楊海燕，金永國，孫秀秀，靳國鋒，馬美湖

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070）

咸蛋是我國乃至東南亞地區(qū)的一種傳統(tǒng)腌制蛋制品，因其獨(dú)特的口感和風(fēng)味受到廣大消費(fèi)者的喜愛，是人們?nèi)粘ｏ嬍持械囊环N重要食品。在咸蛋中蛋黃是消費(fèi)者最喜愛食用的部分，也是咸蛋品質(zhì)好壞的重要評價(jià)部位。一般好的咸蛋要求蛋黃“鮮、細(xì)、嫩、松、沙、油”。目前，由于市場的廣泛需求，蛋黃會被直接 腌制成咸蛋黃，大量用于蛋黃包、粽子、月餅等中式食品中[1,2]。

蛋黃是一種O/W的乳狀液，溶解相為漿質(zhì)，其余的則為懸浮的顆粒，適度離心得到漿質(zhì)和顆粒成分[3,4]；漿質(zhì)占蛋黃干物質(zhì)的77%～81%，其中包括85%的低密度脂蛋白和15%的卵黃球蛋白[5]；而在咸蛋及咸蛋黃腌制過程中，在 NaCl的作用下，蛋黃內(nèi)原本分布均勻的乳化型細(xì)小脂肪珠分離析出，水分向外擴(kuò)散，親油基團(tuán)相互聚合，蛋黃中穩(wěn)定的乳狀液體系被破壞，最終形成的咸蛋黃豐潤鮮紅、油露松沙、營養(yǎng)豐富[6,7]。目前多數(shù)研究集中于腌制方法和工藝研究，而對于腌制過程中單就蛋黃漿質(zhì)及其凝膠特性的研究較少[8,9]；例如，關(guān)于蛋黃漿質(zhì)Anton等[3]人的研究中發(fā)現(xiàn)蛋黃漿質(zhì)乳化性高于顆粒；Sirvente等[11]人研究發(fā)現(xiàn)高壓顯著影響漿質(zhì)乳化性，但并不改變漿質(zhì)流變特性[10]；孫嘉文等研究了冷凍對蛋黃全蛋液、蛋黃顆粒和蛋黃漿質(zhì)三部分乳化性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)蛋黃進(jìn)行冷凍時，蛋黃顆粒和蛋黃漿質(zhì)之間可能發(fā)生了相互作用，產(chǎn)生分子間和分子內(nèi)的聚集行為，導(dǎo)致蛋黃經(jīng)過冷凍后乳化容量以及可溶性蛋白等顯著降低；Laca等[12]對蛋黃漿質(zhì)及顆粒性質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋黃顆粒比漿質(zhì)抵抗熱變性的能力強(qiáng)，這是因?yàn)闈{質(zhì)中的低密度脂蛋白對熱敏感；漿質(zhì)中的蛋白在蛋黃凝膠中起著重要作用，其凝膠性是禽蛋蛋白較重要的功能特性，研究蛋黃漿質(zhì)在腌制過程中的凝膠性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同 NaCl濃度下蛋黃漿質(zhì)凝膠性的影響，觀察不同濃度NaCl腌制蛋黃24 h后，蛋黃凝膠保水性、凝膠質(zhì)構(gòu)；漿質(zhì)流變性、粒徑分布等，以探討腌制蛋黃漿質(zhì)凝膠變化情況，為咸蛋腌制過程中漿質(zhì)凝膠變化提供理論基礎(chǔ)，并為未來蛋品開發(fā)提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋（海蘭褐殼蛋），購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場。

NaCl、正己烷均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 3-30N型高速冷凍離心機(jī)，美國Sigma公司；JSM-6390型掃描電子顯微鏡，日本 NTC；TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀，英國 stable micro system；ULtrascan VIS臺式分光測色儀，美國Hunter Lab公司；DHR2型流變儀，美國沃特斯公司；APA2000型激光粒度分布儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

新鮮雞蛋去殼分離蛋清、蛋黃，獲得去除蛋黃膜的蛋黃液。采用直接腌制的方法加入NaCl，其中NaCl（NaCl占蛋黃液質(zhì)量百分比）添加量分別為0%（設(shè)為對照組）、0.5%、1.0%、1.5%、2%（咸蛋腌制成熟后，蛋黃含鹽量一般為1.5%左右，設(shè)為腌制組），在4 ℃條件下腌制24 h；腌制完成后加入1.5倍的蒸餾水，攪拌均勻調(diào)節(jié)pH=7于4 ℃放置過夜，10000 r/min離心 40 min 獲得蛋黃漿質(zhì)，置于 4 ℃下保存，備用[13]。

