1和P2為引物進行常規(guī)PCR，并對常規(guī)PCR檢測限進行鑒定，結果表明(圖4)，常規(guī)PCR的最小檢出量為3×104個拷貝/mL；而針對同樣的模板，熒光定量PCR的最小檢出量為3×102個拷貝/mL，比常規(guī)PCR高100倍，說明該熒光定量PCR對PCV2的檢測更敏感。

2.5 SYBRGreen Real-time qPCR特異性檢測結果

用所建立的SYBRGreen Real-time qPCR方法對CSFV、PPV、PRRSV、PRV這些病毒進行檢測，結果顯示，只有pMD19T-ORF2陽性對照出現(xiàn)特異性擴增，而針對CSFV、PRRSV、PRV等病毒無擴增；此外，針對PPV病毒在Ct值為38.16時出現(xiàn)微量擴增，由于CT>31判定為陰性(表2)。檢測結果證明，所建立的SYBRGreen Real-time qPCR方法特異性較高。

A.標準曲線；B.擴增曲線；C.溶解曲線。A.Standard curve;B.Amplification curve;C.Melting curve.

M.DL2000 Marker；1～7.標準品稀釋度為3×108～3×102拷貝/mL；8.陰性對照。M.DL2000 Marker；1-7.Different template concentrations from 3×108 copies/mL to 3×102 copies/mL；8.Negative control.

2.6 SYBRGreen Real-time qPCR可重復性試驗分析

為了驗證SYBRGreen熒光定量PCR檢測PCV2方法的穩(wěn)定性，分別選取3×107，3×106，3×105個拷貝/mL做組內和組間重復性試驗，結果表明，組內重復檢測的Ct值誤差小于0.2，變異系數(shù)在0.29%～0.32%；組間重復檢測的Ct值誤差小于0.2，變異系數(shù)在0.32%～0.36%(表3)，表明該方法具有很好的重復性。

表2 SYBRGreen Real-time qPCR特異性檢測結果Tab.2 Result of specificity of the SYBRGreen Real-time qPCR

表3 SYBRGreen Real-time qPCR批內和批間重復性試驗結果Tab.3 The reproducibility of inter- assay and intra-assay for the SYBRGreen Real-time qPCR

2.7 臨床樣品檢測

利用SYBRGreen Real-time qPCR和普通PCR對38份臨床樣品進行檢測，結果顯示(表4)，用SYBRGreen Real-time qPCR檢測PCV2的方法共檢測到陽性樣品31份，檢出率為81.5%(31/38)；用普通PCR檢測PCV2的方法共檢測到26份陽性樣品，檢出率為68.4%(26/38)。該熒光定量PCR的檢出率相比普通PCR高出13.1%，說明熒光定量PCR敏感性高于普通PCR，更適合臨床樣品的檢測。

表4 SYBRGreen Real-time qPCR與普通PCR臨床樣品檢測結果的比較Tab.4Comparison between SYBRGreen Real-time qPCR and conventional PCR for clinical sampled etection

3 結論與討論

PCV是引起豬圓環(huán)病毒相關疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的主要病原，該病毒增殖快、毒力強、更容易破壞機體免疫系統(tǒng)，引起免疫能力下降，繼而造成其他病毒或細菌混合感染，給疾病的診斷和治療帶來了極大的困難[15-17]。因此，對PCV2感染早期臨床快速診斷就顯得尤為重要。在PCV2的主要檢測方法中，血清學檢測通常采用病毒中和試驗和ELISA方法，但這些檢測手段比較復雜，技術要求高，耗時長；尤其是病毒中和試驗，該檢測方法對病毒分離鑒定及抗體要求比較高。另外，在ELISA檢測過程中，操作不規(guī)范極易造成假陽性結果[18]，不同的血清稀釋度對ELISA檢測結果的判斷標準也會有影響。由于PCV2是DNA病毒，常規(guī)PCR在DNA水平檢測PCV2是有效手段[19]，但與熒光定量PCR相比，容易出現(xiàn)假陽性，耗時也比較長，檢測敏感度較低，對于含毒量比較低的豬群則不易檢出，因此，對于亞臨床感染豬群，常規(guī)PCR會造成漏檢。目前，熒光定量PCR是國內檢測PCV2的最有效的手段，它能以數(shù)值的形式更直觀地判斷豬群感染PCV2的情況，并且具有靈敏性高、特異性強、耗時短的優(yōu)點[20-21]。

本研究通過參考已經報道PCV1和PCV2全基因序列差異性的文章[22-23]，分析2種亞型在ORF2片段區(qū)的差異，從而選取了PCV2ORF2的相對保守區(qū)，在保守區(qū)內設計一對特異性引物，建立了一種SYBRGreen Real-time qPCR檢測PCV2的診斷方法。該方法與CSFV、PPV、PRRSV和PRV這些病毒的核酸均無交叉反應，說明該方法的特異性強。通過對溶解曲線的分析得出在擴增過程中未產生引物二聚體和非特異性擴增，并且擴增產物的溶解溫度在79～81℃波動，屬于正常波動范圍。根據(jù)不同的稀釋倍數(shù)的標準樣品擴增得到的Ct值建立標準曲線y=-3.092 2x+ 31.304，其斜率為3.0922，相關系數(shù)是0.998 5，結果顯示其線性較好。組內重復檢測和組間重復檢測的變異系數(shù)都低于0.32%，說明熒光定量PCR具有很好的重復性。熒光定量PCR對標準品的最小檢出量為3×102個拷貝/mL，比常規(guī)PCR方法高出100倍，與其他研究學者所建立的熒光定量PCR檢測PCV2方法的敏感性相差較小[24-26]。在38份臨床檢測樣品中，熒光定量PCR陽性樣品檢出率為81.5%，明顯高于普通PCR的68.4%。結果表明，該試驗所建立的豬圓環(huán)病毒2型SYBRGreen Real-time PCR檢測方法特異性強、靈敏度高、重復性好、耗時短，適合臨床樣品的檢測，該方法的建立為PCV2流行病學的調查和臨床疫病的檢測提供了技術支持，同時為疫苗免疫效果的評價提供了參考依據(jù)。