趙巖 曹曉穎 周昊天 宋凌元 涂翰卿 黃思穎 趙金良

（1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教示范中心，上海 201306）

鱖（Siniperca chuatsi）屬硬骨魚綱、鱸形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、鱖屬（Siniperca），俗稱季花魚、桂花魚，其肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富、沒有小刺，是我國傳統(tǒng)淡水名貴經(jīng)濟(jì)魚類。自20世紀(jì)80年代以來，鱖人工繁殖技術(shù)的突破推動(dòng)了其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前鱖產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值超200億元，但在養(yǎng)殖過程中也存在品種退化、病害頻發(fā)等問題，鱖良種選育仍然是提高其產(chǎn)量和品質(zhì)的首要途徑。

成熟的microRNA（miRNA）是一類20-24 nt的非編碼小分子RNA，其在進(jìn)化和功能上均具有保守性［1］。通常，miRNA與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，即在轉(zhuǎn)錄后水平上影響表型［2］。miRNA的發(fā)現(xiàn)和技術(shù)的成熟，豐富了人們對(duì)蛋白質(zhì)合成控制的認(rèn)識(shí)，補(bǔ)充了在RNA水平對(duì)靶mRNA進(jìn)行更有效調(diào)節(jié)的機(jī)制，展現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控全方位、多層次的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

miRNA的研究對(duì)象遍及動(dòng)物、植物和微生物，且miRNA幾乎參與從生物胚胎發(fā)育到死亡的生命階段所有的生物過程［3］。miRNA在水產(chǎn)動(dòng)物（魚、蝦、蟹、貝）中也有研究報(bào)道，如miR-430在斑馬魚胚胎發(fā)育階段的表達(dá)和功能［4］。有關(guān)鱖miRNA的研究起步較晚，數(shù)量也較少，可分為miRNA轉(zhuǎn)錄組和單個(gè)miRNA兩類研究。迄今為止，通過高通量測(cè)序研究鱖miRNA轉(zhuǎn)錄組的報(bào)道有3篇：第一篇見于2013年，該研究以翹嘴鱖紅?。。┡c白?。旒。檠芯繉?duì)象，發(fā)現(xiàn)了186個(gè)保守和3個(gè)新miRNAs，在兩種肌肉纖維中存在60個(gè)顯著差異表達(dá)miRNA［5］；以飼養(yǎng)6個(gè)月后的慢長(zhǎng)和快長(zhǎng)翹嘴鱖為研究對(duì)象，混合大腦、腦垂體、肝臟和肌肉樣本，發(fā)現(xiàn)252個(gè)已知miRNAs和12個(gè)新miRNAs，其中36個(gè)miRNAs在組間表達(dá)差異顯著［6］；以孵化后第30天的慢長(zhǎng)和快長(zhǎng)翹嘴鱖肌肉為材料，鑒定出 433 個(gè)保守 miRNAs，組間 8 個(gè)差異 miRNAs［7］。就單個(gè)miRNA而言，miRNA-181a通過靶定小清蛋白（Parvalbumins，PVALBs）而影響鱖肌肉松弛率［8］；miR-143可以通過調(diào)控靶基因肌分化因子（MyoD）而促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和肌肉增生［9］；對(duì)翹嘴鱖進(jìn)行饑餓后再投喂，miR-10c、miR-107a、miR-133a-3p、miR-140-3p、miR-181a-5p、miR-206、miR-214［10］和 miR-222［11］的相對(duì)表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，上述miRNAs可能與鱖魚骨骼肌快速生長(zhǎng)相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)溫度升高會(huì)降低miR-146a在鱖胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)［12］。，

綜上所述，目前關(guān)于鱖miRNA轉(zhuǎn)錄組的研究多以肌肉等不同組織為研究對(duì)象，魚齡最低為孵化后30 d，研究的單個(gè)miRNA大部分與鱖魚骨骼肌發(fā)育相關(guān)。為了深入理解鱖的發(fā)育機(jī)制，本研究以鱖孵化后第3天、第17天和第28天的全魚為材料，通過高通量測(cè)序建立上述各階段miRNA組，并選取miR-199-5p和miR-203b進(jìn)一步分析其可能的mRNA靶基因及相關(guān)的調(diào)控通路。本研究首次了解鱖孵化后前30 d內(nèi)miRNAs表達(dá)特征、可以為深入了解miRNA對(duì)鱖胚胎發(fā)育過程的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)、豐富有關(guān)miRNAs和靶基因間作用的認(rèn)知，也可為鱖分子標(biāo)記輔助育種提供候選基因。