1.3.2 漿質(zhì)凝膠的制備

取15 mL漿質(zhì)于20 mL塑料杯中，用保鮮膜封口，用橡皮筋扎緊后90 ℃水浴加熱40 min，然后取出用自來水冷卻20 min，放于4 ℃條件下冷藏過夜。

1.3.3 漿質(zhì)凝膠保水性的測定

凝膠保水性的測定[12]：將制備好的凝膠置于高速冷凍離心機(jī)中，10000 r/min離心10 min后，稱總重，去除離心出的水分，再次稱重，按照以下公式計(jì)算凝膠保水性（water holding capacity，WHC）：

其中W1為離心管和離心除水后的凝膠重，W2為離心前離心管和凝膠重，W為離心管重。每個處理有3個平行。

1.3.4 漿質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu)測定

用質(zhì)構(gòu)儀測量蛋黃漿質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性[14]。將樣品切成1 cm×1 cm×1 cm 的正方體，并將其中心置于質(zhì)構(gòu)儀探頭的正下方樣品臺上，采用P/36R探頭對樣品進(jìn)行兩次壓縮。測定條件如下：測前速度2.0 mm/s；測試速度1.0 mm/s；測后速度2.0 mm/s；壓縮百分比50%，觸發(fā)力1.0 g，觸發(fā)類型auto數(shù)據(jù)攝取速率200 pps停留時間5 s。測試完成后，用儀器自帶軟件內(nèi)部宏對測試結(jié)果進(jìn)行處理，為了保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，質(zhì)構(gòu)測定重復(fù)10次。得到凝膠硬度（Hardness）、彈性（Springiness）、凝聚性（Cohesiveness）、咀嚼性（Chewiness）等。

1.3.5 漿質(zhì)成分粒徑分布測定

采用MS2000型激光粒度分析儀測定蛋黃漿質(zhì)中粒度的分布情況。光學(xué)參數(shù)：相對折射率1.44，粒子吸收0，連續(xù)相折射率為1.33。

1.3.6 漿質(zhì)成分色度測定

采用Ultra Scan VIS型色度儀測定蛋黃漿質(zhì)的明度（L*）、紅綠值（a*）、黃藍(lán)值（b*）。L*值 0～100表示全黑至全白，a*值由小至大表示綠色至紅色，b*由小至大表示表示藍(lán)色至黃色。

1.3.7 漿質(zhì)蛋白SDS-PAGE電泳測定

將樣品1:1加入正己烷磁力攪拌30 min，于4 ℃環(huán)境中靜置4 h后離心除去有機(jī)試劑，除去漿質(zhì)中脂質(zhì)成分；配置蛋白濃度為2 mg/mL的溶液，取40 μL樣品，加10 μL蛋白上樣緩沖液，混合均勻后沸水浴煮沸5 min，取20 μL上樣。采用濃縮膠5%，分離膠12%進(jìn)行電泳分析。

1.3.8 漿質(zhì)成分流變特性測定

采用馬爾文旋轉(zhuǎn)流變儀，在25 ℃下，選擇0°/40 mm平板系統(tǒng)，1 mm平板間距，固定振蕩應(yīng)力為10%，測定漿質(zhì)的彈性模量(G')、黏性模量(G")隨振蕩頻率的變化，振蕩頻率的變化范圍為0.1～40 Hz。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察漿質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)

漿質(zhì)凝膠切成1 cm×1 cm×1 cm體積大小塊狀，50 ℃烘干30 min脫去水分，于中心取樣裝裱于掃描電鏡板上，噴金處理后用掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用WPS office 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用 IBM SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Origin Pro 8.5 軟件作圖，以p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)凝膠保水性的影響

圖1 不同NaCI濃度下蛋黃漿質(zhì)凝膠保水性影響 Fig.1 Effect of different concentration of NaCl treatment on water holding capacity of egg yolk plasma gel

由圖1可知，蛋黃漿質(zhì)凝膠在NaCl添加量為2%時，蛋黃漿質(zhì)凝膠保水性最好，且與其他處理組凝膠保水性差異顯著（p＜0.05），蛋黃漿質(zhì)凝膠保水性隨NaCl濃度的增加而增大。

