盧建 王繼成 姚翠澤 張艷霞 劉玲 駱明勇 秦丹卿

【摘要】目的對34例異常血紅蛋白HbNewYork患者進(jìn)行基因診斷并分析其血液學(xué)特征。方法應(yīng)用血常規(guī)檢測和血紅蛋白電泳對所有采集的外周血標(biāo)本進(jìn)行分析，使用gapPCR、PCRRDB和DNA測序方法對所有提取的DNA標(biāo)本進(jìn)行β珠蛋白基因的鑒定。結(jié)果經(jīng)基因檢測，25例病例為單純的HbNewYork雜合子，其紅細(xì)胞參數(shù)表現(xiàn)為正常或輕度降低，血紅蛋白電泳提示439%～520%的HbK異常帶；1例為HbNewYork合并β0地中海貧血，表現(xiàn)為明顯降低的紅細(xì)胞參數(shù)和升高的HbK（918%）；8例為HbNewYork合并α地中海貧血，其血液學(xué)特征也有不同的改變。結(jié)論單純的HbNewYork雜合子無明顯的臨床表現(xiàn)，但合并其他地中海貧血時可改變其血液學(xué)特征。

【關(guān)鍵詞】HbNewYork；地中海貧血；血液學(xué)特征

MoleculardiagnosisandhematologiccharacteristicsofpatientswithabnormalhemoglobinNewYorkLuJian，WangJicheng，YaoCuize，ZhangYanxia，LiuLing，LuoMingyong，QinDanqingMedicalGeneticsCenterofGuangdongWomenandChildrenHospital，511442Guangzhou，China

Correspondingauthor，QinDanqing，Email：qindanqing1985@163com

【Abstract】ObjectiveToconductmoleculardiagnosisandinvestigatethehematologiccharacteristicsof34caseswithabnormalhemoglobinHbNewYorkMethodsThecollectedperipheralbloodsamplesweresubjecttoroutinebloodtestandhemoglobinelectrophoresisGapPCR，PCRRDBandDNAsequencingwereadoptedtoidentifytheβglobingeneoftheextractedDNAsamplesResultsGenedetectionrevealedthat25caseswereidentifiedwithheterozygoteofHbNewYorkandpresentedwithnormaloraslightdecreaseinthehemoglobinlevelHemoglobinelectrophoresisprompted439%520%ofabnormalHbKbandOnecasewasdiagnosedwithHbNewYorkcomplicatedwithβ0thalassemia，manifestedwithasignificantdecreaseinthehemoglobinlevelandanincreaseinHbK（918%）EightpatientswerediagnosedwithHbNewYorkcomplicatedwithαthalassemia，presentingwithcertainchangesinthehematologiccharacteristicsConclusionPatientswiththeheterozygoteofHbNewYorkpresentwithnosignificantclinicalsymptomsThosecomplicatedwithotherthalassemiaaremanifestedwithcertainchangesinthehematologiccharacteristics

【Keywords】HbNewYork；Thalassemia；Hematologiccharacteristics

血紅蛋白病是一類由于血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常或者合成量不足引起的遺傳性疾病，該病主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國多見于廣東、廣西和海南等南方地區(qū)[1]。血紅蛋白病可分為兩種：第一種是由α或β珠蛋白合成量不足引起的疾病稱為地中海貧血（簡稱地貧）；第二種是由珠蛋白的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起的血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的疾病稱為異常血紅蛋白。我國80年代對全國20個省市進(jìn)行了大規(guī)模血紅蛋白病的調(diào)查，顯示我國的南方為異常血紅蛋白高發(fā)區(qū)，其中HbK是廣東省第二常見的β珠蛋白鏈異常血紅蛋白病，僅次于HbE[2]。HbNewYork是由β珠蛋白鏈上的點(diǎn)突變引起的異常血紅蛋白，在血紅蛋白電泳中多見于K組，是HbK最常見的類型。HbNewYork自1967年首次被發(fā)現(xiàn)是在紐約的一個祖籍廣東的華裔美國人的家庭中，隨后陸續(xù)在中國和東南亞也被發(fā)現(xiàn)并報道[35]。但對于HbNewYork的臨床特征的分析，尤其是合并地貧時的血液學(xué)表現(xiàn)的報道還比較少。我們收集了34例基因診斷為HbNewYork的病例并對其進(jìn)行分析，報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2015年至2017年于廣東省婦幼保健院就診，血紅蛋白電泳顯示有HbK且經(jīng)基因檢測確診為HbNewYork的34例患者。所有患者均為廣東籍居民，年齡為19～48歲，平均為297歲。取其外周血用于血常規(guī)和血紅蛋白電泳分析，提取外周血DNA用于珠蛋白基因檢測。

