湯初美 朱龍佼 郭順堂 苗敬 許文濤

（中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100083）

1 食源性致病菌的特點及食品安全事故

雖然全球醫(yī)療水平日漸提高，但頻發(fā)的食品安全事故卻對人們的生命健康造成了巨大的威脅。因此，國際社會給予食品質(zhì)量安全越來越高的關(guān)注度。其中，由食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病是目前首要的食品安全問題之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的定義，食源性疾病為“凡是通過攝食而進入人體的病原體，使人體患感染性或中毒性疾病，統(tǒng)稱為食源性疾病”，如常見的食物中毒、腸道傳染病、寄生蟲病及人畜共患傳染病。另外，一些由化學性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病也屬于此列。由于來源多、分布廣、污染原因多樣、接觸機會豐富、防范難度較大等原因，由食源性致病菌引起的食物中毒事故頻發(fā)，致病人數(shù)在所有中毒種類中最多，達到數(shù)億人。故食源性致病菌已成為全球范圍內(nèi)最突出的污染源。

1.1 食源性致病菌的特點

1.1.1 致病性強，分布范圍廣 食源性致病菌數(shù)量繁多，大量分布在人類可接觸的自然環(huán)境中，無處不在。同時，人類食用的食品本身是微生物的天然培養(yǎng)基，又為感染食源性致病菌增加了可能。常見的食源性致病菌有沙門氏菌（Salmonella）、腸出血性大腸桿菌（Enteroheamorrhagic E.coli，EHEC）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。

沙門氏菌［1］主要存在于肉、禽、蛋等食用動物性食品中。因未煮熟煮透或儲存場所發(fā)生交叉污染等可導致中毒者出現(xiàn)胃腸炎、傷寒和副傷寒等癥狀。

大腸菌群［2］在自然界中廣泛存在，在人類以及其他恒溫動物活動或糞便污染的場所更為密集。其主要致病菌株腸出血性大腸桿菌能引起人類出現(xiàn)出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜。

金黃色葡萄球菌［3］在空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到?？赡芤l(fā)中毒的食品種類較多，除了常見的奶、肉、蛋、魚及其制品外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉也有致毒的可能性。由于這是一種能產(chǎn)生毒素的侵襲性細菌，能較大程度地破壞腸道，故引發(fā)的腸炎多為急性，且中毒癥狀嚴重。

單增李斯特菌［4］是高病死率疾病如菌血癥、腦膜炎、流產(chǎn)的病原，對極端自然條件的適應性好-可耐受較高的溫度和滲透壓。土壤、地表水及植物爛菜中的單增李斯特菌易被動物攝入，以口腔-糞便的路徑傳播。

食用海產(chǎn)品時燒煮不徹底或二次污染容易引發(fā)副溶血性弧菌［5］中毒，導致感染性腹瀉等癥狀。這種嗜鹽性海洋性細菌常見于近海水域、海水沖積物和魚蝦貝殼類產(chǎn)品中，人類接觸食用的幾率較大，食物中毒案例逐年增多，是惡性影響最大的食源性病原菌之一。

1.1.2 與加工、貯存和流通環(huán)境密切相關(guān) 在食品加工、儲存、流通到食用的一系列環(huán)節(jié)中，每一個過程都可能被生物源污染。以細菌污染為例。食品原料可能存放在適合細菌生長和繁殖的環(huán)境中從而易被侵染；加工和貯存過程中流程的欠秩序性可能導致原料和成品的交叉污染，車間設備的衛(wèi)生不達標或者加工人員個人不良的衛(wèi)生習慣也是細菌潛在的污染原因；不專業(yè)的運輸操作或者與運輸過有害化工原料的運輸工具先后運輸、混合運輸?shù)纫彩羌毦廴镜碾[患；另外，對于包裝食品。包裝封口破損或者使用隔離、殺滅細菌效果欠佳的包裝材料，在分裝過程中也可能發(fā)生不同程度的再次污染。

除此之外，任何食品包裝殺菌加工方式都只是暫時性的。嚴格管控的食品加工、貯存和流通可以控制和降低污染程度，但無法完全避免和杜絕上述過程中的污染情況。

1.2 歷史上由食源性致病菌引起的安全事故

本節(jié)以食品種類為線索，介紹一些歷史上的食源性致病菌安全事故，對食源性致病菌與食品安全事故的關(guān)系及背景進行概括性闡述。

1.2.1 海產(chǎn)品 2011年9月，華盛頓州有5人因食用問題生蠔感染弧菌病。美國食品藥物管理局（FDA）和華盛頓衛(wèi)生部于當月發(fā)布了公告，并將所有去過華盛頓州和接觸過問題生蠔的人包括在危險人群之內(nèi)［6］。國內(nèi)方面，2011年9月，江陰市某公司食堂相繼有58人出現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀。經(jīng)調(diào)查為一起受副溶血性弧菌污染的過期海鮮引起的細菌性食物中毒［7］。

1.2.2 初級農(nóng)產(chǎn)品 1996年5月下旬，O157∶H7型大腸桿菌肆虐日本群島，從岡山、廣島到大坂、東京，共有44個都道府縣發(fā)生了集體食物中毒事件，造成萬余人中毒、近千人住院、100多所中小學停課，且有若干例死亡［8］。日本厚生縣及大坂政府建立聯(lián)合調(diào)查組，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，此次食物中毒所感染的大腸桿菌O157∶H7來自蘿卜苗。

