張立杰 李曉玉 岑由飛 周祖平 蒲仕明，

（1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，桂林 541004；2. 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004；3. 廣西師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，桂林 541004）

衰老常伴隨著相關(guān)性疾病的發(fā)生，包括各組織、器官疾病如惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、組織/器官纖維化等［1］。因此，延緩衰老進(jìn)程中免疫系統(tǒng)的“老化”是重要的研究方向。造血干細(xì)胞是所有免疫細(xì)胞和血細(xì)胞的源泉，是機(jī)體免疫監(jiān)控的發(fā)出者。HSCs經(jīng)分化，形成MPPs，經(jīng)再分化形成共同淋巴系祖細(xì)胞（Common lymphocyte progenitors cells，CLPs）和共同髓系祖細(xì)胞（Common myeloid progenitor cells，CMPs），前者經(jīng)一系列的分化形成B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞，形成獲得性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞組分；后者繼續(xù)分化為GMPs和MEPs（Megakaryocyte/erythroid progenitor cells，巨核細(xì)胞 /紅細(xì)胞祖細(xì)胞），GMPs經(jīng)一系列的分化形成先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞組分（粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等）［2-3］。然而，當(dāng)外傷感染，腫瘤等病理情況下，GMPs的子細(xì)胞會停留在未成熟的狀態(tài)，該組分的細(xì)胞被稱之為“髓源性抑制細(xì)胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）”［4］。MDSCs能抑制 T 細(xì)胞的活化與增殖，是細(xì)胞免疫失能的“原兇”［5］。因此，本研究從免疫的源頭出發(fā)，分析HSCs及其下游造血祖細(xì)胞的發(fā)育情況，以詮釋衰老進(jìn)程中免疫系統(tǒng)“老化”，逐漸失能，致使更多伴隨衰老進(jìn)程疾病發(fā)生的原因。本研究將為衰老進(jìn)程中機(jī)體免疫下降提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6j小鼠，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，維持于廣西師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動物中心。選擇8周（青年小鼠）、1年（中年）、2年（老年）的健康雄鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材 紅細(xì)胞裂解液（Solarbio），胎牛血清、DMEM basic（Gibco），F(xiàn)ixation/Permeabilization buffer、7-AAD、Anti-Mouse CD34-PE、Anti-Mouse Lin-FITC、Anti-Mouse CD127-PerCP Cy5.5、Anti-Mouse CD117-APC eFlour 780、Anti-Mouse Sca-1-PE-Cy7、Anti-Mouse CD16/32-APC、Anti-Mouse Gr-1-PE、Anti-Mouse CD11b-APC、Anti-Mouse B220-FITC、Anti-Mouse/Human Ki67-PE、Anti-Mouse CD127-PerCP-Cy5.5（eBioscience），70ul細(xì)胞篩網(wǎng)（BD）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 流式細(xì)胞分析儀（BD FACSVerse），冷凍離心機(jī)Labofuge 400 R、超純凈去離子水組合系統(tǒng)Nanopure（Thermo Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓細(xì)胞（Bone marrow cells，BMs）的提取 斷頸處死小鼠，將小鼠浸泡于75%酒精20 s；取其股骨和脛骨，并剪去骨兩端；用吸取 DMEM完全培養(yǎng)液（含1%雙抗，10% FBS）的注射器吹出骨髓組織；隨后用移液槍將骨髓吹打成單細(xì)胞懸液，并收集于離心管中。經(jīng)離心（4℃，1 200 r/min，5 min，下同）后，加入紅細(xì)胞裂解液裂解2 min，之后加入PBS稀釋終止裂解并經(jīng)離心后棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)過濾后用70 μm細(xì)胞篩過濾，經(jīng)計數(shù)后待用。

1.2.2 小鼠造血細(xì)胞豐度分析 分別取青年、中年、老年小鼠骨髓2×106細(xì)胞，經(jīng)離心后與特定抗體組合（各取1test抗體經(jīng)混合后再稀釋100倍）混合均勻，將細(xì)胞置于4℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后洗滌細(xì)胞，加人1.5 mL PBS用于流式分析。同時準(zhǔn)備空白對照組細(xì)胞和孵育單獨(dú)抗體的細(xì)胞，分別用于流式細(xì)胞儀電壓和補(bǔ)償調(diào)節(jié)。

1.2.3 小鼠造血干/祖細(xì)胞活化與周期分析 細(xì)胞經(jīng)1.2.2行抗體孵育，用Fixation/Permeabilization buffer進(jìn)步固定滲透（按該試劑盒說明書上執(zhí)行）。經(jīng)滲透結(jié)束后經(jīng)離心，去上清，加入稀釋100倍的Ki-67，避光、4℃孵育30 min（活化分析）?；蚣尤?00 μL PBS，重懸細(xì)胞，再加入5 μL7-AAD后常溫避光孵育15 min（細(xì)胞周期分析），用于流式細(xì)胞分析其Ki67+細(xì)胞或細(xì)胞周期時相分布。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析與處理 流式數(shù)據(jù)用Flowjo7.6上分析；所得整理數(shù)據(jù)在prism軟件上行Two-way ANOVA分析或t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠衰老進(jìn)程中HSPCs豐度發(fā)生特征性變化