圖1 孵化后D3、D17和D28鱖形態(tài)

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用鱖魚苗取自上海市浦東新區(qū)孫農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。親魚經(jīng)激素催產(chǎn)、人工授精。受精卵在直徑70 cm的孵化桶中孵化，水溫為23-25℃。孵化當(dāng)天記為第0 天（D0），分別在孵化后第3天（D3）、第17天（D17）、第28天（D28）、第60天（D60），第90天（D90）取樣，每批隨機(jī)取20-50尾（日齡越小取樣越多）。取其中15尾D3，10尾D17、5尾D28全魚分別混合后用于小RNA測(cè)序文庫制備（圖1）。其余樣品用于熒光定量分析，熒光定量分析前需做如下處理：D17、D28 樣本去除頭、尾，D60、D90 樣本采集白?。ㄈコ[片后背鰭起點(diǎn)下背側(cè)第一肌節(jié)區(qū)域）。另取3尾體重500 g左右的健康鱖，用MS-222 麻醉，于冰上解剖，取肝、腦、腸、白肌樣本用于組織表達(dá)譜分析。所有樣品分裝于凍存管，迅速置于液氮中，并長(zhǎng)期存放于-80℃冰箱備用。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 小RNA 文庫的建立及測(cè)序 采用Trizol法提取樣品的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)（Eppendorf BioPhotometer）和瓊脂糖/EB凝膠電泳法分別確定總RNA 的純度和完整性。取質(zhì)量較好的RNA 樣品用于相關(guān)分析。采用TruSeqSmall RNA Sample Prep Kits（Illumina，San Diego，USA） 試 劑 盒 制 備 小RNA測(cè)序文庫。流程如下：用T4 RNA連接酶2將腺苷化單鏈DNA 3′接頭和5′接頭連接到小RNA上，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將140-160 bp長(zhǎng)度范圍的PCR 產(chǎn)物用6%polyacrylamide Tris-borate-EDTA 膠回收，完成文庫的制備，對(duì)構(gòu)建好的文庫用Illumina Hiseq2000/2500 進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為單端1X50 bp。

1.2.2 miRNA組數(shù)據(jù)分析 使用聯(lián)川生物公司開發(fā)的軟件處理數(shù)據(jù)。首先，清理由于樣本制備、測(cè)序接頭、非典型miRNA特征序列以及測(cè)序儀器光學(xué)數(shù)碼處理而產(chǎn)生的非純序列，保留堿基長(zhǎng)度在18-26 nt序列。然后，將剩余序列比對(duì)RFam數(shù)據(jù)庫和重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫（Repbase）以去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。經(jīng)清理、過濾后的數(shù)據(jù)稱之為Valid數(shù)據(jù)并用于后續(xù)分許。鱖尚無基因組數(shù)據(jù)，故以斑馬魚基因組為參考。使用Bowtie軟件與miRbase21.0斑馬魚及其他脊椎動(dòng)物的己知的miRNA進(jìn)行保守性分析比對(duì)，并鑒定出鱖3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的miRNAs。在比對(duì)分析中允許5′和3′末端長(zhǎng)度變化以及序列內(nèi)部存在一個(gè)錯(cuò)配的情況。用Expdiff方法兩兩比較并判斷不同發(fā)育階段樣品中miRNA的表達(dá)量是否存在顯著差異。利用維恩圖（Venn diagrams）直觀地顯示出樣品兩兩間共同檢出的miRNA個(gè)數(shù)以及差異miRNA的個(gè)數(shù)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)鱖MyoD（Gene ID：JN561167.1）、斑馬魚 Wnt5b（Gene ID NM_130937）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_130937。 用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成相關(guān)引物，序列見表1。

