呂殷婷 焦舉 楊婷 鄒瓊 江淑琴 張勇

【摘要】目的從人前列腺癌DU145細胞中富集具有干細胞特性的腫瘤細胞，并鑒定其腫瘤干細胞特性。方法利用流式細胞儀比較人前列腺癌LNCaP細胞、DU145細胞中CD44+細胞所占比例；通過無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)，富集干性腫瘤細胞，計算不同時間點成球率；將無血清懸浮培養(yǎng)的腫瘤微球細胞，再次在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，驗證腫瘤干細胞的分化特性；利用CCK8增殖試驗分別檢測DU145細胞和DU145腫瘤微球細胞，比較兩者增殖能力的差異；分別以DU145腫瘤微球細胞、DU145細胞為實驗組和對照組制備荷瘤裸鼠模型，比較兩者體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果流式細胞儀檢測顯示CD44+LNCaP、CD44+DU145比例分別為04%、976%。無血清懸浮培養(yǎng)DU145細胞第2日的成球率為（144±78）%，第7日的成球率為（342±87）%，第14日的成球率高達（614±76）%。懸浮成球DU145細胞在加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基24h后，表現(xiàn)出和常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU145細胞相同形態(tài)。DU145腫瘤微球細胞在鋪板后24h其增殖能力就可達到DU145細胞的2倍左右，在第6日之后，DU145腫瘤微球細胞存活率仍高于DU145細胞，組間450nm處吸光度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<005）。與DU145細胞荷瘤裸鼠相比，DU145腫瘤微球細胞荷瘤裸鼠的移植瘤體積較大、生長速度較快（P均<005）。結(jié)論無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的DU145細胞經(jīng)富集分離可得到具有干細胞特征的前列腺腫瘤細胞，該方法簡便易行，具有較理想的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】前列腺腫瘤干細胞；分化群44；無血清培養(yǎng)；富集；鑒定

EnrichmentandidentificationofprostatecancerstemcellsfromDU145cellsLyuYinting，JiaoJu，YangTing，ZouQiong，JiangShuqin，ZhangYongDepartmentofNuclearMedicine，theThirdAffiliatedHospitalofSunYatsenUniversity，Guangzhou510630，China

Correspondingauthor，ZhangYong，Email：zy5040@163com

【Abstract】ObjectiveToenrichprostatecancerstemcellsfromhumanprostatecancerDU145celllineandidentifythecharacteristicsoftumorstemcellsMethodTheproportionofCD44+cellsinLNCaPandDU145cellswasdetectedbyflowcytometryThespheroidizationratesatdifferenttimepointswerecalculatedbyserumfreecontinuouscultureandenrichmentoftumorstemcellsThetumormicrospheresculturedintheserumfreeculturemediumweresubsequentlyculturedintheserumcontainingculturemediumtoverifythedifferentiationabilityoftumorstemcellsCCK8proliferationassaywasadoptedtomonitorandcomparetheproliferationabilitybetweenDU145cellsandDU145tumormicrospheresThetumorbearingnudemousemodelswereestablishedbyDU145cellsasthecontrolgroupandDU145tumormicrospheresastheexperimentalgroupThetumorigenicabilityinvivowasstatisticallycomparedbetweentwogroupsResultsFlowcytometrydemonstratedthattheproportionofCD44+LNCaPcellsandCD44+DU145cellswas04%and976%Afterculturedintheserumfreesuspension，thespheroidizationrateofDU145cellswas（144±78）%onthe2ndday，（342±87）%onthe7thdayand（614±76）%onthe14thday，respectivelyAfterculturedinthemediumcontaining10%fetalbovineserumfor24h，DU145tumormicrospheresshowedthesamemorphologyasDU145cellsTheproliferationabilityofDU145tumormicrosphereswasapproximatelytwiceashighasthatofDU145cellsduringthefirst24hOnthe6thday，thesurvivalrateofDU145tumormicrosphereswasstillhigherthanthatofDU145cellsTheabsorbancevaluesatthewavelengthof450nmsignificantlydifferedbetweentwogroups（allP<005）ComparedwithtumorbearingnudemousemodelsestablishedbyDU145cells，thetumorsizewassignificantlylargerandthegrowthratewasconsiderablyfasterinthemousemodelsbyDU145tumormicrospheres（bothP<005）ConclusionProstatecancerstemcellscanbeobtainedafterenrichmentandisolationbyserumfreecontinuouspassageofDU145cells，whichissimpleandfeasibleanddeservespromisingapplicationprospect

