周珊瑤 陳睿 譚夕 佘燕玲 雷斯

【摘要】目的探討Necrostatin1（Nec1）在二氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)缺氧的條件下對骨骼肌細(xì)胞損傷修復(fù)的保護(hù)作用。方法采用小鼠骨骼肌C2C12成肌細(xì)胞為體外模型，CoCl2誘導(dǎo)缺氧，Nec1為缺氧保護(hù)劑。將培養(yǎng)分化72h后的細(xì)胞分為4組，分別加入等量培養(yǎng)基（Control組）、200μMCoCl2（CoCl2組）、150μMNec1（Nec1組）、200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1組），于光鏡下觀察不同處理組細(xì)胞的肌管形態(tài)，采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測肌細(xì)胞生成素（Myog）、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（MEF2A）蛋白表達(dá)的變化，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞周期S期比例，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的損傷修復(fù)能力。結(jié)果CoCl2可誘導(dǎo)肌細(xì)胞形態(tài)異常，減少肌管分化，與Control組比較，CoCl2組Myog、MEF2A蛋白表達(dá)量降低（P均<001），同時(shí)，S期細(xì)胞比例下降（P<001），劃痕面積修復(fù)能力下降（P均<001）。加入Nec1干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)，肌管分化增多，與CoCl2組比較，CoCl2+Nec1組Myog、MEF2A蛋白表達(dá)量及S期細(xì)胞比例上調(diào)（P均<005），細(xì)胞劃痕面積恢復(fù)（P<005）。結(jié)論CoCl2模擬缺氧可抑制肌細(xì)胞增殖、分化功能，導(dǎo)致肌細(xì)胞損傷修復(fù)能力下降。Nec1可增強(qiáng)缺氧條件下肌細(xì)胞的增殖和分化能力，對肌細(xì)胞的損傷修復(fù)有保護(hù)作用，可能通過抑制程序性壞死來促進(jìn)肌細(xì)胞的損傷修復(fù)。

【關(guān)鍵詞】二氯化鈷；缺氧；C2C12；Necrostatin1；損傷修復(fù)

EffectofNec1onrepairofskeletalmusclecellinjuryundersimulatedhypoxiaZhouShanyao，ChenRui，TanXi，SheYanling，LeiSiGuangdongTraditionalMedicalandSportsInjuryRehabilitationResearchInstitute，GuangdongSecondProvincialGeneralHospital，Guangzhou510317，China

Correspondingauthor，ChenRui，Email：ruicmed@163com

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofNecrostatin1（Nec1）ontherepairofskeletalmusclecellinjuryundersimulatedhypoxiainducedbyCobaltouschloride（CoCl2）MethodsInthisstudy，mouseskeletalmuscleC2C12cellswereusedasaninvitromodel，CoCl2wasutilizedtoinducehypoxiaandNec1wasutilizedasahypoxicprotectiveagentFollowingcultureandisolationfor72h，thecellsweredividedinto4groups，whichweresupplementedwithanequalvolumeofculturemedium（controlgroup），200μMCoCl2（CoCl2group），150μMNec1（Nec1group），and200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1group），respectivelyThemorphologyofmyotubeswasobservedunderlightmicroscopeThechangesoftheexpressionlevelsofmyogenin（Myog），myocyteenhancerfactor2A（MEF2A）proteinswerequantitativelydetectedbyWesternblottingTheproportionofcellsintheSphasewasstatisticallycalculatedWoundhealingassaywasadoptedtoevaluatetheabilityofcelldamagerepairResultsCoCl2couldinducethemyoblastabnormalitiesanddecreasedthedifferentiationofmyotubesComparedwiththecontrolgroup，theexpressionlevelsofMyogandMEF2Aproteinsweresignificantlydownregulated（bothP<001），theproportionofSphasecellsandtherepairabilityweresignificantlydecreasedintheCoCl2group（bothP<001）FollowingtheNec1intervention，thecellularmorphologywasrestoredandthedifferentiationofmyotubeswasenhancedComparedwiththeCoCl2group，theexpressionlevelsofMyogandMEF2AproteinsandtheproportionofSphasecellsweresignificantlyupregulated（bothP<005），andtheareaofcellscarwassignificantlyrestored（P<005）afterthesupplementofNec1ConclusionsCoCl2simulatedhypoxiacaninhibittheproliferationanddifferentiationofmyocytes，leadingtodecreasedabilityofcellinjuryrepairNec1canenhancetheproliferationanddifferentiationofmyocytesandprotectmyocytesfrominjuryunderhypoxicconditionsandpromotetheinjuryrepairofmyocytesbysuppressingprogrammednecrosis