1.2.4 miR-199-5p / miR-203b組織表達(dá)譜及其在孵化后90 d內(nèi)表達(dá)變化 利用定量RT-PCR檢測(cè)miR-199-5p / miR-203b在肝、腦、腸、白肌及在D3、D17、D28、D60和 D90的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 miR-199-5p和 miR-203b 的靶基因驗(yàn)證 設(shè)計(jì)并合成靶基因3′UTR 區(qū)域包含 miR -203b作用位點(diǎn)及突變的引物序列（表 1），上游引物插入 XhoⅠ酶切位點(diǎn)CTCGAG，下游引物插入 NotⅠ 酶切位點(diǎn)GCGGCCGC（表 1 序列中下畫線部分）。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后與 psiCHECKTM-2 載體相連后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為 psiCHECKTM2-MyoD-3′-UTR（wt） 和 psiCHECKTM2- MyoD-3′-UTR（mutant）。培養(yǎng) 293T 細(xì)胞系，將細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到 70%時(shí)，將miR-203b mimic 分別和 psiCHECKTM2-MyoD-3′-UTR（wt）和psiCHECKTM2- MyoD-3′-UTR（mutant）進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，以 psiCHECKTM-2為對(duì)照，按 Promega 公司 Dual-Luciferase Reporter Assay System 說明書步驟檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶表達(dá)量，重復(fù)3 次。另構(gòu)建miR-199-5p 靶基因質(zhì)粒 psiCHECKTM2-Wnt-3′-UTR（wt）和psiCHECKTM2- Wnt-3′-UTR（mutant），實(shí)驗(yàn)操作同上。本實(shí)驗(yàn)所用 293T 細(xì)胞系、psiCHECK -2 空載體購自ATCC 生物公司（美國）。

1.2.6 Myod/Wnt在孵化后90 d內(nèi)的表達(dá)變化 利用定量RT-PCR檢測(cè)Myod / Wnt mRNA在D3、D17、D28、D60和 D90的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用熒光定量比較Ct值法（2-△△Ct法）分析各基因相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞試驗(yàn)重復(fù)處理3次，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析，以P＜0.05作為統(tǒng)計(jì)意義上的顯著水平。

表2 小RNA文庫的數(shù)據(jù)質(zhì)量

表3 與Rfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)后非miRNA的組成

2 結(jié)果

2.1 孵化后30 d內(nèi)3個(gè)時(shí)期鱖miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析

以孵化后不同發(fā)育時(shí)期（D3、D17和D28）的鱖全魚為研究對(duì)象分別構(gòu)建小RNA文庫。利用高通量測(cè)序獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)總數(shù)（Total）和原始測(cè)序種數(shù)（Unique），3個(gè)時(shí)期的測(cè)序總數(shù)分別為13 359 823、10 010 888和13 241 828，測(cè)序種數(shù)分別為1 788 344、2 291 006和2 200 409（表2）。經(jīng)清理過濾得到的valid 數(shù)據(jù)總數(shù)和種數(shù)分別為6 270 721，46.94% ；6 850 048，68.43% ；9 690 349，73.18% 和440 107，24.61% ；1 248 822，54.51% ；1 284 112，58.36%（表2）。Valid數(shù)據(jù)大部分分布在20-24 nt，符合Dicer 酶切割的典型特征。和Rfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA等非miRNA序列組成，見表3。

共鑒定出1 084個(gè)miRNAs，其中已知的（known，reads既有miRbase支撐也有基因組位置支撐）miRNAs 432個(gè)，保守的（conservative，reads有miRbase支撐但pre-miRNA沒有基因組位置支撐）miRNAs 624個(gè)，新的（novel，reads無 miRbase支撐但有基因組位置支撐）miRNA 28個(gè)。D17時(shí)期鑒定出的miRNA個(gè)數(shù)最多為926個(gè)，在D3和D28時(shí)期分別有763和862個(gè)。在3個(gè)發(fā)育時(shí)期都表達(dá)的有628個(gè)miRNAs，只在D3、D17和D30中表達(dá)的分別有71、104和70個(gè)miRNAs。

分別比較D17與D3，D28與D3，D28與D17兩兩之間的差異表達(dá) miRNAs（P＜0.1、P＜0.05或P＜0.01）。P＜0.1時(shí)，兩兩之間差異 miRNAs個(gè)數(shù)分別為417，430，265（包含上調(diào)和下調(diào)）；P＜0.05時(shí)，差異miRNAs個(gè)數(shù)分別為391、414和243；P＜0.01時(shí)，差異miRNAs個(gè)數(shù)分別為362、388和213。不同顯著性p值的閾值下，D17和D3間差異miRNAs數(shù)均多于 D28和D17間差異miRNAs數(shù)。D17和D3相比，上調(diào)miRNAs明顯多于下調(diào)；D28和D17相比，下調(diào)miRNAs明顯多于上調(diào)（圖2）。