1.2.3 加工農(nóng)產(chǎn)品 2000年夏天，日本關(guān)西地區(qū)大阪市發(fā)生了新世紀以來最大規(guī)模的食物中毒事件。6月27日，大阪市政府和雪印乳業(yè)公司接到報告，有人飲用雪印乳業(yè)公司大阪工廠制造的低脂奶后發(fā)生嘔吐、腹瀉和腹痛等食物中毒癥狀［9-10］。至7月10日，半個月內(nèi)出現(xiàn)中毒癥狀者達到了14 780人。經(jīng)過調(diào)查，雪印公司北海道大樹工廠在生產(chǎn)大阪工廠使用的脫脂奶粉原料時因停電物料滯留了約4 h，存儲剩余脫脂乳和濃縮工序中進行回收的奶罐也因停電未被冷卻，其中的物料被放置了9 h以上，由此導致了金黃色葡萄球菌的繁殖，生成大量A型腸毒素。該工廠在生產(chǎn)過程中發(fā)生的以上不符合脫脂奶粉活性菌相關(guān)標準要求的違規(guī)行為，最終釀成了這起特大食品安全事故。

2 2011年德國腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情事件介紹

2.1 概述

2011年5-7 月［11］，德國北部出現(xiàn)腸出血性大腸桿菌感染疫情，截至5月26日，德國已出現(xiàn)276例相關(guān)的溶血性尿毒綜合征病例，2例死亡。截至6月30日全球共報告了4 137例EHEC 感染和溶血性尿毒綜合征（Hemolytic uremic syndrome，HUS）病例，50例死亡。本次疫情席卷整個德國，歐盟的其他國家也受到不同程度的影響，并波及至美國和加拿大，共計16個國家。這是迄今為止德國國內(nèi)乃至全世界范圍內(nèi)最大規(guī)模的腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情。

經(jīng)過調(diào)查，最終世界衛(wèi)生組織在丹麥的合作實驗室發(fā)布公告：造成此次疫情的是一種罕見的大腸桿菌菌株O104∶H4，人體中曾有發(fā)現(xiàn)，但此菌株導致溶血性尿毒綜合征的暴發(fā)并無先例［12-13］。

2.2 事件發(fā)現(xiàn)及蔓延情況

2011年5月25日起，在第一例感染大腸桿菌的報告病例——德國西北部一位83歲的老婦感染大腸桿菌死亡之后的一周內(nèi)，陸續(xù)有超過400人確認或疑似被腸出血性大腸桿菌感染，其中40人病情嚴重。德國以外的丹麥、瑞典、英國和荷蘭也發(fā)現(xiàn)疑似病例約300個。疫情以每天200人左右的速度蔓延，截至6月3日，德國腸出血性大腸桿菌感染者的數(shù)目達到1 733人，死亡17人，520人出現(xiàn)危及生命的嚴重溶血性尿毒綜合征。

3 致病性大腸桿菌的傳播途徑

大腸桿菌（Escherichia coli）又稱大腸埃希氏菌，主要生活在人和動物的大腸內(nèi)，由Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)。由于大腸桿菌是腸道中數(shù)量最多的一種主要細菌，人們在很長一段時間內(nèi)都認為它沒有致病性，屬于正常腸道菌群。直到20世紀中葉，人們才獲得部分特殊血清型的大腸桿菌具有病原性的認識。

致病性大腸桿菌按照生物學特性的差異可分為以下6類：腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸黏附性大腸桿菌（EAEC）。

動物傳染源在腸出血性大腸桿菌感染過程中扮演主要的角色。以帶菌牛、帶菌雞為來源的動物性食品如牛肉、牛奶、雞肉、雞蛋等均可以成為腸出血性大腸桿菌污染鏈上的一環(huán)。而帶菌動物活動、排泄造成的草場、水體等場所污染，更能帶來嚴重的危害。另外，在此類人畜共患病中，衛(wèi)生欠佳情況下的人與人密切接觸也可促進病原體的傳播。

除帶菌體為根源的傳播外，其他方式污染水源或食物導致的腸出血性大腸桿菌中毒也有記錄。主要是水體中大腸桿菌超標或食物未燒熟煮透、未消毒所造成。

4 腸出血性大腸桿菌的中毒癥狀及危害

被腸出血性大腸桿菌感染之后，潛伏期為1-14 d，常見為4-8 d。輕者不出現(xiàn)任何異常體征，或僅出現(xiàn)輕度腹瀉。部分患者出現(xiàn)發(fā)熱或上感，一般3 d內(nèi)可消退。多數(shù)患者5-10 d內(nèi)痊愈。中毒嚴重者則可引發(fā)出血性腸炎，其中，老人和兒童等免疫力較弱者可能在發(fā)病2周內(nèi)出現(xiàn)并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征或血栓性血小板減少性紫癜等。