【Keywords】CoCl2；Hypoxia；C2C12；Necrostatin1；Injuryrepair

氧在細(xì)胞呼吸和能量代謝中起著重要的作用。臨床上，運(yùn)動(dòng)性損傷、缺血缺氧性疾病或組織炎癥性改變常伴隨氧灌注不足或攝氧障礙，低氧環(huán)境可使組織功能進(jìn)一步下降、甚至發(fā)生萎縮或變性壞死[12]。近年來，程序性壞死（Necroptosis）作為非凋亡的細(xì)胞死亡信號途徑成為缺血缺氧性損傷研究的新熱點(diǎn)，越來越多研究者發(fā)現(xiàn)，程序性壞死在多系統(tǒng)缺血缺氧性損傷后的炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[3]。相關(guān)研究表明，受體交互作用蛋白激酶1（RIP1）特異性抑制劑——壞死性凋亡抑制劑Necrostatin1（Nec1）能顯著改善缺血缺氧性損傷，對細(xì)胞、組織的增殖分化、損傷修復(fù)功能有保護(hù)作用[46]。但筆者見Nec1在骨骼肌缺氧損傷修復(fù)中作用的相關(guān)報(bào)道很少，故利用小鼠骨骼肌C2C12成肌細(xì)胞構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型，觀察缺氧對肌細(xì)胞的影響及Nec1的保護(hù)作用。

材料與方法

一、主要儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），光學(xué)電子顯微鏡（美國LifeTechnologies公司），流式細(xì)胞儀（美國BeckmanCoulter公司），電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞系購于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫，高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清、馬血清（美國Hyclone公司）。二氯化鈷（CoCl2）、Nec1（德國Sigma公司）。細(xì)胞周期檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）。肌細(xì)胞生成素（Myogenin，Myog）一抗（德國MerckMillipore公司）。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（MEF2A）一抗（美國CST公司）。Tubulin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔（美國ABclonal公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1細(xì)胞培養(yǎng)

將C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞系置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%～100%融合時(shí)吸去完全培養(yǎng)液，使用含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，隔日換液。分化72h后將細(xì)胞分為4組，分別加入等量培養(yǎng)基（Control組）、200μMCoCl2（CoCl2組）、150μMNec1（Nec1組）、200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1組）。48h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2光學(xué)顯微鏡下觀察肌管融合情況

加入CoCl2、Nec1處理48h后，在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、肌管融合情況。

3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

采用Maeker筆在培養(yǎng)板底部均勻劃線做標(biāo)記，控制細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，待細(xì)胞生長至90%時(shí)，用200μl槍頭沿標(biāo)記線垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，去除劃痕損傷后不貼壁的細(xì)胞，重新加入相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用顯微鏡拍照記錄不同時(shí)間段劃痕面積，使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)劃痕面積。

4細(xì)胞周期

用2%胰酶消化、離心、收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，制成單細(xì)胞懸液。加入70%冷乙醇500μl固定2h，用PBS洗去固定液，加入500μl碘化丙啶/核糖核酸酶A（PI/RNaseA）染色工作液，避光室溫孵育60min。應(yīng)用PI染色法流式細(xì)胞分析不同處理下的C2C12細(xì)胞周期變化。

5蛋白免疫印跡檢測

細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞組織（RIPA）裂解液，于冰上裂解30min，4℃，12000轉(zhuǎn)/分離心10min。用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白含量。取30μg蛋白，進(jìn)行電泳，再將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉1h。加入一抗于4℃孵育過夜。洗膜5次后于室溫孵育二抗。洗膜5次后，使用ECL液顯色，用天能系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。以Tubulin作為內(nèi)參，目的蛋白條帶與內(nèi)參比較作為條帶的相對表達(dá)值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS210對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同時(shí)用GraphPadPrism50進(jìn)行繪圖。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用±s表示，正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Nec1、CoCl2對C2C12細(xì)胞肌管形成的影響

實(shí)驗(yàn)中，Control組、Nec1組肌細(xì)胞分化情況良好，可見大量長條狀肌管形成。經(jīng)CoCl2處理后，分化停滯，肌管萎縮、斷裂，少見長條狀肌管形成。而加入CoCl2+Nec1處理后，可見細(xì)胞分化情況較CoCl2組改善，肌管形成增多，見圖1。

二、Nec1、CoCl2對Myog、MEF2A表達(dá)水平的影響

CoCl2處理可誘導(dǎo)肌生成、分化標(biāo)志基因Myog、MEF2A蛋白表達(dá)下降（P均<001），加入Nec1處理后，可逆轉(zhuǎn)CoCl2的抑制作用，上調(diào)Myog（P<005）及MEF2A的表達(dá)（P<0001），見圖2、表1。