二、方法

1血液學(xué)分析

使用EDTAK2采血管采集受檢者外周靜脈血，應(yīng)用SysmexXS1000i全自動血細(xì)胞分析儀（日本希森美康株式會社）完成包括紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白量及MCV、MCH等紅細(xì)胞指數(shù)的分析。采用全自動毛細(xì)管電泳儀（Capillar2，法國Sebia公司）進(jìn)行血紅蛋白的分析。以上實驗均按照儀器使用說明書操作。

2常規(guī)珠蛋白基因診斷

應(yīng)用廈門致善生物公司生產(chǎn)的磁珠法基因組DNA提取試劑盒和自動化儀器（LabAid820）提取所有病例的外周血基因組DNA。采用亞能生物技術(shù)有限公司（深圳）提供的α和β地貧基因檢測試劑盒（gapPCR和PCRRDB方法）對所有DNA標(biāo)本進(jìn)行地貧基因檢測。檢測范圍包括α地貧3種常見缺失類型（α37/、α42/、SEA/）和3種點(diǎn)突變類型（αQSα/、αCSα/、αWSα/）以及17種β地貧的點(diǎn)突變。

3β珠蛋白基因測序

對β珠蛋白基因（HBB）全長約2kb分成3個片段進(jìn)行引物設(shè)計和基因測序。PCR引物序列見表1。PCR擴(kuò)增體系為30μl：15μl的PremixLA，10pmol/μl的引物各2μl，4μl基因組DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃30s→60℃45s→72℃45s，35個循環(huán)，72℃延伸7min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司，使用美國ABI3100DNA測序儀雙向測序。

結(jié)果

34例患者中，25例單純的HbNewYork雜合子病例的血液學(xué)表現(xiàn)差別不大，血紅蛋白電泳提示439%～520%的HbK異常帶；1例為HbNewYork合并β0地貧，表現(xiàn)為明顯降低的紅細(xì)胞參數(shù)和升高的HbK（918%）；8例為HbNewYork合并α地貧，其血液學(xué)也有不同的改變。詳細(xì)的血常規(guī)和血紅蛋白電泳結(jié)果見圖1、表2。

二、基因檢測結(jié)果

經(jīng)常規(guī)地貧基因檢測方法（gapPCR和PCRRDB）的檢測，共發(fā)現(xiàn)5例基因型為/αα，2例基因型為α37/αα，1例基因型為αwsα/αα，以及一例β17/N。β珠蛋白基因測序發(fā)現(xiàn)34例患者均檢測到HBB：c341T>A（CD113GTG>GAG）雜合突變（見圖2A）。查詢血紅蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//globincsepsuedu/）可知此突變?yōu)镠bNewYork。此外一病例還檢測到HBB：c52A>T（CD17AAG>TAG）雜合突變（見圖2B），與以上地貧常規(guī)檢查方法檢測結(jié)果相符，為HbNewYork合并β17地貧患者。

討論

能引起珠蛋白功能改變的異常血紅蛋白包括地中海貧血樣變異、溶血性異常血紅蛋白和氧親和力異常性異常血紅蛋白病。這些異常血紅蛋白在單獨(dú)存在或復(fù)合地貧時，可表現(xiàn)為中間型或重型地貧[6]。目前常用反相高效液相色譜（RPHPLC）和

A：HBB：c341T>A突變，即HbNewYork；B：HBB：c52A>T突變，即β17/Nsebiacapillary方法進(jìn)行血紅蛋白分析并發(fā)現(xiàn)特異性的異常血紅蛋白[7]。

HbNewYork一種血紅蛋白的變異體[β113（G15）Val→Glu，GTG>GAG]，β鏈113號位的纈氨酸位于螺旋G15位，處于β鏈分子內(nèi)部，是疏水性氨基酸。被酸性氨基酸谷氨酸取代后，影響了分子內(nèi)部的疏水性，所以HbNewYork的穩(wěn)定性不如HbA，易于降解[8]。但由于α和β接觸面有3個氨基酸，接觸面比較廣，單個氨基酸變化可能不會對其穩(wěn)定性帶來明顯的影響。所以該突變位點(diǎn)并沒有影響到血紅蛋白的生物學(xué)功能。通過對我們收集的病例進(jìn)行血液學(xué)特征分析，單純HbNewYork的雜合子是無明顯的臨床癥狀的，且血液學(xué)指標(biāo)也正常，僅血紅蛋白電泳時會出現(xiàn)含量約50%的異常血紅蛋白，這與文獻(xiàn)報道的基本相同[910]，如果不進(jìn)行基因測序，就可能就會被忽略。當(dāng)HbNewYork合并α地貧時，除血紅蛋白電泳中較高比例的HbK外，其他血液學(xué)指標(biāo)與單純的α地貧也是不同的。其中合并標(biāo)準(zhǔn)型（SEA）和靜止型（37、WS）的α地貧也有不同的血液學(xué)表現(xiàn)。本文中一例HbNewYork合并β0地貧的患者，表現(xiàn)為輕度的小細(xì)胞低色素性貧血，這與Lee和Li等[1112]的病例報道中無貧血的癥狀并不相同，這可能是由于本文的病例是孕婦，存在生理性貧血的可能。

