劉世旭　王慶　常藕琴　周文禮

摘要：【目的】制備基因I型草魚呼腸孤病毒（GCRV）VP7蛋白合成肽抗體并驗證其特異性，為研究VP7外衣殼蛋白在基因I型GCRV病毒與宿主間的相互作用及研制基因工程疫苗提供參考依據?！痉椒ā恳訥CRV GZ1208株為模板進行RT-PCR擴增，運用在線生物信息學分析軟件對VP7蛋白B細胞表位進行功能預測，選擇位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列進行人工合成，與鑰孔血藍蛋白載體蛋白偶聯后免疫新西蘭白兔以獲得VP7蛋白合成肽抗體，然后采用Western blotting和間接免疫熒光試驗驗證VP7蛋白合成肽抗體對基因I型GCRV的特異性識別能力?！窘Y果】VP7蛋白氨基酸序列在基因I型GCRV中高度保守，其合成肽抗體效價約1∶256000。Western blotting分析結果顯示，融合蛋白VP7約在55 kD處出現單一的特異性條帶，而GZ1208株和JX0901株樣品約在30 kD處出現對應的特異性條帶，與預期結果基本一致；間接免疫熒光試驗結果表明，VP7蛋白合成肽抗體可特異性識別感染基因I型GCRV的草魚腦細胞（GCB），感染細胞中出現特異性綠色熒光信號，而感染其他基因型GCRV及正常未感染病毒的GCB細胞中均無特異性綠色熒光出現?！窘Y論】制備獲得的VP7蛋白合成肽抗體能特異性識別基因I型GCRV，而不識別其他基因型毒株，可用于草魚出血病的臨床診斷和基因I型GCRV的病原學研究。

