江愛(ài)明 蔡高磊 曹俊 周向宇 柯尊偉

摘 要： 為了探索人工栽培白及的適宜條件，該研究以湖北省十堰市野生白及為對(duì)象，采用同源克隆和3′RACE技術(shù)，從白及（Bletilla striata ）中獲得與熱激蛋白合成有關(guān)的BsHsp17.3基因，并分析BsHsp17.3基因?qū)Σ煌{迫的響應(yīng)。結(jié)果表明：BsHsp17.3基因開放閱讀框長(zhǎng)度為453 bp，編碼150個(gè)氨基酸；蛋白的分子量為17.42 kD，等電點(diǎn)為6.33。進(jìn)化樹分析表明BsHSP17.3蛋白與同為蘭科的鐵皮石斛進(jìn)化關(guān)系較近，同在一分支上。半定量RT-PCR分析顯示BsHsp17.3基因在白及根、葉、鱗莖及花組織中的表達(dá)具有特異性，且BsHsp17.3基因在葉中的表達(dá)量較高，在鱗莖及花中不表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示BsHsp17.3對(duì)非生物脅迫高溫、低溫具有明顯應(yīng)答反應(yīng)，20%PEG模擬干旱脅迫不誘導(dǎo)該基因表達(dá)，推測(cè)該基因在白及防止倒苗過(guò)程中可能發(fā)揮一定作用。

關(guān)鍵詞： 白及， BsHsp17.3， 克隆， 熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1191-08

Abstract： BsHsp17.3 gene was isolated from Bletilla striata using homologous cloning and 3′RACE methods. In this study， the expression profiles of BsHsp17.3 under different stresses were analyzed and suitable conditions were explored for artificial cultivation of B. striata. The results were as follows： The opening reading frame of BsHsp17.3 was 453 bp， which encoded a 150-amino acid peptide. Its protein molecular weight and isoelectric point were 17.42 kD and 6.33. Phylogenetic analysis demonstrated that BsHsp17.3 was closed to the Hsp17.3 from Dendrobium catenatum. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression of BsHsp17.3 was different in leaf， root， bulb and flower of B. striata. The expression level of BsHsp17.3 gene was the highest in leaf and root，respectively， but was absent from the bulb and flower. The expression of BsHsp17.3 was analyzed by quantity RT-PCR under cold， hot and drought treatments. The results showed that the expression of BsHsp17.3 quickly induced by high temperature and cold， but drought stress simulated by 20% PEG did not regulate the gene expression. These results suggest that BsHsp17.3 may be involved in regulating sprout tumble of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata， BsHsp17.3， clone， quantity RT-PCR

白及（Bletilla striata），為多年生草本球根植物，植株高18～60 cm，葉呈狹長(zhǎng)圓形或披針形，花大色艷，種子極細(xì)小，似粉末，沒(méi)有胚乳。假鱗莖扁球形，肥厚肉質(zhì)，數(shù)個(gè)相接可入藥，有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效，具有較高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值。白及耐陰懼曬，常生長(zhǎng)于較濕潤(rùn)的石壁、苔蘚層中，與灌木相結(jié)合。每年6—9月、12月至次年1月，溫度較高和較低，白及地上部分植株枯萎、倒伏，進(jìn)行倒苗，這是白及抵御高溫和低溫一種適應(yīng)性表現(xiàn)。但是，倒苗縮短了白及的生長(zhǎng)期，嚴(yán)重影響了白及的產(chǎn)量， 因此防倒苗是一項(xiàng)非常重要的增產(chǎn)措施（黎君等，2016）。