4.1 出血性腸炎

出血性腸炎是腸出血性大腸桿菌感染中較為普遍的癥狀。早期發(fā)生右下腹劇烈疼痛、腹瀉，依次為水樣便和鮮血便，常伴低熱或不發(fā)熱，病程7-10 d，有時可延長達12 d。在乙狀結(jié)腸鏡檢查中見腸黏膜充血、水腫、腸壁張力低下；鋇灌腸X線檢查中見升結(jié)腸、橫結(jié)腸黏膜下水腫，也是出血性腸炎的典型表現(xiàn)。

4.2 腎溶血性尿毒綜合癥

溶血性尿毒綜合征的病原體種類繁多，腸出血性大腸桿菌僅為其中一種。以急性腎衰、血小板減少癥和微血管異常溶血性貧血為主要表現(xiàn)、血尿、少尿、無尿、皮下黏膜出血等為主要臨床癥狀，腎溶血性尿毒綜合癥的危害顯著。兒童和老人作為腸出血性大腸桿菌感染中的最易感人群，病死率高達10%-30%。

4.3 血栓性血小板減少性紫癜

癥狀表現(xiàn)類似于腎溶血性尿毒綜合癥，但神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（頭痛、輕癱、昏迷、間歇性譫妄）及發(fā)熱程度更為顯著。并發(fā)的血小板減少癥、微血管異常溶血性貧血、腎功能異常（血尿、蛋白尿、急性腎衰）等使患者病情以極快的速度惡化，70%的病人在90 d內(nèi)死亡。

5 腸出血性大腸桿菌的致病機理

腸出血性大腸桿菌分為26、111、157血清型。其中，O157∶H7是腸出血性大腸桿菌感染疫情中的主要病原菌。經(jīng)動物實驗研究，O157∶H7能產(chǎn)生VT毒素，進入人體后主要入侵小腸遠端和結(jié)腸、腎臟、肺、脾臟和大腦，通過抑制真核細胞合成蛋白質(zhì)、聚集血小板造成對內(nèi)皮細胞的損害，造成腸黏膜水腫、出血，腸細胞壞死，嚴重者引起腎臟、脾臟和大腦的病變［14］。而大腸桿菌產(chǎn)生溶血素和黏附上皮細胞的機制，相關(guān)理論還沒有得到實驗的有力證明，故具體致病原理尚不清楚。

6 大腸桿菌檢測診斷技術(shù)

6.1 大腸桿菌傳統(tǒng)檢測方法

根據(jù)國家標準（GB4789.3-2010）規(guī)定，傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測方法主要有兩種：大腸菌群稀釋培養(yǎng)計數(shù)法（Most probable number，MPN）和大腸菌群平板計數(shù)法。在MPN檢測法中，第一步將待檢菌通入月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）管中，不產(chǎn)氣則判斷為大腸桿菌陰性，產(chǎn)氣的繼續(xù)在選擇性培養(yǎng)基進行進一步觀察。若后續(xù)培養(yǎng)中仍產(chǎn)氣則判斷為大腸桿菌陽性，否則判斷為陰性，最后查稀釋培養(yǎng)技術(shù)表計算數(shù)量。平板計數(shù)法是將制備得到的菌液，首先進行10倍梯度稀釋，然后將稀釋好的菌液接種于大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)一定時間后，查取可疑菌落數(shù)，并將可疑菌落接種在肉湯培養(yǎng)基中，報告實驗結(jié)果。

濾膜法［15］也是我國檢測食品中大腸桿菌的一種常用方法，該法主要利用濾膜對菌進行富集，通過培養(yǎng)在24 h左右觀察是否出現(xiàn)藍色或藍綠色，判定有無大腸菌群。如果存在大腸桿菌，則需進一步對其進行計數(shù)，進而得到檢測結(jié)果。由上可知，傳統(tǒng)的大腸桿菌檢測方法操作簡單，但檢測周期長（多需要一天以上的檢測時間），且對檢測溫度和檢測人員也有一定的要求。

6.2 免疫學檢測技術(shù)

隨著免疫學檢測技術(shù)的發(fā)展，針對大腸桿菌也出現(xiàn)了一系列相應的檢測方法，像經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫層析技術(shù)、量子點免疫熒光技術(shù)。其中，基于抗原抗體特異性結(jié)合反應的ELISA技術(shù)，通過偶聯(lián)高效的辣根過氧化物酶，在有大腸桿菌存在時，反應生成有顏色的產(chǎn)物，從而對大腸桿菌進行定性和定量的分析。另外在ELISA基礎(chǔ)上，將辣根過氧化物酶替代為核酸鏈，搭載成 PCR- ELISA技術(shù)，可以高靈敏、高特異性的檢測 O157∶H7及產(chǎn)生VT毒素的大腸桿菌。Galikowska等［16］還利用噬菌體代替抗體，建立了既簡單、快速又經(jīng)濟的新型ELISA技術(shù)。