圖2 不同時(shí)期兩兩之間的差異表達(dá)miRNAs

在眾多差異表達(dá)的miRNAs中篩選統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異最顯著的（P value = 0）進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在D3到D28階段持續(xù)下調(diào)的miRNAs有dre-miR-10d-5p，dre-miR-9-7-3p，dre-miR-10c-5p，dre-miR-222a-3p，dre-miR-26a-5p和dre-miR-199-5p。持續(xù)上調(diào)的miRNAs有 dre-miR-200c-3p，aca-miR-194-5p，dremiR-192，dre-let-7a，dre-let-7h，dre-let-7e，dre-miR-1388-5p，dre-miR-1，dre-miR-199-3-3p，dre-let-7g，dre-miR-122，dre-miR-203a和 dre-miR-203b。

圖3 miR-199-5p / miR-203b組織表達(dá)譜

2.2 miR-199-5p / miR-203b組織表達(dá)譜及其在孵化后90 d內(nèi)表達(dá)量的變化

miR-199-5p / miR-203b在檢測(cè)的組織中均有一定的表達(dá)，但表達(dá)豐度存在一定差異，miR-199-5p在白肌和腸道組織中的表達(dá)較高（圖3-A），miR-203b在白肌中的表達(dá)最高（圖3-B）。

進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199-5p / miR-203b與肌肉發(fā)育是否相關(guān)，利用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)miR-199-5p /miR-203b在D3（全魚），D17（軀干）、D28（軀干），D60（白?。90（白?。┑南鄬?duì)表達(dá)情況。miR-199-5p隨發(fā)育時(shí)期延續(xù)而表達(dá)逐漸減弱（圖4-A）。miR-203b隨發(fā)育時(shí)期延續(xù)而表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖4-B）。

圖4 miR-199-5p / miR-203b在孵化后90 d內(nèi)表達(dá)變化量

2.3 miR-199-5p和miR-203b的靶基因驗(yàn)證

利用 TargetScan 預(yù)測(cè)miR-199-5p和 miR-203b的靶基因分別為Wnt和Myod。

與 轉(zhuǎn) 染 psiCHECKTM-2 空 載 體 或psiCHECKTM2- Wnt-3′-UTR（mutant） 相 比，miR-199-5p mimic 和 psiCHECKTM2- Wnt -3′-UTR（wt）共轉(zhuǎn)染時(shí)熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05）（圖5-A）與轉(zhuǎn)染 psiCHECKTM-2 空載體或psiCHECKTM2-Myod-3′-UTR（mutant） 相 比，miR-203b mimic 和psiCHECKTM2-MyoD-3′-UTR（wt）共轉(zhuǎn)染時(shí)熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05）（圖5-B）。

2.4 Wnt/ Myod在孵化后90 d內(nèi)表達(dá)變化

Wnt mRNA 隨發(fā)育時(shí)期延續(xù)而表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖6-A），MyoD mRNA 在D17表達(dá)量較高，之后表達(dá)量逐漸減弱（圖6-B）。

圖5 miR-199-5p和miR-203b的靶基因驗(yàn)證

圖6 Wnt/ Myod在孵化后90 d內(nèi)表達(dá)變化

3 討論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得孵化后D3、D17和D28時(shí)期鱖全魚miRNA轉(zhuǎn)錄組，經(jīng)清理過濾后得到的valid 數(shù)據(jù)總數(shù)分別為6 270 721、6 850 048和9 690 349，樣品間存在一定的差異，D28時(shí)期獲得的數(shù)據(jù)最多，推測(cè)發(fā)育早期個(gè)體較小對(duì)文庫的建立可能有一定影響。本研究中共鑒定出已知的miRNA known 432個(gè)，不同發(fā)育時(shí)期中鑒定出的miRNA個(gè)數(shù)存在明顯的差異，有在3個(gè)發(fā)育時(shí)期都表達(dá)的也有只在某一時(shí)期表達(dá)的miRNAs，D17時(shí)期鑒定出的miRNA個(gè)數(shù)最多，且D17和D3間差異miRNAs數(shù)多于D28和D17間差異miRNAs數(shù)，這些充分說明生物體發(fā)育過程中miRNA對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)效性，也暗示了在D17時(shí)期miRNA更廣泛的參與調(diào)控，相應(yīng)得個(gè)體本身也可能經(jīng)歷著更多的發(fā)育變化。