關鍵詞： 草魚呼腸孤病毒（GCRV）；基因I型；VP7蛋白；原核表達；合成肽抗體

中圖分類號： S943.112 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）09-1849-09

0 引言

【研究意義】草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國最重要的淡水經濟魚，其產量約占全國淡水魚生產總量的20%（Rao and Su，2015），除西藏和青海呈零星養(yǎng)殖外，在我國其他各地均有一定規(guī)模養(yǎng)殖。據全國漁業(yè)統(tǒng)計結果顯示，2014年我國草魚養(yǎng)殖產量達506.99萬t，2015年576.62萬t，2016年589.88萬t，其產值多年以來均穩(wěn)居我國淡水魚養(yǎng)殖首位。草魚在全球40多個國家和地區(qū)均有分布（Dong et al.，2012），但隨之而來的病害日趨頻發(fā)，尤其是出血病嚴重阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（Brudeseth et al.，2013）。草魚出血病主要由草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）引起，是我國分離鑒定的第一例水生病毒（Zhang et al.，2008），且該病毒致病力強、傳染性高（Lu et al.，2011），一旦感染可導致草魚苗大量死亡，造成嚴重的經濟損失。因此，加強GCRV的致病機理及其防治措施研究，對確保草魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】GCRV是研究水生呼腸孤病毒復制和發(fā)病機理的代表病毒（He et al.，2011），其基因組由11個雙鏈RNA節(jié)段（S1～S11）組成，無囊膜，呈20面體的球狀顆粒（Ye et al.，2012）。目前，已報道GCRV擁有40多個分離株，包括854、861、873、875、876、90l4 、991、V、 H-962、ZV-8802、854、HZ08、JX09-01、JX09-02、GD108、104、106、109、Hunan1307和GZ1208等分離株，且不同分離株在致細胞病變、毒力、基因組電泳帶型、基因組序列和特征等方面存在明顯差異（Wang et al.，2012；Ye et al.，2012；Fan et al.，2013）。根據基因組差異，GCRV可分為3種基因型（Wang et al.，2012），其中873、HZ08、104分離株分別為基因I、II和III型的代表株（曾偉偉等，2017）。不同基因型GCRV感染草魚后引起的癥狀不完全相同，對草魚的致病率和致死率也不相同（張敏利等，2018）。其中，基因I型GCRV的S10節(jié)段編碼蛋白與銀大馬哈魚呼腸孤病毒（Coho salmon reovirus，SCSV）和條紋鱸呼腸孤病毒（Striped bass reovirus，SBRV）S10節(jié)段編碼的外衣殼蛋白，以及哺乳動物正呼腸孤病毒（Mammalian orthoreovirus，MRV）S4節(jié)段編碼的外衣殼蛋白同源性較高，具有相同的鋅指結構和相似的親水基團分布情況，由此預測GCRV的S10節(jié)段基因編碼一種外衣殼蛋白（Liu et al.，2016）。Chen等（2013）研究證實，GCRV含7種結構蛋白和4種非結構蛋白，其中VP7具有較好的抗原性。郝貴杰等（2010）以VP7基因為靶基因構建重組表達質粒，并成功轉染至真核細胞中，實現了高效表達；Luo等（2015）的抗體中和試驗結果也證實，VP7是GCRV的主要抗原表位，為研制GCRV基因疫苗提供了參考資料。采用原核表達系統(tǒng)獲得重組蛋白再免疫實驗動物制備多克隆抗體的方法較常見，但存在抗體特異性差、效價低的問題。合成肽是以化學合成方法按蛋白氨基酸順序合成類似抗原表位的一種保護性短肽，與變性蛋白的結合性較高，抗原的特定區(qū)域能被合成肽識別（高華義等，2018）。合成肽屬于小分子物質，以半抗原形態(tài)存在，很難在免疫動物體內引起有效的免疫反應，因此必須耦聯載體蛋白（黃劍波，2016）。Tanzadehpanah等（2016）研究表明，以合成肽為抗原制備多克隆抗體，可降低抗原用量，且得到的多克隆抗體效價較高?！颈狙芯壳腥朦c】GCRV GZ1208株分離自廣州某養(yǎng)殖場發(fā)病草魚，其S10節(jié)段全長909 bp，含一個831 bp的開放閱讀框（ORF），編碼VP7外衣殼蛋白（分子量約30 kD），但至今未見針對VP7蛋白合成肽制備抗體的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以GCRV GZ1208株為模板進行RT-PCR擴增，運用在線生物信息學分析軟件對VP7蛋白B細胞表位進行功能預測，選擇位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列進行人工合成，與鑰孔血藍蛋白載體蛋白偶聯后免疫新西蘭白兔以獲得VP7蛋白合成肽抗體，然后采用Western blotting和間接免疫熒光試驗驗證合成肽抗體對基因I型GCRV的特異性識別能力，為后續(xù)研究VP7外衣殼蛋白在基因I型GCRV病毒與宿主間的相互作用及研制基因工程疫苗提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

草魚腦細胞（GCB）及GCRV GZ1208株、JX09-01株、Hunan1307株、HZ08株、傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）、錦鯉皰疹病毒（KHV）由中國水產科學研究院珠江水產研究所魚病室保存提供；GCRV 104株由中國水產科學研究院長江水產研究所曾令兵研究員惠贈；pE-T32a（+）質粒由農業(yè)農村部漁藥創(chuàng)制重點實驗室保存提供；M199培養(yǎng)基、小牛血清（FBS）和胰酶購自美國Gibco公司；Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自TOYOBO公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和BL21（DE3）、EcoR I酶、Xho I酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs及DNA Marker購自TaKaRa公司；T4 Ligase購自Promega公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自OMEGA公司；SDS-PAGE試劑盒、DAB顯色試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG和FITC標記的羊抗兔IgM購自博士德生物工程有限公司。