在高溫脅迫下，植物細(xì)胞中的各種酶因變性喪失功能。為了消除高溫脅迫所造成的傷害，植物細(xì)胞內(nèi)具有對(duì)損傷蛋白進(jìn)行修復(fù)和清除的機(jī)制（Bouchard，1990；Guo et al，2015）。其中，熱激蛋白（heat shock protein，HSP）是細(xì)胞在高溫脅迫下產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，它主要作為分子伴侶，輔助蛋白質(zhì)正確折疊和運(yùn)輸，維持蛋白的構(gòu)象和功能穩(wěn)定（Pegoraro et al，2011；Sarkar et al，2009）。根據(jù)分子量大小可將植物熱激蛋白分成HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子量熱激蛋白。小分子熱激蛋白的分子量在12～45 kD之間，也是保守性最低的一類熱激蛋白（Sun et al，2001，2002；Yang et al，2017）。研究發(fā)現(xiàn)小分子熱激蛋白基因在種子發(fā)育過(guò)程中受高溫和滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因能增強(qiáng)植物對(duì)干旱、高溫、鹽和UV-B 的抗性（Sun et al，2001；Zou et al，2012；孫愛(ài)清等，2015）。本研究以湖北省十堰市野生白及為研究對(duì)象，克隆小分子熱激蛋白基因BsHsp17.3，并對(duì)其組織特異性及生長(zhǎng)過(guò)程中主要面臨的3種不同脅迫條件進(jìn)行處理，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)該基因的表達(dá)情況，為白及人工栽培溫度調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生白及種子采自湖北省十堰市境內(nèi)，地理位置為110°85′ E、32°97′ N，海拔315.6～352.2 m，將采集的新鮮種子消毒滅菌后直播于培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，將5月齡白及植株馴化移栽于漢江師范學(xué)院生化系人工氣候室。

1.2 方法

1.2.1 白及逆境脅迫處理 對(duì)5葉齡白及植株分別進(jìn)行0 ℃、35 ℃， 20%PEG模擬干旱脅迫處理0、0.5、2、8、12 h，脅迫處理結(jié)束后取植株的完全展開葉片，于液氮中保存，用于基因表達(dá)特性分析。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 剪取生長(zhǎng)健康的葉片用于葉片總RNA提取（TRIzol法），反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于克隆BsHsp17.3基因。

1.2.3 BsHsp17.3基因的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的煙草Hsp17.3基因（LOC107832104）序列設(shè)計(jì)上游引物Hsp17.3-F和下游引物Hsp17.3-R，以總RNA為模板，按照 PrimeScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Code No.6111A）的操作說(shuō)明合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL cDNA模板，0.2 μL Pyrobest DNA Polymerase， F Primer（20 μmol·L-1）0.15 μL， R Primer（20 μmol·L-1）0.15 μL，10×Pyrobest Buffer II 2 μL，dNTP Mixture 0.2 μL，dH2O 16.3 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性2 min，30個(gè)循環(huán)（98 ℃、10 s，60 ℃、15 s，68 ℃、30 s），擴(kuò)增產(chǎn)物回收后測(cè)序。

采用3′-full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒（TaKaRa Code No.6106），利用3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer擴(kuò)增出完整的BsHsp17.3基因。用含有Gold view的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。回收后的PCR產(chǎn)物連接到pMDTM18-T載體上，委托Takara進(jìn)行DNA測(cè)序。所用引物見表1。

1.2.4 BsHsp17.3基因的序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用BioXM2.6軟件對(duì)BsHsp17.3基因的可閱讀框長(zhǎng)度進(jìn)行預(yù)測(cè)，并翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；用在線軟件SWISS-MODEL分析蛋白質(zhì)相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域；利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行同源序列分析；采用DNAMAN軟件對(duì)BsHSP17.3氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)；選取來(lái)源于19個(gè)不同植物的HSP17.3蛋白（表2），采用MEGA5軟件的鄰接法（NJ）構(gòu)建蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)發(fā)育樹，并編輯成圖。

1.2.5 BsHsp17.3基因組織特異表達(dá)分析 利用Trizol法分別提取白及的根、鱗莖、葉、花組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法見 BsHsp17.3基因的克隆。以白及28sRNA（GeneBank登錄號(hào)： NC_028422.1）為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物為QBs28sRNA-F和QBs28sRNA-R。利用Hsp17.3-F和Hsp17.3-R對(duì)不同的樣品進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，分析該基因在不同組織中的表達(dá)情況。

1.2.6 BsHsp17.3基因在不同脅迫條件下的表達(dá)情況分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），相對(duì)定量使用參照基因的ΔCT，ΔCT=CT目標(biāo)基因-CT28s。根據(jù)克隆到的BsHsp17.3基因序列設(shè)計(jì)熒光定量檢測(cè)引物QBsHsp17.3F和QBsHsp17.3R（表1），以白及28sRNA為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物為QBs28sRNA-F和QBs28sRNA-R。qRT-PCR擴(kuò)增體系、擴(kuò)增程序參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將生長(zhǎng)良好的白及幼苗分別置于0 ℃、35 ℃，20%PEG模擬干旱脅迫處理0、0.5、2、8、12 h。分別提取上述葉片的總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BsHsp17.3基因在不同脅迫處理下的相對(duì)表達(dá)量，每份樣品3次重復(fù)，數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCT 方法分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 BsHsp17.3基因的克隆與序列分析