為分析隨年齡增長小鼠HSPCs的豐度變化，分別從老年、中年和青年C57BL/6j小鼠中提取骨髓細(xì)胞，標(biāo)記熒光偶聯(lián)抗體，行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在衰老進(jìn)程中造血干/祖細(xì)胞豐度發(fā)生特征性變化（圖1）。青年小鼠、中年小鼠、老年小鼠骨髓細(xì)胞中HSCs、MPPs的豐度隨著年齡的增加逐漸 升 高（HSCs：0.009±0.002%VS 0.019±0.005%VS 0.061±0.013%；MPPs：0.238±0.016% VS 0.301±0.011% VS 0.332±0.023%，P＜0.05）。與之相似的先天免疫細(xì)胞的祖細(xì)胞GMPs隨著年齡的增加其在骨髓細(xì)胞中的比例也逐漸升高（0.608±0.106% VS 1.023±0.125% VS 1.330±0.089%，P＜0.05）。 但 處于MPPs和GMPs之間的CMPs隨著年齡的增加反而逐漸降低（0.583±0.103% VS 0.388±0.052% VS 0.227±0.032%，P＜0.05）。巨核細(xì)胞 /紅細(xì)胞祖細(xì)胞隨小鼠年齡增加未表現(xiàn)出明顯的變化。隨著小鼠年齡增長，其造血干/祖細(xì)胞發(fā)生的特征變化提示HSCs可能逐漸被活化，細(xì)胞得以增殖累積，且偏向髓系細(xì)胞分化。

圖1 青年、中年和老年小鼠骨髓細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞的豐度分析

2.2 小鼠衰老進(jìn)程中HSPCs增殖活性改變

為分析小鼠骨髓HSPCs增殖活性是否改變，首先分析了HSCs的激活情況；其次分析了造血干/祖細(xì)胞是否加速細(xì)胞分裂；利用Ki67和7-AAD檢測不同年齡階段的小鼠HSCs退出靜息和HSPCs進(jìn)入細(xì)胞周期的情況。結(jié)果顯示，小鼠隨著年齡的增加，HSCs退出G0期（Ki67+）的細(xì)胞增多。相比青年小鼠，老年小鼠HSCs更多被活化（老年：青年=0.096±0.020% VS 0.018±0.003%），進(jìn)入細(xì)胞周期（圖2-A）。與之相一致的是，隨著小鼠年齡的增加，HSCs進(jìn)入分裂期（S/G2/M）的頻率增加（圖2-B）。小鼠骨髓造血祖細(xì)胞隨著年齡增長，細(xì)胞周期時相同樣的發(fā)生顯著性改變。與細(xì)胞豐度檢測結(jié)果一致，MPPs、GMPs隨年齡增加進(jìn)入分裂期的細(xì)胞比例也增加，細(xì)胞分裂活躍。CMPs在中、老年小鼠骨髓中分裂期的細(xì)胞減少。MEPs分裂期的細(xì)胞比例在小鼠衰老進(jìn)程中并未發(fā)生明顯改變。以上結(jié)果揭示了隨著小鼠年齡的增長，其部分HSCs被活化，經(jīng)過快速分裂和細(xì)胞增殖，細(xì)胞得以累積；同時細(xì)胞加速分化形成下游細(xì)胞，并偏向髓系祖細(xì)胞分化。

圖2 衰老進(jìn)程中小鼠HSPCs細(xì)胞活化與周期時相分布

2.3 小鼠衰老進(jìn)程中HSPC偏向髓系分化

為進(jìn)一步驗(yàn)證在衰老進(jìn)程中小鼠骨髓HSPCs是偏向髓系方向分化的，本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了骨髓中免疫細(xì)胞產(chǎn)生情況（因T細(xì)胞成熟于胸腺，故未進(jìn)行T細(xì)胞含量的分析）。結(jié)果（圖3）表明，老年小鼠骨髓中B淋巴細(xì)胞（B220+）明顯減少（老年：青年=8.14±1.84% VS 20.72±2.22%，圖3-A）。同時，老年小鼠骨髓中髓源性抑制細(xì)胞（Gr-1+CD11b+）比例顯著高于青年小鼠中的髓源性抑制細(xì)胞（55.90±5.47% VS 32.4±1.42%，圖3-B）。該結(jié)果證明了衰老進(jìn)程中，小鼠HSCs偏向髓系方向分化，且免疫抑制細(xì)胞群在積累。