1. 2 S10基因擴增

根據GenBank上GCRV GZ1208株VP7外衣殼蛋白的編碼序列（KU240083.1）設計引物（5'-CCGGAA

TTCATGCCACTTCACATGATTCCGCAA-3'和5'-AC

GCTCGAGATCGGATGGCTCCACATGGCAAG-3'），下劃線部分分別為EcoR I和Xho I酶切位點；以GCRV GZ1208株感染GCB細胞，運用Trizol法提取細胞RNA，RT-PCR擴增目的片段。反應體系25.00 μL：dNTPs 4.00 μL，GZ1208株cDNA模板2.00 μL，上、下游引物各0.50 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，LA Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 15.25 μL。擴增程序：95 ℃預變性4 min；94 ℃ 35 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應結束后回收純化擴增產物。

1. 3 生物信息學分析

S10基因測序結果在NCBI上進行BLAST分析，運用DNASTAR和IEBD對VP7蛋白氨基酸序列進行抗原表位預測。

1. 4 多肽合成及抗體制備

根據抗原表位預測結果，選擇位于VP7蛋白上第26～39位氨基酸的多肽序列（TKTRTETTNFDHAD）送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成多肽，與鑰孔血藍蛋白載體蛋白KLH偶聯后免疫新西蘭白兔。參照王玉坤等（2008）、李麗等（2015）、宗乾坤等（2016）的方法收集血清制備抗體。

1. 5 間接ELISA檢測血清抗體效價

采用pH 7.4的碳酸鹽緩沖液稀釋VP7蛋白合成肽（終濃度4 mg/mL）包被96孔酶標板，每孔100.00 mL，分別按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000和1∶512000梯度加入血清抗體及HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5000倍稀釋）100.00 mL，其余步驟參照Mahajan等（2015）、Yu等（2015）、張玉瑤等（2015）、Andreolla等（2018）的方法進行操作。

1. 6 表達載體構建

擴增獲得的S10基因目的片段與原核表達載體pET-32a（+）進行雙酶切，酶切產物在16 ℃下連接10～12 h，連接體系：T4 Ligase 0.50 μL，T4 Ligase Buffer 2.00 μL，pET-32a（+）2.00 μL，S10基因目的片段5.50 μL。將連接產物轉化至E. coli DH5α中，收集后擴培菌液，提取重組質粒。重組質粒進行雙酶切鑒定，陽性質粒送至廣州市艾基生物技術有限公司進行測序。當雙酶切鑒定和測序結果顯示載體構建成功時，將重組表達載體命名為pET-32a-S10。

1. 7 融合蛋白表達

重組表達載體pET-32a-S10轉化至E. coil BL21（DE3），擴大培養(yǎng)及誘導操作參照胡濤等（2015）的方法，待OD600=0.4時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導8 h，然后在冰上對菌體沉淀進行超聲波破碎（Al-Juboori and Yusaf，2012；吳倩等，2015）：破碎4 s，停頓15 s，功率250 W，離心收集上清液和沉淀，以考馬斯亮蘭染色確定融合蛋白的表達形式。

1. 8 誘導條件優(yōu)化及目的蛋白純化

參考Cheng等（2016）、羅忠永等（2017）的方法進行IPTG誘導條件優(yōu)化，發(fā)現當OD600=1.2、IPTG終濃度為1.6 mmol/L時，融合蛋白的表達量最高。誘導后進行離心，超聲波破碎菌體沉淀，按試劑盒說明通過Ni柱親和層析進行純化，洗脫得到純化的融合蛋白。純化融合蛋白經SDS-PAGE分析，參考Suwal等（2014）的方法用0.3 mol/L KCl溶液進行回收。

1. 9 Western blotting分析

分別選取GCRV的基因I型（GZ1208和JX0901）、II型（HZ08和Hunan1307）、III型（104）毒株及KHV和ISKNV感染GCB細胞，感染7 d后收集GCB細胞，加入上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min，取5.00 μL進行上樣；剩余步驟參考劉文慧等（2015）的方法，最后采用DAB顯色液進行顯色。