【Keywords】Prostatecancerstemcell；CD44；Serumfreeculture；Enrichment；Identification

前列腺癌是全球第二常見的男性惡性腫瘤[1]。雖然前列腺癌可以早期診斷及治療，但仍然是全世界男性癌癥死亡的第六大原因[2]。目前，針對前列腺癌治療的方式主要有手術(shù)切除、放射治療、內(nèi)分泌治療等幾大類[3]。然而，大多數(shù)前列腺癌在去勢手術(shù)治療后2年內(nèi)最終將轉(zhuǎn)化為去勢抵抗型前列腺癌，亦稱為難治性前列腺癌（CRPC）。近年來，許多研究者提出了“前列腺腫瘤干細胞（PCSC）”的概念，認為這可能是前列腺癌的細胞起源，并在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、去勢抵抗及耐藥等多個方面發(fā)揮作用[4]。腫瘤干細胞是腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性的細胞，其特性還包括具有分化潛能、高致瘤性等[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，從前列腺移植瘤中獲取的CD44+細胞具有干細胞特性。CD44是一種細胞表面分子，在細胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤遷移進展等多方面有重要作用，也被公認為是細胞具有干性傾向的分子標志。本研究選取人前列腺癌DU145細胞進行無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)，從而富集、分離腫瘤干細胞并鑒定其特性，以期利用一種簡單、快捷、有效的方法實現(xiàn)前列腺腫瘤干細胞的制備，為后續(xù)更多針對前列腺癌干細胞靶向治療的研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

人前列腺癌LNCaP、DU145細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Gibco公司。青霉素鏈霉素混合液、005%胰酶（含EDTA）、牛血清白蛋白（BSA）、胰島素、B27購自美國Sigma公司。人重組表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（bFGF）購于美國PeproTech公司。胰酶抑制劑購自索萊寶公司。超低黏附6孔培養(yǎng)板購自美國Corning公司。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人CD44抗體及其同型抗體（IgG2b）、流式細胞儀購自美國BD公司。CCK8增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。550型酶標儀購自美國Biorad公司。4～6周齡的NODSCID雄性裸鼠，體質(zhì)量18～20g，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動物實驗中心SPF級動物房，實驗遵循動物倫理要求。

二、方法

1細胞培養(yǎng)及傳代

將RPMI1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液制備成含血清培養(yǎng)基（SSM）。將體積分數(shù)2%B27、04%BSA、5μg/ml胰島素、10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF加入DMEM/F12培養(yǎng)基制備成無血清培養(yǎng)基（SFM）。DU145細胞在SSM中培養(yǎng)時，每2d進行細胞換液或傳代；在SFM中培養(yǎng)時，每日觀察懸浮細胞生長情況并輕搖晃培養(yǎng)瓶避免細胞貼壁，每3d進行細胞換液，每7d進行細胞傳代。細胞傳代時，棄舊培養(yǎng)基，加入1ml胰酶共孵育2min后，加入2ml胰酶抑制劑（或SSM）終止消化，后繼續(xù)按1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況。

2LNCaP、DU145細胞中CD44+表達情況的檢測

取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對數(shù)生長期的LNCaP細胞和DU145細胞，分別以1×106個重懸于100μlPBS溶液中，2種細胞各制備3管，分別為空白管、同型對照管（含1μlIgG2b）、FITCCD44抗體管（含1μlFITCAntiCD44）避光4℃反應(yīng)15min后，加入1mlPBS，1000轉(zhuǎn)/分離心3min，輕倒掉上清液后加入400μlPBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測CD44+細胞比例。

3DU145細胞無血清傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細胞及成球率的計算

取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對數(shù)生長期的DU145細胞，經(jīng)40μm孔徑細胞篩濾過，用PBS離心清洗1次以去除血清后，以3×104個/孔重新鋪板于超低黏附6孔板中，加入SFM繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d。每日搖晃1次培養(yǎng)板避免細胞貼壁，每3d換1次液，分別于第20h、2d、7d、14d在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察。以形態(tài)立體、腫瘤細胞微球直徑>60μm定義為成球，連續(xù)計數(shù)5個視野取平均值計算成球率。成球率=該視野內(nèi)成球細胞個數(shù)/該視野內(nèi)總細胞個數(shù)×100%。