免疫層析技術(shù)仍是依賴于抗原與抗體的相互作用，不同的是免疫層析技術(shù)是通過毛細管或紙層析作用使抗原或抗體與固定在微孔濾膜載體上抗體或抗原相作用，再通過信號標記物進行定性檢測。免疫層析技術(shù)快速簡便，適用于多種微生物檢測、信號穩(wěn)定易判斷，但不易于定量分析。Park等［17］應用該技術(shù)對O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌［18］、金黃色葡萄球菌等致病微生物實現(xiàn)了檢測。其中大腸桿菌 O157∶H7的檢測范圍是9.2×10-9.2×103CFU/mL。Cui等［19］利用免疫磁分離技術(shù)結(jié)合膠體金免疫層析法快速檢測大腸桿菌O157∶H7，該方法可以特異性檢測10 CFU/g濃度以上的大腸桿菌。

量子點免疫熒光技術(shù)，則是將量子點標記在抗體上，與目標菌，夾心相互作用形成熒光復合物，然后根據(jù)熒光強度測定目標菌濃度。該方法標記效率高、熒光穩(wěn)定性好且靈敏度高。Mitchell等［20］通過免疫磁珠-DNA-量子點復合物，對大腸桿菌O157：H7的Eae A基因進行了特異性檢測，由于菌濃度與熒光強度成正比而實現(xiàn)檢測，該方法最低檢測限為 4.9×10-14mol/ L。Sanvicens等［21］建立了一種基于量子點的熒光抗體陣列檢測大腸桿菌，最低檢測限可達10 CFU/ mL，這種方法比傳統(tǒng)的ELISA方法相比，可將檢測限提高3個數(shù)量級。

6.3 基于分子生物學的微生物檢測技術(shù)

聚合酶鏈反應技術(shù)（Polym erase chain reaction，PCR）是借助熱啟動DNA聚合酶的作用，通過變性-延伸-復性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增107-108倍的一種體外擴增技術(shù)，因此可以用來快速檢測或鑒定微生物的含量［22］。

傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳的方式進行檢測［23］。后期的發(fā)展過程中又發(fā)展出一系列通過熒光值對PCR產(chǎn)物進行定量的技術(shù)，實時熒光定量PCR和免疫PCR等。陳蘇紅和王升啟等［24］通過設計復合探針建立實時熒光PCR可以對10 CFU/mL大腸桿菌進行快速準確定量分析。史云等［25］建立了一種用于檢測肉及肉制品中大腸桿菌的兩重PCR檢測方法。該方法可在8-17 h之間，同時特異性檢測大腸桿菌的微絨毛粘連基因（eae）和菌毛束形成編碼基因（bfp）。朱水榮等［26］將單一PCR和多重PCR相結(jié)合，對待檢菌株的毒力基因進行檢測。這種組合方法相較于血清分型技術(shù)，可以有效確定大腸桿菌致病性。但這種方法需要進行較長的時間的樣品純化處理，且對操作人員的專業(yè)知識的要求也較高。鄭桂麗等［27］可在3-4 h之內(nèi)，通過單一PCR將特異性序列rfb高度擴增，實現(xiàn)對60 CFU/g大腸桿菌O157的高靈敏檢測。目前，隨著技術(shù)的日趨發(fā)展，出現(xiàn)了商業(yè)化的致病菌檢測PCR試劑盒，使得該技術(shù)走出專業(yè)的科研實驗室，在普通的實驗室中，也可以完成對大腸桿菌的檢測。

6.4 新型檢測技術(shù)

6.4.1 紅外光譜技術(shù) 紅外光譜技術(shù)（FTIR）能夠通過反映微生物細胞的分子振動信息特點鑒定微生物的種類及狀態(tài)，并且檢測過程快速、高效、準確。通過獲得微生物的傅里葉變換紅外光譜，解析微生物及其生物大分子結(jié)構(gòu)的信息。王建明等［28］利用傅里葉變換近紅外技術(shù)實現(xiàn)了乳制品微生物的鑒別。慈云祥等［29］利用紅外光譜技術(shù)對不同培養(yǎng)時間下的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及谷氨酸菌進行了測定，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間導致的微生物含量不同對FTIR圖譜沒有明顯影響，并且測定出大腸桿菌的特征吸收帶為1080和1238 cm-1。Siripatrawan等［30］則將近紅外光譜技術(shù)與化學統(tǒng)計學方法結(jié)合定性、定量地對大腸桿菌ATCC25922及大腸桿菌K12兩種菌株進行檢測。

6.4.2 生物傳感器技術(shù) 目前用于微生物快速檢測的生物傳感器主要有電化學傳感器、光學傳感器等。Varshney等［31］構(gòu)建了一種電阻生物傳感器，這種方法是通過細菌生長會產(chǎn)生電阻從而實現(xiàn)對具有活性的大腸桿菌 O157∶H7的檢測［32］。Chang等［33］構(gòu)造了一種微流控平臺來檢測大腸桿菌有無活性，該方法利用納米金探針監(jiān)測細胞的活性，具有生物活性的細胞得以擴增，從而實現(xiàn)檢測［34］。此外，Li等［35］構(gòu)建出了一種由二茂鐵與抗菌肽相組成的薄膜的新型電阻抗傳感器，用于檢測大腸桿菌O157∶H7，其中薄膜上的馬加寧抗菌肽為生物識別元件。

側(cè)向?qū)游鰝鞲衅鳎↙ateral flow sensor，LFS）是一種基于紙基的光學生物傳感器，通常被膠體金、乳膠、碳、磷、單鏈核酸等標記來檢測菌中核酸或者直接檢測菌。該技術(shù)簡單、準確、快速、廉價，不需要復雜的儀器設備。目前，LFS被廣泛應用于病原菌的快速檢測，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等都可以用這種試紙條進行快速檢測。