1. 10 間接免疫熒光試驗

將GCB細胞傳至96孔板，待細胞長至單層并占據孔板表面積80%～90%時，接種GZ1208、JX09-01、Hunan1307、HZ08和104株的病毒液，設立空白對照，接毒5 d后進行間接免疫熒光試驗（Gao et al.，2018；Wang et al.，2018），一抗為兔抗VP7多克隆抗體（1∶200倍稀釋），二抗為FITC標記的羊抗兔IgM（1∶50倍稀釋），于倒置熒光顯微鏡觀察結果。

2 結果與分析

2. 1 目的片段擴增及序列測定結果

經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現，陰性對照無任何條帶，而S10基因擴增產物的特異性條帶位于750～1000 bp，大小約850 bp（圖1），與預期結果一致。PCR擴增產物送至廣州艾基生物技術有限公司測序，測序結果與KU240083.1序列一致。

2. 2 VP7蛋白抗原表位分析結果

采用DNASTAR分析GZ1208株VP7蛋白氨基酸序列的抗原指數、親水性、表露性和疏松區(qū)域等參數，結果（圖2）顯示，位于第26～39位的氨基酸片段抗原指數、親水性和表露性均較高，可能為VP7蛋白的抗原表位。此外，BLAST比對分析結果顯示，VP7蛋白氨基酸序列在基因I型GCRV中高度保守。

2. 3 VP7合成肽抗體效價檢測結果

采用間接ELISA測定血清抗體效價，結果顯示抗體稀釋倍數為1∶256000時，多肽抗體與陰性對照比值為2.70，即VP7蛋白合成肽抗體效價約1∶256000。

2. 4 重組質粒雙酶切鑒定結果

對重組質粒pET-32a-S10進行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現約在6000和850 bp處各出現一條特異性條帶（圖3）；陽性樣品送至廣州艾基生物技術有限公司測序，結果表明目的片段正確無誤。

2. 5 融合蛋白的表達與純化結果

通過SDS-PGAE分析，發(fā)現經IPTG誘導獲得的融合蛋白約在55 kD處出現明顯的特異性條帶，其大小與預期結果（53 kD）基本一致；將IPTG誘導得到的菌體重懸液進行超聲波破碎處理后，亦可得到與預期結果一致的特異性條帶（圖4），說明VP7融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

融合蛋白經Ni柱親和層析純化后進行電泳，發(fā)現純化后的融合蛋白約在55 kD處可見單一的特異條帶，而未純化的菌體總蛋白中含有較多的雜帶（圖5），說明蛋白的純化效果良好。

2. 6 Western blotting分析結果

Western blotting分析結果（圖6）顯示，融合蛋白樣品約在55 kD處出現單一的特異性條帶，而空載體蛋白泳道無對應條帶。此外，GZ1208株和JX09-01株樣品約在30 kD處出現對應的特異性條帶，與預期結果基本一致；其他樣品則無任何條帶出現，說明制備的合成肽抗體血清只能特異性識別VP7融合蛋白和基因I型GCRV。

2. 7 間接免疫熒光試驗結果

由圖7可知，制備的合成肽抗體可特異性識別感染基因I型GCRV的GCB細胞，感染細胞中出現特異性綠色熒光信號，而感染其他基因型GCRV及正常未感染病毒的GCB細胞中均無特異性綠色熒光出現。