4SSM和SFM中檢測DU145腫瘤微球細胞的分化能力

將連續(xù)在SFM中培養(yǎng)14d后的DU145腫瘤微球細胞用胰酶消化分離后，用SSM終止反應(yīng)，1000轉(zhuǎn)/分離心3min后棄上清液，加入新鮮SSM重懸細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，動態(tài)觀察并記錄細胞形態(tài)變化情況。收集細胞，再次用500μl胰酶消化3min后用1ml胰酶抑制劑終止反應(yīng)，離心后，用新鮮SFM重懸細胞并動態(tài)觀察記錄細胞形態(tài)變化情況。

5DU145腫瘤微球細胞的體外增殖能力檢測

分別將DU145細胞、DU145腫瘤微球細胞制備成單細胞懸液，以103個/100μl的密度在96孔板中各接種3孔，使用SSM、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每塊板設(shè)置3個含100μlSSM但不含細胞的的空白孔，以后每隔2d換液1次。第1～8日，每日于同一時間給一塊板加入10μlCCK8工作液后與細胞避光繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15h后，利用酶標儀測定450nm處吸光度（OD450），并繪制細胞增殖曲線。

6檢測DU145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況

DU145細胞（65×105/100μl）、DU145腫瘤微球細胞（65×104/100μl）分別消化、離心后以PBS重懸為上述密度單細胞懸液。將6只雄性NODSCID裸鼠稱重后隨機分為2組，每組3只。每只裸鼠注射100μl細胞懸液和100μl基質(zhì)膠混合液于左后腿根部皮下，動態(tài)觀察2組裸鼠的成瘤情況，待肉眼可見腫瘤后，每5d用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積=（π×長徑×短徑2/6）mm3，35d后處死裸鼠，并繪制腫瘤生長曲線。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS130處理數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、LNCaP細胞、DU145細胞中CD44+細胞比例比較

CD44+LNCaP細胞、CD44+DU145細胞比例分別為04%、976%，見圖1。CD44+DU145細胞比例約為CD44+LNCaP細胞的271倍。

二、DU145細胞無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細胞及成球率

DU145細胞具有干細特征的部分可以在無血清培養(yǎng)基中生存并逐漸形成懸浮細胞球：懸浮培養(yǎng)20h時，單個細胞開始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；懸浮培養(yǎng)第2日可觀察到一小部分細胞表現(xiàn)出成球團的趨勢，成球率為（144±78）%；第7日可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成，成球率為（342±87）%；懸浮培養(yǎng)第14日，成球率明顯較第7日增加，滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球，成球率為（614±76）%。并且DU145腫瘤微球細胞在經(jīng)過無血清懸浮培養(yǎng)傳代后，仍可形成與原細胞形態(tài)類似的次代并逐漸形成懸浮腫瘤微球細胞，見圖2。

三、DU145腫瘤微球細胞的分化能力

將無血清懸浮培養(yǎng)的DU145腫瘤微球細胞轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清中培養(yǎng)10h，已能觀察到細胞貼壁，24h后其伸出偽足逐漸形成單層貼壁細胞，形態(tài)與常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU145相近，見圖3。再次將其轉(zhuǎn)入無血清懸浮培養(yǎng)，仍能在20h后觀察到單個細胞開始出芽，形成一些懸浮細胞團，繼續(xù)培養(yǎng)至第5日，可觀察到典型腫瘤細胞球形成。

四、DU145腫瘤微球細胞的體外增殖能力

DU145腫瘤微球細胞與普通DU145細胞在鋪板后第2日的OD450分別為0757±0059、0373±0068，DU145腫瘤微球細胞增殖能力達到普通DU145細胞2倍左右（t=7382，P<005）。從第6日開始，兩者皆進入生長平臺期。到第8日，DU145腫瘤微球細胞與普通DU145細胞的OD450分別為0228±0063、0086±0036，DU145腫瘤微球細胞存活量仍高于DU145細胞（t=3373，P<005），見圖4。