由上可以看出生物傳感器具有敏感性、專一性，可以進行實時測定，具有時效性，可用于測定核酸、酶、抗體、噬菌體甚至整個細胞。

6.4.3 基于適配體的分析技術(shù) 適配體是通過指數(shù)富集配體進化技術(shù)從體外篩選得到的一類單鏈寡核苷酸，適配體因其單鏈結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的多樣性特異性與靶分子結(jié)合，且具有高親和性和特異性。人們利用基于細胞層面的 SELEX技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種僅結(jié)合于 E. coli O157∶H7血清型菌株細胞表面的一種RNA適配體，可用于大腸桿菌O157∶H7菌株的特異性鑒別。吳文鶴等［36］通過適配體序列進行編輯及酰胺化反應，將適配體功能化修飾到PDA納米囊泡的表面，構(gòu)建一種可以比色適配體生物傳感器，由于快速檢測腸致病性大腸埃希菌。該傳感器識別元件是適配體，靶標是脂多糖，二者特異性合可引起PDA納米囊泡的顏色變化和比色響應值（CR）變化，從而實現(xiàn)檢測溶液中的腸致病性大腸埃希菌的定性或定量分析。該生物傳感器只需30 min，便可檢出105CFU/mL的大腸埃希菌，方法的線性檢測范圍為105-108CFU/mL。

6.4.4 ATP生物發(fā)光檢測技術(shù) ATP生物發(fā)光技術(shù)是一種新型的微生物快速檢測方法。由于ATP是活細胞中普遍存在的一種能量代謝物，在生物體內(nèi)含量是相對穩(wěn)定的，因此可以通過檢測的ATP含量來確定微生物的量。ATP含量的檢測一般是通過熒光光度計法進行測定，測定原理是在有氧的條件下，利用蟲熒光素酶催化ATP形成氧化熒光素發(fā)出熒光，由于熒光是與ATP的量成正比例關(guān)系，因此可以定量分析ATP的量。在一個生物細胞中，其ATP的數(shù)量越多，發(fā)出的熒光就越多，因此，可以通過熒光信號強度判定樣品被微生物的污染程度。

6.4.5 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是指將設計好的核酸探針或者寡核苷酸片段按照特定的順序修飾在芯片上，預先標記熒光的核酸探針通過PCR擴增標記到微生物樣品的DNA上，然后將PCR擴增產(chǎn)物和芯片上的核酸探針點雜交，洗滌后，放到熒光掃描儀檢測陣列點上的熒光分布，最后通過軟件分析熒光強度將待檢樣品的含量分析出來。運用基因芯片技術(shù)對食品中的大腸桿菌進行檢測，其靈敏度可達2 pg。

7 食源性致病菌安全事故的溯源方法

食品溯源是指從食品生產(chǎn)、加工、配送、銷售到食用的全過程中，實現(xiàn)生產(chǎn)源頭和消費終端的雙向追蹤，有效監(jiān)控食品的經(jīng)營產(chǎn)業(yè)鏈。

目前的食品溯源技術(shù)主要分為物理方法溯源、化學方法溯源和生物方法溯源。其中，物理方法包括近紅外光譜溯源、物聯(lián)網(wǎng)及標簽溯源等；化學方法包括同位素溯源、礦物元素溯源和有機成分溯源等；生物方法包括DNA溯源和虹膜特征技術(shù)等［37］。

在食源性疾病爆發(fā)案例中，溯源調(diào)查具體指對可能導致該食源性疾病的食物載體進行反向追蹤，確定其分布，沿著生產(chǎn)鏈追溯到其來源。下面以2011年5-7月德國腸出血性大腸桿菌暴發(fā)疫情為例，介紹在該安全事故中運用的溯源調(diào)查方法。

7.1 針對性擬定溯源調(diào)查策略

為查明德國暴發(fā)疫情和法國聚集病例暴露來源，歐洲食品安全局（European food safety authority，EFSA）開發(fā)了相應的數(shù)據(jù)收集和處理系統(tǒng)，以回溯和追蹤調(diào)查可疑的同源暴露芽苗。收集消費終端信息，了解并記錄處理方式和預期用途；反向追溯供銷鏈，沿商家→企業(yè)→供應商環(huán)節(jié)確定其名稱、產(chǎn)品識別號、產(chǎn)品數(shù)量及上一步來源。在溯源的過程中，快速鎖定與疫情相關(guān)的供應鏈，核實可疑芽苗運輸路徑上與時間表的一致性，以便獲得可靠性較高的原因分析和溯源推測。EFSA工作小組在德國和歐盟各國按照統(tǒng)一的方法開展溯源調(diào)查，如圖1所示。

