金巧 甘志凱 周鵬 劉霞

（南昌理工學院，南昌 330000）

Notch信號通路最初由Morgan和Bridges于1919年通過遺傳研究發(fā)現(xiàn)，其主要調(diào)控細胞的凋亡、增殖和分化等重要生命過程［1］。在哺乳動物中，Notch 信號通路有4個受體（Notch1、Notch2、Notch3和 Notch4） 和 5個 配 體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2），其中2個配體Jagged1和DLL4在血管生成過程中起到重要作用，特別是DLL4，其主要在內(nèi)皮細胞表達，從根本上調(diào)控腫瘤血管發(fā)生和生長［2-3］。

人源DLL4蛋白是I型單次跨膜蛋白，由658個氨基酸組成，其胞外區(qū)有與Notch 受體結(jié)合及活化的表皮生成因子（Epidermal growth factor，EGF）樣的8個重復序列，1個高度保守的Delta/Serrate/LAG-2（DSL）區(qū)域和4個糖基化位點，分子量為57 kD，而胞內(nèi)區(qū)在DLL4與Notch結(jié)合之后，會被剪切加工成活性位點，激活下游分子，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄［4］。正常情況下，DLL4表達于脈管系統(tǒng)，如發(fā)育中的胚胎、成年組織血管新生過程中的動脈、小動脈及毛細血管的內(nèi)皮細胞上，而靜脈內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和處于靜止的血管不表達DLL4，病理情況下，可見實體瘤組織中DLL4表達量上調(diào)［5-7］。目前，在臨床上，DLL4是一種新型腫瘤分子標記物，具有高敏性，可用于腫瘤預后診斷。此外，由于舊靶點抗體療法耐藥性的出現(xiàn)，通過阻斷DLL4和Notch受體的結(jié)合抑制腫瘤血管的生成，從而達到抗腫瘤治療效果，已成為一種新的癌癥治療策略。

本研究旨在通過HEK 293F細胞對人源DLL4胞外區(qū)蛋白進行瞬時表達，利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作儀檢測DLL4的活性，同時制備兔子多克隆抗體，為下一步研究DLL4蛋白功能、開發(fā)臨床腫瘤篩查試劑盒以及免疫治療奠定基礎。

圖1 Notch信號通路配體和受體［2］

1 材料與方法

1.1 材料

人源DLL4 cDNA購自于北京義翹神州有限公司，tPA cDNA為本實驗室保存，感受態(tài)DH5α購自于北京全式金生物技術有限公司。DL15 000 DNA Marker、T4 DNA ligase、生物素化試劑購自于Thermo公司；切膠回收試劑盒購自于Axygen公司；無霉毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自于Omega公司；opti-MEM、LipofectamineTM2000購自于Invitrogen 公司；兔抗人DLL4 抗體購自于Abcam 公司；PVDF 膜購自于Pall公司；ECL發(fā)光試劑購自于Millpore公司；SDS-PAGE上樣緩沖液、鼠抗His標簽一抗、HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG購自于康為世紀生物技術有限公司；Bradford蛋白檢測試劑盒購自碧云天公司；新生牛血清購自于四季青公司；Histrap層析填料、Equilibration Buffer、Elution Buffer購自于GE公司；鏈霉親和素傳感器購自于Fortebio公司；基因合成和測序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HEK293F細胞培養(yǎng)于10 %新生牛血清的opti-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃、5%CO2，每3 d傳1次代。

1.2.2 質(zhì)粒構建 以人源DLL4 cDNA為模板，PCR擴增DLL4-6His基因，上游引物P1：GTG GAG CAG TCT TCG TTT CGA ACA GCT CCG GCG TCT TCC AGC TGC AGC TG，下游引物P2：GAT CGG ATC CCC TAT CAA TGA TGG TGG TGA TGG TGC GGC AAG CCC ACG GGG AAC TC。以tPA cDNA為模板，擴增tPA信號肽序列，上游引物P3：CCG AGG AAT TCG CCA CCA TGG ATG CAA TGA AGA GAG GGC TC，下游引物P4：CTG CAG CTG CAG CTG GAA GAC GCC GGA GCT GTT CGA AAC GAA GAC TGC TC。以前兩步得到的DLL4-6His和tPA為模板，進行搭橋PCR，構建tPA-DLL4-6His基因片段，引物為P2和P3。PCR 反應條件 ：95℃ 5 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s、68℃ 21 s，30 個循環(huán) ；68℃ 5 min。

用高保真EcoR I和BamH I分別對tPA-DLL4-6His基因和表達載體pGZX進行雙酶切，切膠回收后，T4 DNA ligase，16℃過夜連接。然后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，涂布到含有氨芐青霉素的平板上，培養(yǎng)過夜，次日挑取陽性克隆子并擴大培養(yǎng)，進行酶切鑒定和測序驗證。

1.2.3 蛋白表達與純化 轉(zhuǎn)染前1 d，將HEK293F以2×105個/mL的密度鋪于6孔板內(nèi)，使轉(zhuǎn)染時細胞融合率約為80 %，按照lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染，以無轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染空載體的作為空白對照，轉(zhuǎn)染48 h后進行SDS-PAGE檢測。