五、DU145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況

DU145細胞組種植細胞的數(shù)量級是DU145腫瘤微球細胞組的10倍，但在移植瘤細胞接種裸鼠

圖1LNCaP細胞、DU145細胞中CD44+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果

A、B：LNCaP細胞；C、D：DU145細胞

A：懸浮培養(yǎng)20h時，單個細胞開始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；B：懸浮培養(yǎng)第2日，可觀察到一小部分細胞表現(xiàn)出成球團的趨勢；C：懸浮培養(yǎng)第7日，可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成；D：懸浮培養(yǎng)第14日，滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球；標尺=60μm

細胞的體外增殖能力比較后第10日，DU145細胞組僅2只裸鼠可見皮下成瘤，瘤體體積（84±12）mm3，成瘤率2/3，而DU145腫瘤微球細胞組3只裸鼠均可見皮下腫瘤形成，瘤體體積（281±59）mm3，成瘤率為3/3，DU145腫瘤微球細胞組在第10日的瘤體體積大于DU145細胞組（t=4464，P<005）。接種后第30～35日為移植瘤快速生長期，DU145細胞組生長速度為（692±201）mm3/d，DU145腫瘤微球細胞組為（3763±451）mm3/d，DU145腫瘤微球細胞組生長速度達到DU145細胞組的5倍（t=8709，P<005），見圖5A。DU145細胞與DU145腫瘤微球細胞移植瘤在裸鼠體內(nèi)生長35d后活體情況見圖5B、C。

A：接種DU145細胞與DU145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的移植瘤體積增長曲線；B：DU145細胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35d生長情況，紅色箭頭為裸鼠皮下成瘤處；C：DU145腫瘤微球細胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35d生長情況討論

近年來，研究者們已在多種腫瘤中分離并證實存在腫瘤干細胞[67]。在既往關(guān)于前列腺癌治療的相關(guān)報道中，基本是以前列腺癌細胞系為研究對象進行體內(nèi)外研究。然而越來越多的研究表明，前列腺腫瘤干細胞才是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源。為此，本研究通過簡單易行的無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法富集、分離前列腺腫瘤干細胞，并證明了其腫瘤干細胞相關(guān)特性，以期為針對前列腺腫瘤干細胞的診斷及治療研究奠定基礎(chǔ)。雖然，免疫磁珠分選法和流式分選法也是為研究者們所熟知的分選、富集腫瘤干細胞的另外2種常見方法。但是，這2種方法相較于本研究所使用的無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法，對科研設(shè)備要求更高，費用也較為昂貴，例如利用免疫磁珠法分選CD44+DU145細胞需要合適的磁場，以及同時制備大量的DU145細胞（108數(shù)量級）進行分選，對研究實驗要求較高[8]。若利用流式分選法進行CD44+DU145細胞分選，由于流式細胞儀分選通道較長易造成細胞污染，且分選步驟復(fù)雜容易損傷細胞活性，分選得到的細胞難以用于后續(xù)實驗[9]。

雖然既往研究顯示，CD44分子仍表達于結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌、胃癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌等腫瘤細胞[1011]。但本研究選用的是CD44+人前列腺癌DU145細胞系，研究對象為前列腺癌，并通過無血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式富集得到了具有干性特征的前列腺腫瘤細胞。因此，這與CD44不僅表達在前列腺腫瘤干細胞的特性并不沖突。

研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細胞株如LNCaP、DU145及PC3中，CD44+細胞比CD44-細胞有更強的增殖及成瘤的能力。Ugolkov等[12]指出，在前列腺癌組織中CD44+細胞約占72%，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了以往干細胞僅占據(jù)組織細胞很小比例的認識。本研究中，流式細胞儀檢測結(jié)果示DU145細胞系中CD44+細胞約占976%，與Ugolkov等的觀點相符。

綜上所述，本研究通過對DU145細胞系連續(xù)傳代無血清培養(yǎng)富集、分離得到了具有干性特征的腫瘤細胞。這對于腫瘤干細胞這一類較難獲取細胞具有重要意義。同時，本研究也對前列腺癌治療的相關(guān)研究，特別是對去勢難治性前列腺癌的治療提供了一種新的靶向治療思路，即針對前列腺腫瘤干細胞進行靶向治療，從根源上治療前列腺癌。針對前列腺腫瘤干細胞的研究極具前景，本研究團隊將以此研究為基礎(chǔ)，今后繼續(xù)開展針對前列腺腫瘤干細胞靶向診斷及治療的相關(guān)研究，進而為前列腺癌的基礎(chǔ)研究提供一定的支持或參考。

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（收稿日期：20180320）