對(duì)差異表達(dá)最顯著（P value = 0）且在3個(gè)時(shí)期都表達(dá)的miRNAs進(jìn)行歸類，有在上述發(fā)育階段持續(xù)下調(diào)的miRNAs（dre-miR-10d-5p，dre-miR-9-7-3p，dre-miR-10c-5p，dre-miR-222a-3p，dre-miR-26a-5p和dre-miR-199-5p），也有持續(xù)上調(diào)的miRNAs（dre-miR-200c-3p，aca-miR-194-5p，dre-miR-192，dre-let-7a，dre-let-7h，dre-let-7e，dre-let-7g，dremiR-1388-5p，dre-miR-1，dre-miR-199-3-3p，dremiR-122，dre-miR-203a-3p 和 dre-miR-203b-3p）。

已有的研究表明這些miRNAs與生物個(gè)體發(fā)育相關(guān)，如miR-10家族會(huì)和調(diào)控生物形體發(fā)育的Hox基因共表達(dá)，并對(duì)Hox的轉(zhuǎn)錄起到調(diào)控作用［13］；miR-26調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的分化，并通過抑制 ctdsp2（Carboxy-terminal domain RNA polymerase II polypeptide A small phosphatase 2）而參與神經(jīng)形成［14-15］；miR-221可以通過靶定干細(xì)胞標(biāo)志物CD117而阻止內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增生［16］，此外也和血管形成相關(guān)［17］；mir-200家族在上皮細(xì)胞-間充間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到重要作用，并可以維持細(xì)胞的上皮表型［18］；MiR-194只在脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，其在小鼠中的靶基因是RhoB（Ras homolog gene family，member B），該基因可以調(diào)控微絲骨架重組，進(jìn)而影響內(nèi)耳螺旋神經(jīng)元形成［19］；miR-192是由p53誘導(dǎo)的miRNA，可以廣泛的參與細(xì)胞周期調(diào)控［20］，在羊骨骼肌發(fā)育過程中，miR-192可以調(diào)控羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞sheep satellite cells（SCs）增殖和成肌分化，其靶基因是眼癌（Retinoblastoma 1，RB1）［21］；miR-1388 可以抑制 GATA1（Erythroid transcription factor）和 ALAS2（Erythroid-specific delta-aminolaevulinate synthase）的表達(dá)，進(jìn)而影響紅細(xì)胞分化［22］；miR-1屬于肌肉特異性miRNA，參與調(diào)控心肌在內(nèi)的多種肌肉組織的發(fā)育和生理［23］；let-7 是被大家所熟知的可以控制干細(xì)胞分裂和分化時(shí)期的保守miRNA［24］；miR-122在人體肝臟中隨個(gè)體發(fā)育會(huì)不斷增加直至成年，占到肝臟總miRNA的70%以上，是在各種組織表達(dá)最多的miRNA之一［25］；MiR-199a-3p對(duì)成肌細(xì)胞分化起著非常重要的作用。抑制miR-199a-3p，肌細(xì)胞生成素（Myogenin，MyoG）、肌球蛋白重鏈（MyHC）表達(dá)均顯著升高，肌萎縮標(biāo)記基因MuRF1表達(dá)降低，同時(shí)肌管形成增加，融合指數(shù)和肌管直徑升高［26］。本研究中，上述miRNAs在鱖早期發(fā)育過程中表現(xiàn)活躍（差異表達(dá)顯著），且存在持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的規(guī)律性表達(dá)，表明上述miRNAs參與了鱖早期發(fā)育，且在功能上可能是保守的。