LI J等[15]研究發(fā)現(xiàn)蛋黃凝膠在加入1.8% NaCl后，凝膠保水性從98.70%逐漸增加到99.16%，和本文研究結(jié)論一致。這可能是因?yàn)?NaCl的加入增加了凝膠內(nèi)部水的流動性與分布，并使蛋白分子易于形成水離子鍵，改變凝膠內(nèi)部疏水相互作用。凝膠的保水性反映了蛋黃漿質(zhì)對水的保持能力，保水性越高，更好防止水分子的逸出[16]。

2.2 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響

由表 1可知，用 0.5%、1%、1.5%、2%濃度的NaCl腌制24 h后，蛋黃漿質(zhì)凝膠的硬度值均低于對照組，特別是2%濃度的NaCl處理后，蛋黃漿質(zhì)凝膠硬度比0%對照組顯著降低了10.719 N（p＜0.05）；漿質(zhì)凝膠內(nèi)聚性隨NaCl濃度增加，呈現(xiàn)下降趨勢，0.5%、1%及1.5%NaCl組間變化無差異，而2%濃度NaCl處理組差異顯著（p＜0.05）；蛋黃漿質(zhì)凝膠彈性隨 NaCl添加量的增大基本不變；腌制組樣品的咀嚼性和膠黏性均低于0% NaCl組，但是隨著NaCl添加量的增加，未呈現(xiàn)直線下降趨勢；綜上，2%NaCl添加量時，漿質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性最差，凝膠品質(zhì)降低。

蛋黃漿質(zhì)中，低密度脂蛋白含量高達(dá)85%，是蛋黃凝膠過程中起主要作用的蛋白質(zhì)，其他蛋白質(zhì)并不直接參與蛋黃凝膠作用[17]；在WAKMATU等[18]人的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加1%～2%NaCl時，形成低密度脂蛋白-水-NaCl復(fù)合物，會抑制低密度脂蛋白形成的凝膠，凝膠硬度、內(nèi)聚性等下降；同時在KITABATAKE等[19]人的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl濃度較高時，NaCl使凝膠中出現(xiàn)不溶性凝集物，凝膠強(qiáng)度下降。因此，當(dāng)添加不同濃度的 NaCl時，維持低密度脂蛋白穩(wěn)定性的疏水相互作用被破壞，形成低密度脂蛋白-水-NaCl復(fù)合物，形成凝膠質(zhì)構(gòu)特性下降。

表1 不同NaCI濃度下蛋黃漿質(zhì)凝膠質(zhì)構(gòu) Table 1 Textural profiles of the egg yolk plasma gel with different concentration of NaCl treatment

2.3 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)粒徑分布的影響

由圖2可知，0%、0.5%、1%、1.5%、2% NaCl添加量下蛋黃漿質(zhì)粒徑分布情況。在 NaCl的添加量為0%時，粒徑呈現(xiàn)單峰分布，漿質(zhì)粒徑分布在1～100 μm之間，分布較好；這和PILLET E等人測定的蛋黃漿質(zhì)粒徑分布圖一致，均呈現(xiàn)較好單峰分布[17]；當(dāng)加入NaCl后，逐漸出現(xiàn)兩個較小的峰，一個分布在1～10 μm，一個分布在100～1000 μm，粒徑分布圖峰向右移動，部分漿質(zhì)蛋白發(fā)生聚集，粒徑變大；同時由于Na+的加入增加了蛋白的溶解性，部分蛋白粒徑變小，形成 1～10 μm 的小峰。

圖2 不同濃度NaCI處理蛋黃漿質(zhì)粒徑分布圖 Fig.2 Particle size distribution of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

粒徑的分布反應(yīng)了蛋黃漿質(zhì)的穩(wěn)定性，Na+的作用使蛋黃的穩(wěn)定性破壞，當(dāng) NaCl濃度過高時，連接蛋黃顆粒高密度脂蛋白和卵黃磷蛋白的鈣磷橋被 Na+破壞，顆粒蛋白溶解度可達(dá)到80%以上，蛋黃稀釋靜置后漿質(zhì)與顆粒形成較為明顯的分層，產(chǎn)生如圖4所示現(xiàn)象，在MCBEE L E等人最為經(jīng)典的蛋黃漿質(zhì)與顆粒分離法中，選用0.17 M的NaCl作為稀釋劑[20]，可見一定濃度的NaCl會影響漿質(zhì)溶液的穩(wěn)定性。