三、Nec1、CoCl2對細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示，CoCl2組[（1247±106）%]和CoCl2+Nec1組[1889±352）%]S期細(xì)胞比例均較Control組[（3569±267）%]少（P均<0001），但CoCl2+Nec1組較CoCl2組多（P=0039），見圖3。

四、Nec1、CoCl2對C2C12細(xì)胞劃痕愈合的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同處理組的劃痕愈合程度不同，見圖4。隨時(shí)間推移，劃痕面積逐漸縮小，Control組、Nec1組及CoCl2+Nec1組愈合速度較快，在72h時(shí)幾乎完全愈合，而CoCl2組愈合速度相對較慢。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，對比各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間的變化差異。在0h時(shí)，各處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）；在24、48、72h時(shí)，CoCl2組細(xì)胞劃痕損傷面積均大于Control組、Nec1組（P均<0001）；而加入Nec1處理逆轉(zhuǎn)了CoCl2引起的細(xì)胞損傷，CoCl2+Nec1組劃痕損傷面積減小，劃痕愈合程度較CoCl2組高（P<0001），見表2、圖5。

討論

本研究采用CoCl2模擬低氧環(huán)境，觀察小鼠C2C12成肌細(xì)胞的變化。CoCl2是常用的缺氧模擬化合物，在組織中通過鈷離子競爭血紅蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與氧結(jié)合的能力，在細(xì)胞中通過抑制脯氨酰羥化酶的羥化作用，從而誘發(fā)一系列類似缺氧反應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化以及損傷應(yīng)激研究中被廣泛應(yīng)用[78]。

通過CoCl2模擬缺氧后，可觀察到肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常，肌細(xì)胞的分化標(biāo)志物Myog和MEF2A表達(dá)下調(diào)。Myog屬于生肌調(diào)節(jié)因子（MRF）家族成員，具有控制成肌細(xì)胞融合的起始，促使成肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)單核成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗪思±w維的作用，是肌細(xì)胞終末分化的決定因素[9]。本課題組的前期研究也顯示，MRF的表達(dá)對肌細(xì)胞的分化、融合有重要的作用[10]。Myog具有堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）結(jié)構(gòu)，MEF2的MADSbox區(qū)域可與bHLH相互作用，從而激活Myog的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。本研究結(jié)果提示，CoCl2模擬缺氧可抑制肌細(xì)胞的分化。

缺氧可使多種細(xì)胞生長停滯，并使其代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，并出現(xiàn)凋亡、壞死、自噬、程序性壞死等[78，11]。本研究結(jié)果顯示，CoCl2誘導(dǎo)可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，劃痕損傷修復(fù)能力減弱，推測缺氧對細(xì)胞增殖有抑制作用。此外，亦有文獻(xiàn)報(bào)道，短時(shí)間或低劑量的缺氧環(huán)境可激活細(xì)胞應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）等因子的表達(dá)量，減少細(xì)胞凋亡、加速細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)修復(fù)[1213]。

近年來，程序性壞死是細(xì)胞死亡領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，具有壞死的細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)和自噬的活化，主動(dòng)耗損能量，且能被一系列信號傳導(dǎo)通路高度調(diào)控[14]。有研究表明，CoCl2誘導(dǎo)缺氧能使程序性壞死活化[1516]。Nec1是程序性壞死的特異性抑制劑，文獻(xiàn)報(bào)道Nec1可改善缺血缺氧損傷，通過抑制程序性壞死對缺血缺氧模型的腦、肝、心肌組織具有保護(hù)作用，減少病理損傷，促進(jìn)組織的損傷修復(fù)，對臨床治療指導(dǎo)意義重大[14，1719]。本研究結(jié)果顯示，與CoCl2處理組相比，加入Nec1干預(yù)能使細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，Myog、MEF2A蛋白表達(dá)水平上調(diào)，S期細(xì)胞比例上升，劃痕實(shí)驗(yàn)后的損傷面積修復(fù)能力改善，說明Nec1在缺氧條件下對骨骼肌細(xì)胞增殖分化有保護(hù)作用。由此推測，Nec1可能通過抑制肌細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生，從而逆轉(zhuǎn)缺氧狀態(tài)對細(xì)胞增殖分化的損害。

綜上所述，CoCl2模擬缺氧可誘導(dǎo)肌細(xì)胞損傷，抑制其增殖、分化功能，Nec1對缺氧條件下的肌細(xì)胞損傷修復(fù)有保護(hù)作用，可能通過抑制程序性壞死來促進(jìn)肌細(xì)胞的損傷修復(fù)。然而，本研究僅驗(yàn)證了Nec1對化學(xué)誘導(dǎo)缺氧下的骨骼肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，缺乏對物理缺氧模型的研究，未來將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討其在物理缺氧的體內(nèi)外模型的作用，研究Nec1的藥理作用及機(jī)制，為肌組織缺氧損傷相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

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