3 討論

草魚是我國淡水養(yǎng)殖的主養(yǎng)品種，每年的產量超過500萬t，位居淡水養(yǎng)殖魚類之首（楊映等，2015），但也是水產養(yǎng)殖動物中病害最多發(fā)的一種魚類（Wu et al.，2017）。GCRV隸屬于水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus），是我國分離鑒定的第一株水生動物病毒，其發(fā)現可追溯到1953年（Tian et al.，2017）；草魚感染發(fā)病的臨床癥狀主要是肌肉充血，腸道出血，鰭條、鰓蓋充血，故又稱為草魚出血?。≦iu et al.，2001）。GCRV基因組可分為11個節(jié)段雙鏈RNA，具有較高的變異性（Hao et al.，2017）。GCRV流行情況復雜，我國至少存在3種基因型（He et al.，2017），以基因II型為主，其次為基因I型，也有基因I型和II型混合感染的情況存在。GCRV的外衣殼蛋白主要是VP5和VP7，二者以200個三聚體的形式出現，而形成外層衣殼（Liu et al.，2017）。其中，VP7在GCRV感染宿主并使之患病的過程中發(fā)揮著不可忽視的作用（Ivanovic et al.，2007；Fang et al.，2008），尤其在病毒與宿主細胞相互作用及病毒進入宿主細胞的過程中，外衣殼上的三聚體作為受體識別位點存在（Yan et al.，2014），故推測VP7蛋白有助于GCRV入侵草魚（Shao et al.，2011）。

目前用于草魚出血病免疫防控的疫苗主要有滅活疫苗、弱毒疫苗和土法疫苗（高巖等，2017），也有部分實驗室針對基因工程疫苗開展了積極研究，如重組亞單位疫苗和核酸疫苗，主要采用GCRV的外衣殼蛋白制備。雖然市場上已有商品化的疫苗可供使用，但每年因草魚出血病暴發(fā)引起的經濟損失仍居高不下。草魚出血病頻繁暴發(fā)可能與GCRV復雜的基因型有關。黃毅昌等（2016）研究指出，不同基因型毒株間多數功能性位點的保守性較低。Wang等（2016）研究證實，不同基因型GCRV在生物學特性上存在明顯差異，采用不同基因型GCRV免疫鮈鯽，其交叉保護性較低。本研究結果表明，以IPTG誘導獲得的VP7融合蛋白與鑰孔血藍蛋白載體蛋白偶聯后，免疫新西蘭白兔而獲得的VP7蛋白合成肽抗體只能識別基因I型GCRV，進一步證實3種基因型GCRV的外衣殼蛋白存在明顯差異。

采用原核表達或真核表達系統(tǒng)誘導表達獲得重組蛋白，并免疫實驗動物制備多克隆抗體的方法較常見，但抗體效價水平不一。郝貴杰等（2010）利用真核表達系統(tǒng)制備的GCRV VP7蛋白抗體效價僅1∶320；劉學光等（2013）通過原核表達傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）G蛋白并制備相應的多克隆抗體效價為1∶105；黃新新等（2015）以原核表達桃拉綜合征病毒VP1高變區(qū)蛋白并制備多克隆抗體，其抗體效價為1∶217；黃謐和馮勇（2017）借助原核表達系統(tǒng)制備的大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白多克隆抗體的抗體效價為1∶50000；湯亞芳等（2018）利用原核表達蛋白制備的基因II型GCRV VP6蛋白抗體效價為1∶105。原核表達的融合蛋白在表達過程中常出現包涵體形式。包涵體不溶于水，無法形成正確次級鍵的表達產物，因此免疫后制備的血清有時不能正常識別原始生物蛋白。本研究中采用pET-32a（+）質粒構建的重組質粒pET-32a-S10經IPIG誘導表達后，融合蛋白也是以包涵體形式存在；制備獲得的VP7蛋白合成肽抗體效價約1∶256000，其抗體效價高于一般的多克隆抗體，且抗體的特異性較好，能準確識別基因I型GCRV，而不識別其他基因型毒株，表明制備獲得的合成肽抗體已達到預期設計要求，為后續(xù)的研究工作打下一定基礎。

4 結論

制備獲得的VP7蛋白合成肽抗體能特異性識別基因I型GCRV，而不識別其他基因型毒株，可用于草魚出血病的臨床診斷和基因I型GCRV的病原學研究。

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（責任編輯 蘭宗寶）