雖然HbNewYork沒有明顯的臨床表現(xiàn)，但其存在會干擾一些實驗室指標(biāo)的測定，如糖化血紅蛋白、血小板計數(shù)等[13]。而且值得注意的是，由于HbNewYork合并β地貧的血紅蛋白電泳檢測到的HbA比例大幅降低，容易引起誤診為重型β地貧。在產(chǎn)前診斷中，這類HbNewYork復(fù)合β地貧胎兒也會因為父母親輕型的β地貧表現(xiàn)，被很少關(guān)注或者忽略。因此對HbNewYork及其合并其他地貧的臨床特征的認(rèn)識有助于指導(dǎo)進(jìn)一步的分子檢測和產(chǎn)前診斷，也可以為遺傳咨詢提供重要的參考價值。當(dāng)然包括本文在內(nèi)的文獻(xiàn)報道中，HbNewYork合并其他地貧的病例還相對較少，今后我們將繼續(xù)收集更多的病例，以作更具有統(tǒng)計學(xué)意義的比較。

參考文獻(xiàn)

[1]SteinbergMH，F(xiàn)orgetBG，HiggsDR，WeatherallDJDisordersofhemoglobin：Genetics，pathophysiology，andclinicalmanagementNewYork：CambridgeUniversityPress，2009

[2]JenPCAbnormalhemoglobinsfoundinGuangdong，PRChinaHemoglobin，1987，11（6）：573579

[3]RanneyHM，JacobsAS，NagelRLHaemoglobinNewYorkNature，1967，213（5079）：876878

[4]BlackwellRQ，LiuCS，WangCLHemoglobinNewYorkinChinesesubjectsinTaiwanAmJPhysAnthropol，1971，34（3）：329334

[5]YuthavongY，RuenwongsaPKineticsofthereactionofthemaskedsulphydrylgroupsofhaemoglobinsA，EandNewYorkwithpchloromercuribenzoateBiochimBiophysActa，1973，303（1）：4451

[6]徐湘民地中海貧血預(yù)防控制操作指南北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：1113

[7]WanJH，TianPL，LuoWH，WuBY，XiongF，ZhouWJ，WeiXC，XuXMRapiddeterminationofhumanglobinchainsusingreversedphasehighperformanceliquidchromatographyJChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci，2012，901：5358

[8]曾溢滔，黃淑幀，周霞娣，陳美玨，盛敏，仇效坤，顧蘭琴，叢建平，黃英，程觀熾，金華鈞，浦權(quán)，徐鏞男，朱錫珍，李魁群，陳犇，梁晏青，王美琪，廖霞，張小梅，胡紉華，李豪德，霍建強(qiáng)，王徽信，曾毓華，丁桂仙，謝沛林，廖成玉，郎金武中國人血紅蛋白NewYork的研究遺傳學(xué)報，1982，9（2）：125134

[9]LinM，WangQ，ZhengL，HuangY，LinF，LinCP，YangLYPrevalenceandmolecularcharacterizationofabnormalhemoglobinineasternGuangdongofsouthernChinaClinGenet，2012，81（2）：165171

[10]李友瓊，黃慧嬪，陽文輝，陳治中，趙林，黃華藝，覃桂芳廣西地區(qū)血紅蛋白NewYork的血液學(xué)和分子特征中華血液學(xué)雜志，2013，34（8）：696699

[11]LeeAC，MaES，ChanAY，SzetoSC，ChanLCDoubleheterozygosityforHbNewYork[beta113GTG>GAG；VAL>GLU]andbetadegreesthalassemiamutationsmanifestsasathalassemiatraitPediatrHematolOncol，2008，25（3）：227231

[12]LiDZHemoglobinNewYorkisnotamatterinprenatalscreeninganddiagnosisforbetathalassemiaPediatrHematolOncol，2008，25（8）：769771

[13]ChuCH，LamHC，LeeJK，WangMC，LuCC，SunCC，ChuangMJCommonhemoglobinvariantsinsouthernTaiwanandtheireffectonthedeterminationofHbA1cbyionexchangehighperformanceliquidchromatographyJChinMedAssoc，2009，72（7）：362367

（收稿日期：20180108）