2.4 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)色度影響

圖3 不同NaCI濃度下蛋黃稀釋靜置圖 Fig.3 Diluting statics of egg yolk solution with different concentration of NaCl treatment

從表2可以看出，隨著NaCl濃度的增加，蛋黃漿質(zhì)明度L*增加，漿質(zhì)顏色逐漸偏向紅黃色，其色澤整體變深。蛋黃的顏色是由于脂溶性類胡蘿卜素（葉黃素，包括玉米黃素、β-隱黃素以及少量的β-胡蘿卜素）的存在，其中脂類集中在蛋黃漿質(zhì)中[21]，腌制會使蛋黃中脂質(zhì)浸出，脂溶性類胡蘿卜素溶解量加大，漿質(zhì)顏色由淡黃色變黃色、橙黃色，圖3中可以明顯看出蛋黃漿質(zhì)色度變化。

蔣勁松對咸蛋黃分離腌制過程中，也發(fā)現(xiàn)蛋黃明度隨腌制時間延長、腌制液濃度增加，明度增加，是因?yàn)橛坞x脂肪酸的析出[22]；吳玲部分替代 NaCl腌制對蛋黃色度的變化中，蛋黃顏色由鮮鴨蛋的亮黃色變紅黃后逐漸變暗變深，當(dāng)咸蛋腌制成熟時，L*值變化較為緩慢[23]，咸蛋腌制完成；腌制過程中，NaCl的脫水作用也會使蛋黃色素變濃，顏色變深。不同 NaCl濃度下蛋黃漿質(zhì)色度變化，反映了蛋黃在腌制過程中鹽濃度越高，游離脂肪酸析出越多，脂溶性類胡蘿卜素溶解增加，使得蛋黃漿質(zhì)明度增加，顏色偏向紅黃色。漿質(zhì)色度的變化體現(xiàn)著漿質(zhì)中脂質(zhì)變化、咸蛋腌制狀態(tài)，而脂質(zhì)在蛋黃漿質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成中起到了填充作用，部分促進(jìn)了凝膠品質(zhì)形成。

表2 不同NaCI濃度下蛋黃漿質(zhì)色度變化 Table 2 Values of L*, a* and b* colour coordinates for the eggs yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.5 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)蛋白影響

通過SDS-PAGE凝膠電泳分析NaCl對蛋黃漿質(zhì)蛋白條帶的影響。通過以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移做為對照，可以看出蛋黃漿質(zhì)中主要為低密度脂蛋白和卵黃蛋白，分子量 175 ku、140 ku、70 ku、15 ku 為低密度脂蛋白的脫輔基蛋白質(zhì)[24]，卵黃蛋白有三個異構(gòu)體，分別為α、β、γ，分子量為 85 ku、42 ku、65 ku，這和AMANDA關(guān)于蛋黃漿質(zhì)的SDS-PAGE圖一致[21]。蛋白樣品經(jīng)過 NaCl處理后，蛋白質(zhì)條帶沒有明顯變化，說明實(shí)驗(yàn)過程中 NaCl對蛋黃漿質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并不造成影響。鄭華等的研究也表明，腌制過程中盡管食鹽對蛋黃蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)造成了一定程度的改變，但并未對蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生作用[6]；則NaCl處理，并未對蛋黃漿質(zhì)凝膠蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)造成影響。

圖4 不同NaCI濃度下蛋黃漿質(zhì)SDS-PAGE圖 Fig.4 SDS-PAGE patterns of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.6 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)流變特性影響

圖5為不同腌制濃度下蛋黃漿質(zhì)的G’和G’的掃描頻率圖，對于某一確定粘彈性體系，G’與體系中交聯(lián)、纏結(jié)或聚集的彈性組分成比例；G’與體系中粘性成分有關(guān)；G’和 G’可作為評價(jià)粘彈性流體彈性以及粘性的大小。

圖5中蛋黃漿質(zhì)所有樣品的G’和G’均隨著掃描頻率的增加而增加，且G’大于G’，可知蛋黃漿質(zhì)是彈性流體，這和WANG YL等[26]人研究結(jié)果一致；圖5中蛋黃腌制時間24 h后，腌制蛋黃漿質(zhì)儲能模量較新鮮蛋黃漿質(zhì)均下降，NaCl濃度升高，腌制蛋黃漿質(zhì)儲能模量升高，體系中交聯(lián)、聚集的彈性成分增加；損失模量在 NaCl的作用下變化較小，蛋黃漿質(zhì)粘性降低較少。