在持續(xù)下調(diào)的基因中選擇dre-miR-199-5p做深入分析。miR-199是一類家族，只在脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)且參與調(diào)控多種發(fā)育機(jī)制，在肌肉發(fā)育調(diào)控方面，miR-199a 是重要的心肌細(xì)胞尺寸調(diào)控基因［27］。miR-199a-5p通過靶向SIRT1促進(jìn)心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)［28］；miR-199a-5p參與調(diào)控平滑肌肥大以及器官重構(gòu)。抑制miR-199a-5p的表達(dá)，可以上調(diào)包括WNT2在內(nèi)的諸多靶基因，進(jìn)而促進(jìn)膀胱平滑肌細(xì)胞增殖，同時(shí)減小細(xì)胞體積［29］，Wnt 信號(hào)通路參與調(diào)控肌肉的形成與分化［30］。本實(shí)驗(yàn)中，鱖孵化后到D90，Wnt mRNA 表達(dá)隨發(fā)育推移而持續(xù)增強(qiáng)。miR-199-5p在白肌和腸道組織中的表達(dá)較高，miR-199-5p隨發(fā)育時(shí)期延續(xù)而表達(dá)逐漸減弱，miR-199-5p和 Wnt mRNA的表達(dá)表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Wnt 是miR-199-5p的靶基因。綜上，說明miR-199-5p可能和鱖肌肉生長(zhǎng)相關(guān)。

在持續(xù)上調(diào)的基因中選擇dre-miR-203做深入分析。通常miR-203 在皮膚發(fā)育和生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。有研究表明該miRNA也和骨骼肌相關(guān)，如在雞骨骼肌中，miR-203可以抑制細(xì)胞增殖、成肌細(xì)胞的增殖和分化，上述過程中miR-203靶基因?yàn)閏-JUN和 MEF2C，c-JUN 在細(xì)胞增殖中起重要作用，而MEF2C 是肌肉發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［31］。同時(shí)，miR-203可以通過調(diào)控和肌纖維肥大相關(guān)的靶基因EIF4進(jìn)而影響雞肌肉質(zhì)量［32］。在羅非魚骨骼肌中，稚魚時(shí)期miR-203b表達(dá)低，成魚時(shí)期高。靜默miR-203b在羅非魚體內(nèi)的表達(dá)，可以導(dǎo)致MyoD上調(diào)，并激活下游基因。MyoD 與成肌細(xì)胞增殖和肌肉增生相關(guān)［33］。本實(shí)驗(yàn)中，MyoD mRNA 在D17表達(dá)量較高，之后表達(dá)量逐漸減弱，可能由于D17時(shí)期肌肉增生較快，而D28之后肌肉增生下降，轉(zhuǎn)向肥大。miR-203b在鱖白肌中的表達(dá)最高，隨發(fā)育時(shí)期延續(xù)miR-203b表達(dá)逐漸增強(qiáng)，D28之后，miR-203b和MyoD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MyoD是miR-203b的靶基因，綜上說明miR -203b可能和鱖肌肉生長(zhǎng)相關(guān)，且在發(fā)育后期miR-203b對(duì)MyoD抑制作用更加明顯。

本研究中發(fā)現(xiàn)的miRNAs涉及個(gè)體發(fā)育的各個(gè)方面，其中和肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNAs較多。以往只以肌肉為材料研究鱖骨骼肌發(fā)育相關(guān)miRNA，本研究以鱖發(fā)育早期全魚為材料建立轉(zhuǎn)錄組，篩選顯著差異的miRNA，也能發(fā)現(xiàn)和鱖肌肉生長(zhǎng)相關(guān)的候選miRNA，可能是因?yàn)樵谠缙谂咛ルA段肌肉本身所占的比例較大，取樣時(shí)肌肉生長(zhǎng)相關(guān)的候選miRNA會(huì)富集。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得鱖孵化后3個(gè)發(fā)育時(shí)期（D3、D17和D28）全魚miRNA轉(zhuǎn)錄組，共鑒定出432個(gè)已知的miRNAs，28個(gè)新的miRNA。鱖早期發(fā)育過程中miRNA的調(diào)控作用具有時(shí)效性，表現(xiàn)為上述不同發(fā)育時(shí)期中miRNA個(gè)數(shù)存在明顯差異，其中D17時(shí)期miRNA個(gè)數(shù)最多。一些和發(fā)育相關(guān)的miRNAs在上述時(shí)期的表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量表明miR-199-5p和miR-203b在鱖白肌中均有較高的表達(dá)，miR-199-5p /miR-203和 WnT / MyoD在一定發(fā)育時(shí)期分別表現(xiàn)負(fù)相關(guān)，雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證了WnT 和 MyoD分別是miR-199-5p和miR-203的靶基因。綜上，miR-199-5p、miR-203可能與鱖骨骼肌肉發(fā)育相關(guān)。