在層析柱中添加Ni-NTA填料，確保填料無分層無氣泡產(chǎn)生，然后用5倍體積的Equilibration Buffer平衡柱子，取1倍體積的蛋白粗樣（經(jīng)10 000×g高速離心預處理）低速上柱，30 min后，加入3倍體積Equilibration Buffer清洗柱子，除去未結(jié)合或結(jié)合不牢的蛋白，然后用Elution Buffer進行洗脫，收集洗脫液，SDS-PAGE分析。采用Bradford法進行蛋白定量。

1.2.4 Dot blotting和Western blotting 取適量蛋白粗樣，直接滴加在PVDF膜上，待自然干后，用含5%脫脂奶粉的TBST進行2 h封閉，加入鼠抗His標簽一抗，4℃封閉過夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入羊抗鼠帶HRP的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，進行ECL發(fā)光檢測。

取適量蛋白粗樣，加入SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴煮沸5 min后，經(jīng)SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉的TBST進行2 h封閉，加入兔抗人DLL4一抗，4℃封閉過夜，用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入羊抗兔帶HRP的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，進行ECL發(fā)光檢測。1.2.5 親和力檢測 將純化后的DLL4-6His進行生物素化標記，生物素和DLL4-6His的摩爾比為3∶1，室溫孵育30 min后，進行過夜透析。

親和力測定采用鏈霉親和素傳感器（SA Sensor），生物素化的DLL4-6His起始濃度為25 nmol/L，2倍稀釋，5個濃度梯度。結(jié)合時間600 s，解離時間900 s，通過對照傳感器扣除本底信號后，采用1∶1結(jié)合模型去擬合結(jié)合和解離曲線，得到親和力常數(shù)。

1.2.6 多克隆抗體制備 選擇月齡3個月體重1.5 kg的大耳白兔，飼養(yǎng)于標準動物房內(nèi)，連續(xù)觀察3 d，確定情況正常后進行免疫。0.5 mg/只免疫DLL4蛋白，免疫采用弗氏完全佐劑，免疫第1次后，每隔一周進行加強免疫，一共免疫4次，取血，將血清于4℃冰箱過夜析出，離心后取上清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 抗體效價及特異性檢測 采用ELISA法檢測抗血清效價，步驟如下 ：將 50 μL 0.05 μg/μL DLL4蛋白，加入到96孔板中，37℃孵育1 h，TBST洗滌后，加入200 μL 5%的脫脂奶粉的TBST，封閉2 h，然后每孔加入100 μL一抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌后，加入二抗，37℃孵育45 min，洗滌后，加入顯影液100 μL，37℃避光孵育10 min，加入終止液，最后讀取OD450。

為了進行抗體特異性檢測，將DLL4瞬時表達的發(fā)酵上清進行純化，收集樣品后，進行SDSPAGE電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，加入不同稀釋度的抗血清，以陰性抗血清作為對照，洗滌后，加入二抗進行孵育，最后ECL發(fā)光檢測。

2 結(jié)果

2.1 DLL4基因的PCR擴增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在1.6 kb附近處有1條特異性DNA條帶，其長度與tpADLL4-6His基因片段長度吻合（圖2）。

圖2 DLL4基因的核酸電泳圖

2.2 表達質(zhì)粒pGZX-DLL4-6His鑒定

pGZX-DLL4-6His經(jīng)高保真（減少星號活性）EcoR I和BamH I雙酶切后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖顯示出兩條DNA條帶，大小分別為4.6 kb和1.6 kb（圖3），符合pGZX載體和DLL4基因片段的長度。將測序結(jié)果進行Blast比對，與NCBI中的DLL4序列（NM_019074.3）相同，無堿基突變。

圖3 pGZX-DLL4-6His雙酶切驗證

2.3 DLL4蛋白表達與純化

LipofectamineTM2000介導pGZX-DLL4-6His轉(zhuǎn)染48 h后，離心后收集上清，SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明，被檢測的樣品在50-70 kD之間有一條較深的條帶。隨后進行鎳柱親和純化，收集流穿、清洗和洗脫組分，并進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4所示，在57 kD處得到一條粗條帶，大小符合DLL4-6His的分子量，且純度達到95%。

2.4 Dot blotting和Western blotting檢測

Dot blotting檢測結(jié)果（圖5-A）顯示，發(fā)酵上清液中含有帶6His標簽的蛋白，隨后進行Western blotting檢測，進一步確定是否為DLL4-6His蛋白。結(jié)果如圖5-B所示，在57 kD處出現(xiàn)一條特異性的條帶，以上結(jié)果說明通過瞬轉(zhuǎn)，可以在293F細胞發(fā)酵上清液中獲得具有免疫原性的DLL4蛋白。

圖4 DLL4-6His蛋白的純化

圖5 DLL4-6His蛋白Dot blotting和Western blotting檢測

2.5 親和力檢測

采用Fortebio公司出產(chǎn)的Octet Red96分子互作儀來檢測DLL4是否可以用于抗體的親和力檢測。結(jié)果如圖6所示，擬合曲線和實際曲線吻合較好，曲線之間分布均勻，KD值為1.848E-10，R2= 0.999，符合商業(yè)化抗體親和力大小，結(jié)果可信。