在蛋黃漿質(zhì)中含有較多的低密度脂蛋白，低密度脂蛋白懸浮在蛋黃溶液中，其具有形成凝膠的能力，當(dāng)經(jīng)過一段時間的腌制后，咸蛋黃轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥阅z[27]。KAEWMANEE等[28]人的研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl添加量為1.5%時，蛋黃由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，蛋黃中漿質(zhì)流變學(xué)行為發(fā)生變化。AMANDA[21]對新鮮蛋黃漿質(zhì)中成分（lipidic paste）及顆粒進(jìn)行了頻率掃描，發(fā)現(xiàn)其G’及G’同樣隨著掃描頻率的增加而增加，且tanδ小于1，呈現(xiàn)類固體的性質(zhì)；因此，當(dāng)NaCl腌制24 h處理后，蛋黃漿質(zhì)凝膠G’和G’均低于未處理組，形成凝膠交聯(lián)程度降低，凝膠性能下降；而當(dāng) NaCl濃度增加至一定值時，形成凝膠交聯(lián)聚集彈性成分增加，凝膠性能相對增強(qiáng)。

圖5 不同NaCI濃度蛋黃漿質(zhì)儲能模量（G′）與損失模量（G′′）變化 Fig.5 The changes of storage modulus (G’) and loss modulus(G’) of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.7 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)影響

不同濃度 NaCl處理，蛋黃漿質(zhì)凝膠掃描電鏡圖（Scanning electron microscopy，SEM）如圖 6 所示，從圖中可以看出蛋黃漿質(zhì)凝膠中不規(guī)則蛋白分布；NaCl添加量為0%時，凝膠中蛋白呈現(xiàn)較小的粒徑，當(dāng) NaCl添加量增加時，蛋黃漿質(zhì)凝膠中部分蛋白顆粒粒徑變大，這和漿質(zhì)粒徑測量是一致的（圖2）；當(dāng)NaCl添加到蛋黃中，蛋黃中的脂質(zhì)成分游離出來，覆蓋到蛋白表面，將蛋白中的孔洞填補(bǔ)，使得漿質(zhì)凝膠表面更為緊縮、紋理粗糙，同時 NaCl的脫水作用使得這一現(xiàn)象更為明顯；AMANDA等[21]人的對新鮮蛋黃漿質(zhì)組分的 SEM 圖中，脂質(zhì)和蛋白在漿質(zhì)組分中也呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀分布。

圖6 不同濃度NaCI處理蛋黃漿質(zhì)掃描電鏡圖 Fig.6 Scanning electron microscopy of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對蛋黃分離腌制，運(yùn)用多種分析檢測手段，分析 NaCl處理后蛋黃漿質(zhì)色度、粒徑分布、流變性以及漿質(zhì)蛋白分布，蛋黃漿質(zhì)凝膠的保水性、凝膠質(zhì)地結(jié)構(gòu)特性以及凝膠微觀結(jié)構(gòu)，來研究 NaCl處理對蛋黃漿質(zhì)凝膠的影響。主要研究結(jié)果如下：隨著NaCl添加量由0%增加至2%，蛋黃漿質(zhì)保水性隨NaCl濃度的增加而顯著增大（p＜0.05）；漿質(zhì)凝膠硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性均在 NaCl的作用下，凝膠系數(shù)下降，而彈性基本不變；流變學(xué)研究表明，蛋黃漿質(zhì)是彈性流體，一定量 NaCl腌制后，蛋黃漿質(zhì)凝膠性能下降；NaCl的作用會影響蛋黃漿質(zhì)粒徑分布，使部分蛋白分子產(chǎn)生聚集，粒徑變大；而對蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)并不造成影響；NaCl處理后蛋黃漿質(zhì)中蛋白、脂質(zhì)隨著鹽的不斷滲入，蛋黃脫水，脂質(zhì)不斷分解，凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白粒徑變大，結(jié)構(gòu)粗糙，而游離出來的脂質(zhì)會使凝膠中蛋白顆粒包裹起來形成皺縮狀態(tài)。因此，0.5%、1%、1.5%、2%濃度NaCl腌制蛋黃，不僅降低了蛋黃漿質(zhì)形成凝膠質(zhì)構(gòu)特性，而且形成凝膠特性下降。