7.2 疫情涉及國的平行溯源調(diào)查

7.2.1 德國展開的溯源調(diào)查 根據(jù)初步的流行性病學分析發(fā)現(xiàn)，德國下薩克森的一家芽苗生產(chǎn)公司A與國內(nèi)41起聚集病例相關(guān)，最有可能是污染了EHEC O104∶H4芽苗菜的來源。經(jīng)過EHEC小組對該公司的水樣、員工和種子的深入調(diào)查，并未發(fā)現(xiàn)員工與食物污染的直接聯(lián)系，對水樣和種子的實驗室檢驗也成陰性。隨后，EHEC小組從A公司出發(fā)，回溯芽苗菜種子在此次疫情爆發(fā)時段內(nèi)的全部來源和去向，具體到生產(chǎn)鏈、運輸鏈的每一環(huán)節(jié)。縱向收集產(chǎn)品信息、特征性數(shù)據(jù)（如名稱、批號、收發(fā)日期等），橫向比較原料接收與產(chǎn)出的總量，并調(diào)查缺失部分。最終將EHEC O104∶H4的可疑來源范圍縮小至A公司提供的5種芽苗種子：苜蓿、葫蘆巴豆、2 種扁豆、赤豆及蘿卜。由于僅有葫蘆巴豆種子為德國和法國聚集病例中共同的可疑食物，故將檢測目標鎖定為A公司售出的葫蘆巴豆種子。通過獲得該葫蘆巴豆種子的銷售批號，確認有75 kg屬于2009年11月24日德國一進口商從埃及一種子出口商購進的同批種子（批號48088）。2009年至2011年，A公司又接受了從埃及同一出口商購進的批號為8266的75 kg種子。

圖1 德國EHEC感染暴發(fā)疫情溯源與追蹤調(diào)查圖

7.2.2 法國展開的溯源調(diào)查 對法國聚集病例的調(diào)查確定了3種可能與疫情有關(guān)的豆芽種子，作為和德國進行的調(diào)查共同的可疑食源，葫蘆巴豆芽成為主要的調(diào)查對象。歐盟食品和飼料快速預警系統(tǒng)（Rapid alert system for food and feed，RASFF）通告報告，于集體活動時主辦方自行發(fā)制的種子，其英國供應商在2010年1月13日從一家德國進口商進口并運送至法國，同樣來源于48 088批次。

7.2.3 成員國和其他國家開展的溯源調(diào)查 2011年，約有3 000 t的葫蘆巴豆種子從不同國家進入歐盟。因此，除德國、法國以外，包括奧地利等8個國家在內(nèi)的專家，在 EFSA的協(xié)調(diào)和 ECDC、WHO、聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and agriculture organization，F(xiàn)AO）的協(xié)助下開展溯源調(diào)查。各國根據(jù)RASFF系統(tǒng)提供的初始信息，查詢配送鏈上的供應商和產(chǎn)品、公司和客戶，對包裝方式也進行了詳實的調(diào)查。相互核實和補充之后，將材料通過RASFF遞交給EFSA工作小組。

7.3 同源追蹤調(diào)查

由于在德國、法國和歐盟其他國家的調(diào)查結(jié)果共同顯示從埃及進口的批號48088的種子極有可能是本次疫情傳播的來源，故對其進行追蹤。發(fā)現(xiàn)，德國共有1家大型的獨立經(jīng)銷商、9家公司是該批次產(chǎn)品的配送終點，另外，英國、西班牙和奧地利各有1家公司也是該批種子的配送點，共計15 075 kg。德國聯(lián)邦消費者保護和食品安全辦公室（The Federal Office for Consumer Protection and Food Safety，BVL）對所有可疑批次種子的調(diào)查顯示，48088批次葫蘆巴豆種子售出至70家不同的公司，其中德國有54家，16家分布在其他11個歐洲國家。

7.4 芽苗種子的實驗室檢測

開展溯源調(diào)查期間，配合進行可疑批次芽苗種子的微生物學分析。由于食品分析的樣本量較大，耗時耗力的逐一檢測與迅速排查以控制病情的要求產(chǎn)生矛盾，且檢測結(jié)果在短時間內(nèi)會受到采樣方法和檢測手段的影響，故本次疫情爆發(fā)的實驗室檢測受到限制［38］。

在2011年德國腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情中，從聚集病例的分析到供銷鏈的回溯，盡管缺乏可靠的實驗室檢測信息，但仍然成功將感染源追溯至由埃及進口的葫蘆巴豆種子。

對于食源性生物菌中毒，最有效的溯源方法通常是化學溯源，對可疑致毒物進行微生物學分析，有利于確定菌種血清類型，為污染的控制與疫情的治療提供依據(jù)。德國腸出血性大腸桿菌感染事故爆發(fā)突然，前期缺乏對病原菌的實驗室檢測信息，中后期也難以做到證據(jù)完備。在保證及時、快速的前提下，樣品采集數(shù)量難以做到大量、完整，但其各部門協(xié)調(diào)合作，有序高效地展開工作的解決方法還是值得相關(guān)科學管理部門借鑒和學習。

8 食源性致病菌與中西方膳食結(jié)構(gòu)的關(guān)系

食源性致病菌引發(fā)的安全事故在人類的工業(yè)化歷史上是一個遺留問題。中西方工業(yè)化進程的差異和飲食習慣的不同使得雙方受到食源性致病菌侵害的程度不同，主要體現(xiàn)在對致病菌的殺滅效果上。