圖6 DLL4蛋白親和力檢測

2.6 DLL4抗血清效價及特異性檢測

兔子經(jīng)過3次免疫后，獲得DLL4蛋白抗血清，經(jīng)ELISA法檢測（圖7-A），其效價可達到1∶12 800。Western blotting結(jié)果（圖7-B）顯示不同稀釋度的DLL4抗血清出現(xiàn)明顯條帶，而陰性對照無對應的條帶。

圖7 DLL4多克隆抗體效價及特異性檢測

3 討論

臨床數(shù)據(jù)表明，DLL4蛋白與多種實體瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有相關性。在乳腺癌上，DLL4在青年型乳腺癌組織中陽性表達率為73.33%，顯著高于中老年型乳腺癌組織的陽性表達率（P＜ 0.05），且DLL4高表達使青年型乳腺癌相對于中老年型乳腺癌更具有侵襲性［9-11］。在肺鱗癌上，DLL4與腫瘤大小呈正相關（r=0.475，P＜ 0.05），且在肺鱗癌間質(zhì)中高表達，提示DLL4可能促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［12］，在非小細胞肺癌上，DLL4表達與非小細胞肺癌組織的分化程度和TNM分期存在統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05）［13］。在大腸癌上，DLL4在大腸癌組織中陽性檢測率為75%，與癌旁組織的檢測率（23.81%）存在顯著差異（P＜ 0.001），且與大腸癌的浸潤程度、遠端轉(zhuǎn)移及TNM分期有關［14-15］。此外，DLL4還與膀胱尿路上皮癌、胰腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤相關。因此，DLL4作為分子標記物，可用于多種實體瘤的診斷及預后診斷。

近年來，DLL4在臨床腫瘤篩查及靶向治療方面的應用價值逐漸被重視，尤其是在抗血管生成療法如抗VEGF-A和抗VEGF-2R受體治療耐藥出現(xiàn)后，DLL4逐漸成為了腫瘤靶向治療的新靶點［16］。目前，國外要比國內(nèi)較早注意到DLL4的價值，市場上，DLL4相關進口試劑盒占據(jù)主要市場，且有研究表明，DLL4雙特異性單克隆抗體和納米抗體都已制備出［17-18］。另外，DLL4在研藥物有OncoMed公司的Demcizumab，一種雙特異性單克隆抗體，現(xiàn)已通過安全評估階段；Regeneron公司的Enoticumab，一種人源化的單克隆抗體，作為免疫調(diào)節(jié)劑，現(xiàn)已進入臨床I期。而國內(nèi)，無論是在科研界還是在工業(yè)界都進展相對緩慢，抗DLL4靶向治療仍處于臨床前研究，浙江海正藥業(yè)、百濟神州正在加緊研究，旨在加速將這一早期研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應用，為我國癌癥患者提供一種新的治療希望和途徑。

本研究將目的基因DLL4胞外區(qū)克隆到真核表達載體pGZX中，并轉(zhuǎn)染到HEK 293F細胞中進行真核表達。tpA信號肽具備分泌信號肽的典型特征，同時含有一個KOZARK增強子，可有效促進異種蛋白分泌，是目前應用最廣泛的外源性信號肽之一［19］。前期實驗中，對比過lgK信號肽和tpA信號肽，結(jié)果表明，tpA信號肽更加有助于DLL4蛋白的分泌表達。HEK 293F細胞是人源化細胞，可以對目的蛋白進行糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，有助于獲得天然構象的蛋白，保持蛋白的生物活性。而帶有6His標簽，有利于快速的親和純化，簡化了純化流程。Dot blotting、Western blotting和大分子互作儀檢測結(jié)果表明，真核表達出的DLL4-6His蛋白具有免疫原性，且6His標簽并不影響DLL4的蛋白活性。葉建斌等［20］通過pCMV-Tag4構建了DLL4真核表達載體，轉(zhuǎn)染到293T細胞中成功地表達出DLL4。與其不同的是，本研究采用HEK 293F細胞為懸浮培養(yǎng)細胞，便于后期進行中大規(guī)模的生產(chǎn)，同時帶有6His標簽，經(jīng)一步純化，可以得到純度為95%的DLL4蛋白，另外，首次利用大分子互作儀進行DLL4生物活性檢測，得出具體的數(shù)值，使得結(jié)論更加可信。通過免疫兔子，成功制備出DLL4多克隆抗體，通過ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其效價可達到1∶12 800倍，Western blotting表明，其具有良好的特異性。

4 結(jié)論

克隆得到人源DLL4胞外區(qū)，構建真核表達載體，獲得重組質(zhì)粒pGZX-DLL4-6His，并成功在HEK 293F細胞中分泌表達，基于親和純化得到的DLL4蛋白免疫兔子，制備了多克隆抗體，Western blotting顯示該抗體具有較好的特異性。