采用RACE技術(shù)，從白及葉片中得到一條約500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1），將克隆得到的目的條帶進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示目的基因長(zhǎng)度為527 bp，通過(guò)分析顯示該基因的開放閱讀框?yàn)?53 bp，可編碼150個(gè)氨基酸，將其命名為BsHsp17.3。為了解BsHsp17.3蛋白的生物學(xué)活性及潛在功能，利用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)BsHSP17.3蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示BsHsp17.3蛋白的分子量為17.42 kD，等電點(diǎn)為6.33。該蛋白含有熱休克ACD核心區(qū)域，一段是Pro-X（14）-Gly-Val-Leu，另一段是Pro-X（13）-Val/Leu序列，中間被親水的片段隔開（圖2）。將獲得的BsHsp17.3翻譯成氨基酸序列進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）HSP17.3（登錄號(hào)為XP_020678819.1）蛋白具有54%的相似性；與亞洲棉（Gossypium arboreum）HSP17.3（登錄號(hào)為XP_017639609） 蛋白具有49%的相似性；與蓖麻（Ricinus communis）HSP17.3 （登錄號(hào)為XP_002520483）蛋白具有48%的相似性（圖3）。

2.2 HSP17.3的分子系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進(jìn)一步研究HSP17.3的進(jìn)化關(guān)系，將BsHSP17.3氨基酸序列與其他18種植物的HSP17.3氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。圖4結(jié)果表明：同為蘭科的鐵皮石斛、蝴蝶蘭與白及進(jìn)化關(guān)系較近，同源性較高。不同科植物中的HSP17.3氨基酸進(jìn)化較保守，如大戟科的蓖麻和麻瘋樹在同一分支上，豆科的大豆、樹豆和蔓花生在同一分支上，茄科的辣椒、煙草和野生煙草在同一分支上，錦葵科的亞洲棉和陸地棉在同一分支上，

2.3 BsHsp17.3基因在不同組織中的表達(dá)分析

利用Trizol法分別提取白及的根、鱗莖、幼葉、花組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以白及28sRNA為內(nèi)參基因，通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)BsHsp17.3基因在不同組織中的表達(dá)情況。圖5結(jié)果表明，BsHsp17.3基因在白及幼葉和根中進(jìn)行表達(dá)，在鱗莖和花中不表達(dá)。

2.4 BsHsp17.3基因在逆境處理下的表達(dá)特征分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BsHsp17.3基因在逆境處理下的表達(dá)特征。圖6結(jié)果表明，在0 ℃低溫脅迫下，處理0.5 h時(shí)，BsHsp17.3基因相對(duì)表達(dá)量快速上升達(dá)到最高，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，到12 h時(shí)與對(duì)照非常接近。這說(shuō)明BsHsp17.3基因能快速響應(yīng)低溫脅迫，誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，但隨著時(shí)間推移，基因的表達(dá)會(huì)被抑制，mRNA被降解。在35 ℃高溫脅迫下，BsHsp17.3基因表達(dá)情況和低溫脅迫較相似。在處理0.5 h時(shí)，BsHsp17.3基因相對(duì)表達(dá)量快速上升達(dá)到最高，隨后信號(hào)逐漸減弱。BsHsp17.3基因在20%PEG模擬干旱脅迫條件下相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著上升，且隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，該基因表達(dá)沒(méi)有顯著變化。上述研究表明BsHsp17.3基因在低溫以及高溫脅迫時(shí)表達(dá)量均會(huì)上調(diào)，該基因在植物防御低溫及高溫脅迫中發(fā)揮一定作用。