西方發(fā)達國家的膳食結(jié)構(gòu)多為“三高”型，即高脂肪、高蛋白、高熱量。頗高的蛋白質(zhì)和脂肪攝入使得西方人的腸道菌群易失調(diào)，增加腸道通透性，造成全身慢性、低水平炎癥，對胰島素的信號傳導也有一定程度的破壞，使患糖尿病、肥胖癥等代謝綜合征的幾率升高。西方人食用的食品多為加工、合成類食品，科學的膳食結(jié)構(gòu)和安全的加工制造條件均有待完善。

中國傳統(tǒng)飲食特點為低脂肪、低蛋白、高碳水化合物，輔以蔬菜、水果；烹飪方法有蒸、煮、燉、熬等［39］。雖然近10年來中國的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，但長期保留的飲食習慣和多樣的烹調(diào)方法與西方常見的生食、半生食習慣有明顯的不同，對有害微生物的殺滅作用更加有效。我國也密切監(jiān)控常食用食物中的致病菌。目前，我國6種質(zhì)控考核菌株包括大腸埃希菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、坂崎腸桿菌、以及蠟樣芽胞桿菌［40］。從結(jié)果上來看，中國的食源性致病菌安全事故發(fā)生幾率低于西方［41］。

9 食源性致病菌安全事故的防控措施

9.1 防止食源性致病菌污染

如前文所述，在食品的生產(chǎn)、加工、運輸?shù)裙╀N鏈上，每一個環(huán)節(jié)都有可能被致病菌污染，雖很難做到完全杜絕，但是積極措施的實施也十分必要。例如，應重點關(guān)注肉類、蛋類、奶類和海產(chǎn)品等已成為致病菌寄生體的食品，加強各個環(huán)節(jié)的衛(wèi)生管理。另外，家畜的糞便也應嚴格按照規(guī)定處理，防止水體、草場等被污染。

9.2 控制食源性致病菌繁殖

殺滅食源性致病菌的有效方法之一是破壞最適溫度。大多數(shù)情況下，溫度在5-46℃時，適于食源性致病菌的生長和繁殖，詳見表1。

表1 主要食源性致病菌生長溫度范圍

對于大多數(shù)常見的食源性致病菌，對食品進行冷藏能有效控制其中的微生物生長繁殖，廣泛適用于市場上許多食品的保鮮和貯存，可行性較高。但是，個別特例如單增李斯特菌，低溫下仍可以繁殖，需采取其他特殊的預防和監(jiān)測手段。

9.3 健全法律法規(guī)，優(yōu)化檢測系統(tǒng)

設置食品安全應急管理制度，進一步加強食品安全質(zhì)量，實施有效的食品質(zhì)量安全監(jiān)督措施，監(jiān)管部門應該加大監(jiān)督的執(zhí)行力和處罰力度，嚴格要求經(jīng)銷商遵守《食品衛(wèi)生法》進行規(guī)范的加工制造。同時，強化對工廠員工食品安全和衛(wèi)生知識的培訓，定期組織體檢，對預防食源性致病菌污染多管齊下。

9.4 養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習慣

在消費者中普及食品安全健康教育，增強其主觀能動性和社會責任感。減少生食、生飲，對于常暴露在空氣中的儀器和皮膚應該常用肥皂或酒精清洗；在家庭飲食環(huán)境里，改良不健康的烹飪、儲存方式，矯正不良的飲食習慣，多對食品流通大的場所如冰箱等消毒，將生食和原料煮透以達到最大程度殺滅食源性致病菌的效果。

9.5 避免交叉污染，防治疾病擴散

發(fā)現(xiàn)被污染的食品、確定污染源之后，應該根據(jù)其被污染的實際情況盡快采取最有效的處理措施——或覆蓋式消毒或直接銷毀，防止污染范圍擴大、污染程度加劇。對于食源性致病菌中毒的患者，應及時診斷并治療，控制疾病的進一步傳播［42］。

10 政府應對措施

10.1 加強國內(nèi)外各機構(gòu)組織協(xié)作

2011年德國腸出血性大腸桿菌疫情爆發(fā)持續(xù)時間長、波及范圍廣、調(diào)查部門涉及醫(yī)療機構(gòu)、各級衛(wèi)生部門、各級實驗室、聯(lián)邦食品安全部門等。德國政府第一時間聚集各方資源，同時與歐盟各國和美國疾病預防控制中心等機構(gòu)協(xié)同收集病例。多方積極合作促成了本次調(diào)查的有序進行。

10.2 信息公開透明

德國政府在解決此次疫情爆發(fā)情況的過程中，及時在網(wǎng)站更新疫情信息，發(fā)布公告，引導公眾采取健康保護措施和預防措施。另一方面，和歐盟與WHO信息互換，使得WHO能快速評估公告衛(wèi)生風險，告知疫情范圍之外的群體，對當時的人口、貿(mào)易出入境進行指導和限制，最大程度地平息公眾的恐慌，將由此帶來的損失降到最低。