圖3 衰老進(jìn)程中小鼠骨髓中免疫細(xì)胞的豐度分析

3 討論

包括癌癥在內(nèi)的許多人類疾病的發(fā)病率會隨著年齡的增加而提高［6］，這些疾病增加的原因之一是免疫系統(tǒng)“老化”。造血干細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的發(fā)出者，是衰老進(jìn)程中免疫下降、免疫細(xì)胞失衡的根本原因。為此檢測造血干/祖細(xì)胞在衰老進(jìn)程中的細(xì)胞豐度、活化、增殖情況，并初步分析了免疫細(xì)胞的組分變化。據(jù)研究結(jié)果得出如下結(jié)論：（1）在衰老進(jìn)程中HSPCs豐度增加，細(xì)胞增殖活躍；（2）HSCs的分化偏向髓系抑制細(xì)胞，產(chǎn)生大量GMPs和經(jīng)典的髓源性抑制細(xì)胞。衰老與腫瘤、應(yīng)急等病理情況有著相似的HSPCs豐度變化特征。在腫瘤進(jìn)程中，HSCs大量激活與擴(kuò)增，并促進(jìn)下游MPPs、GMP積累，髓源性抑制細(xì)胞也積累，促進(jìn)免疫抑制［7］；在感染狀態(tài)下，HSCs同樣得到活化，髓系細(xì)胞增殖加速［8-9］。揭示了HSC活化、髓系擴(kuò)增是衰老和應(yīng)急狀態(tài)下的一個共同特征。

HSCs的偏向分化在HSCs自我更新中就得以發(fā)展。Weksberg等［10］發(fā)現(xiàn)側(cè)群細(xì)胞（Side population，SP）CD150+或 LSK（Lin-Sca-1+CD117+）CD150+的造血干細(xì)胞亞群在老年（80week）小鼠中明顯高于青年小鼠（8week），該群細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)分化主要向髓系細(xì)胞分化，提示了該亞群的HSCs的偏髓系分化源于HSCs本身的髓系偏向。其他的研究也表明，表型LKS CD34-Flt3-的HSCs CD150上調(diào)表達(dá)，隨著年齡的增長，該亞群細(xì)胞在整個老年HSCs池中的占有支配地位。該HSCs亞群移植重建后的造血發(fā)生了骨髓細(xì)胞偏倚［11-12］?；谶@些結(jié)果與研究結(jié)論為本研究中髓系細(xì)胞偏向分化給予佐證。

本研究組的前期研究提出了早期造血祖細(xì)胞（主要是GMP）具有免疫抑制功能［7］。然而在衰老進(jìn)程中，HSCs的活化和擴(kuò)增，以及MPP的擴(kuò)增的最終目的可能是為GMP及更下游的髓系細(xì)胞的積累“服務(wù)”（基于在衰老進(jìn)程中造血細(xì)胞的偏髓系分化發(fā)育）。積累的髓系細(xì)胞明顯為免疫抑制奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)，以致衰老伴隨著高頻率疾病的發(fā)生。本研究雖然未提供免疫抑制的直接證據(jù)，但正常來源GMPs和MDSCs同樣有著免疫抑制功能，這在本研究組之前的工作中已經(jīng)得到證實(shí)。另外，在衰老進(jìn)程中CD8+T細(xì)胞增殖能力減弱，未成熟的T細(xì)胞大量積累［13］。以上足以證明髓系抑制細(xì)胞在T細(xì)胞的增殖與活化中可能發(fā)揮著重要的抑制作用。

近年來HSLs經(jīng)典的分化通路受到?jīng)_擊。Adolfsson［14］提 出 MPPs直 接 分 化 形 成 GMPs和MEPs，沒有CMPs的存在。同樣地，在人類HSCs中也得到了相同的結(jié)果［15］。本研究中CMPs的豐度會隨著衰老進(jìn)程和腫瘤發(fā)生［7］而細(xì)胞比例下降，與髓系擴(kuò)增雖然相矛盾，但這一現(xiàn)象可能為Adolfsson J提出分化通路提供參考。

衰老免疫主要問題之一是免疫細(xì)胞失衡，因此針對免疫細(xì)胞失衡可開展如下工作：著重從免疫細(xì)胞的源頭——HSCs上解決髓系偏向分化的問題，促進(jìn)免疫細(xì)胞平衡發(fā)育；提高老年機(jī)體免疫器官功能作用，防范如老年胸腺等器官的衰竭，提高老年機(jī)體獲得性免疫細(xì)胞的再生能力；促進(jìn)髓系細(xì)胞成熟發(fā)育，減少未成熟細(xì)胞、髓系抑制細(xì)胞的積累。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓細(xì)胞中HSCs和MPPs、GMPs的豐度隨著年齡的增加而顯著升高，細(xì)胞分裂能力增強(qiáng)。GMP及其下游的髓系抑制細(xì)胞積累。結(jié)果揭示了在衰老進(jìn)程中HSCs被活化，增殖并偏向髓系抑制細(xì)胞分化與積累，抑制機(jī)體免疫功能。