3 討論

誘導(dǎo)型熱激蛋白的累積決定著真核生物細(xì)胞的耐熱性。在熱激條件下，生物體大部分正常蛋白的合成受到抑制，熱激蛋白開始合成，合成的熱激蛋白可保護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)免遭損傷或修復(fù)已受損傷的蛋白質(zhì)，從而對(duì)生物體起到保護(hù)作用（Ruibal et al，2013）。小分子熱休克蛋白（sHSPs）單體都比較小，大小介于15～42 kD之間，核心區(qū)域是含有100個(gè)氨基酸左右的α-晶體蛋白區(qū)域。大分子量的熱休克蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的最保守蛋白之一，它在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中也保持較高的同源性，為60%～80%（Ruibal et al，2013；Chauhan et al，2012）。但是，小分子熱休克蛋白的保守性較低。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，sHSPs家族（sHSP17、sHSP20、sHSP22）的同源性低于50%（阮文進(jìn)等，2016；Murakami et al，2004）。同種類型的sHSP在不同物種中的同源性也較低，水稻中的sHSP21與擬南芥、煙草和大豆中的sHSP21同源性都低于52%（Gustavsson et al，2002；Kaur et al，2015）。本研究也證實(shí)了這一結(jié)論，BsHsp17.3與鐵皮石斛HSP17.3蛋白具有較高的同源性，才達(dá)到54%的相似性，與亞洲棉、蓖麻中的HSP17.3蛋白同源性都低于50%。小分子熱激蛋白家族C端α-晶體蛋白稱為熱休克ACD區(qū)域，這一區(qū)域具有較高的保守性（楊貴燕等，2015；Sun et al，2012；Ruibal et al，2013）。ACD區(qū)域含有兩端序列，分別為Pro-X（14）-Gly-Val-Leu和Pro-X（14）-X-Val/Leu，兩端序列被親水氨基酸片段隔開，白及Hsp17.3蛋白結(jié)構(gòu)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)（孫愛(ài)清等，2015；Ruibal et al，2013）。

sHSP作為植物熱激蛋白家族的重要一員，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的正確構(gòu)象，避免蛋白的聚集有重要作用。與大多數(shù)熱激蛋白基因類似，sHSPs不僅能響應(yīng)熱刺激，而且能響應(yīng)低溫、重金屬、紫外輻射和高鹽脅迫等（Sun et al，2001；Zou et al，2012；孫愛(ài)清等，2015）。將35S CaMV 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的番茄葉綠體小分子熱激蛋白cDNA 導(dǎo)入番茄表明，葉綠體小分子熱激蛋白的過(guò)量表達(dá)提高了植物抗寒性（Wang et al，2005）。過(guò)量表達(dá)葉綠體HSP21 基因也能增強(qiáng)擬南芥的強(qiáng)光和高溫脅迫抗性（Zhang et al，2013，2014；Siddique et al，2008）。還有研究表明，小分子熱激蛋白與植物細(xì)胞的減數(shù)分裂有關(guān)（蘇晴等，2013）。轉(zhuǎn)OsHSP18.2基因的擬南芥種子能夠通過(guò)減少ROS積累的毒害從而提高種子活力和壽命（Zhao et al，2014；朱麗偉等，2016）。在核桃中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)JrsHsp17.3能顯著提高株系的SOD、POD等酶的活性，從而抵抗低溫、高溫和高鹽脅迫（楊貴燕等，2015）。從白及中分離的BsHsp17.3基因與其他小分子熱激蛋白表達(dá)特性是一致的，能夠快速響應(yīng)高溫脅迫，其誘導(dǎo)表達(dá)水平受到脅迫溫度和時(shí)間的影響。脅迫溫度越低或越高，基因表達(dá)響應(yīng)越快，并且基因的表達(dá)不會(huì)隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而積累。在PEG模擬干旱脅迫下，BsHsp17.3基因表達(dá)沒(méi)有顯著變化，可能是因?yàn)榘准镑[莖中積累了大量的多糖，提高了細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，阻止了細(xì)胞內(nèi)水分的喪失，這也是BsHsp17.3基因在鱗莖中不表達(dá)的原因。

白及具有重要的藥用價(jià)值。在高溫和低溫情況下，白及地上部分植株枯萎進(jìn)行倒苗，這大大縮短了白及的生長(zhǎng)周期，減緩了白及鱗莖的生長(zhǎng)。對(duì)白及BsHsp17.3基因表達(dá)分析的研究有助于人工栽培白及溫度條件的控制，縮短倒苗的時(shí)間，起到增產(chǎn)增收的經(jīng)濟(jì)效益。植物抗逆是一個(gè)復(fù)雜的綜合反應(yīng)機(jī)制，小分子熱激蛋白參與了非生物脅迫的過(guò)程，在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起B(yǎng)sHsp17.3基因的表達(dá)，還有待進(jìn)一步的研究。

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