10.3 實施疫情監(jiān)測

德國從2001年起實施防止感染保護法案，詳細規(guī)定了從實驗室、醫(yī)療部門到地方及州衛(wèi)生部門，再到RKI的各級信息流動傳遞過程中的時間限制，這一法案監(jiān)督著相關(guān)負責人的工作效率在24 h之內(nèi)，衛(wèi)生部門必須要收到當?shù)貙嶒炇液歪t(yī)療部門的病例報告。地方衛(wèi)生部門須使用電子化設備記錄接收并核實的病例信息，在第二周的第三個工作日前將符合 RKI規(guī)定的監(jiān)測病例標準的人員信息通過匿名方式報送到州衛(wèi)生部門，經(jīng)州衛(wèi)生部門對信息再次核實無誤之后，在接下來的一周內(nèi)報送到RKI。

10.4 加強癥狀監(jiān)測工作

在疫情爆發(fā)初期，需要數(shù)天甚至長達16 d才能將信息從基層部門上報到國家級機構(gòu)，嚴重降低了政府評估疫情的高效性。因此，德國政府采用信息集中交換，加快了報送速度。同時，德國對腸出血性大腸桿菌O104∶H4感染腸炎有明確的定義和癥狀標準，加強了對重癥病例的有效監(jiān)測［43］。

11 食源性致病菌安全事故法案例教學法

科普教育中對青年學生的教育不可忽視，食品安全相關(guān)課程也已深入高校。食源性致病菌安全事故不時爆發(fā)，說明公眾對其了解不足、預防意識及措施不夠，因此在全民尤其是大學中開展科普實踐的案例教學是必要的。下面以2011年德國腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情為例，探討案例教學方法在教學中的作用，希望通過全國教學案例的推廣，讓更多的學生認識到食源性致病菌是可識、可防、可控、可治、可預警的一類廣泛存在的食品安全公共事件，既不能談之色變，又要引起全社會的足夠重視。本節(jié)內(nèi)容以德國大腸桿菌事件為例就如何將食品安全案例編撰成教學案例進行舉例展示。

11.1 案例教學課程目標

案例教學準備時，首先要明確課程目標，以德國大腸桿菌事件為例，進行案例教學時的課程的核心目標應是通過介紹德國大腸桿菌事件的發(fā)生、發(fā)展及調(diào)查、處理情況對德國大腸桿菌事件進行重現(xiàn)，幫助學生掌握食源性致病菌的危害，及造成食源性致病菌安全事故的關(guān)鍵點，讓學生對食源性疫情爆發(fā)的原因及控制措施有基本認識了解，從而起到情景再現(xiàn)式的科普實踐作用。

11.2 案例課前準備

案例教學的特點是發(fā)揮學生的主觀能動性，讓授課方式不再是教師一言堂式的填鴨講授。且案例教學，多是對案例的情景再現(xiàn)，提供背景及內(nèi)容有限，因此，需要在案例教學實施前，讓學生提前閱讀并了解本案例的相關(guān)背景知識，通過期刊文獻、新聞通告，多方面查閱，對案例進行較全面的的了解，積極做好課前準備。本階段教師應做好學生的引導工作，以德國大腸桿菌為例，引導學生做以下工作。資料查閱：查閱新聞報道、疾病預防控制中心、食品藥品監(jiān)督管理局的報告、新聞通告等，了解大腸桿菌污染食品安全事件在全球的發(fā)生情況。關(guān)于蔬菜特別是有機蔬菜的相關(guān)法律法規(guī)文件，查閱。查閱德國腸出血大腸桿菌的其他報道，對案例進行更全面的了解。另外教師還需要精心以案例為基礎(chǔ)，準備5-8個問題清單，為學生做更進一步的知識準備引導。問題建議包括開放式的、爭議式的及知識點式的，盡量種類豐富。

11.3 案例分析要點

案例教學過程中，幫助學生明確案例分析要點是案例教學的重要作用。首先，需要學生識別的關(guān)鍵問題，如德國大腸桿菌事件中關(guān)鍵問題是如何緊急排查確定大腸桿菌疫源，如何找到疫情關(guān)鍵形成點控制疫情。其次，需要幫助學生明確案例調(diào)查過程中采用的方法分析，體現(xiàn)了哪些科學思想，哪些方法存在一定的局限性，如果重新調(diào)查，應采用哪些方法，如何進行調(diào)查研究。

11.4 案例課堂討論

案例教學中學生的自主學習性，主要體現(xiàn)充分的課堂討論上。這可以使得學生在已查閱資料的基礎(chǔ)上深入思考，建議以小組討論方式為主，可采用PPT展示或者角色扮演的方式，對事件進行分析或者情景模擬，組長最后總結(jié)發(fā)言；各小組確定匯報內(nèi)容后，在工作匯報結(jié)束后會接受其他組5-10 min質(zhì)詢，并予以解答，允許以辯論的方式回答。

11.5 案例課后拓展

案例教學是集中式的知識點學習，更多的是一種能力及觀念的學習。一個案例包括的知識點很多，為了全面了解一個案例及對課堂授課知識點強化理解，課后拓展閱讀十分重要。案例教學結(jié)束后應布置學生課后繼續(xù)了解其他食源性致病菌安全事故案例，與本案例進行異同比較，通過對同類案例的橫向?qū)Ρ龋箤W生自主優(yōu)化處理食源性致病菌安全事故的手段和方法，在歷史案例的基礎(chǔ)上有所借鑒和創(chuàng)新。