陳勝軍 劉先進(jìn) 楊賢慶 李來好 黃卉 李春生

摘要：【目的】優(yōu)化鮑魚內(nèi)臟多糖酶解工藝條件，為鮑魚內(nèi)臟多糖的提取和高值化利用提供技術(shù)支持。【方法】以雜交鮑內(nèi)臟為原料、多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，從6種蛋白酶中篩選出提取鮑魚內(nèi)臟多糖的適宜酶制劑，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對多糖提取率影響較大的蛋白酶作用條件進(jìn)行優(yōu)化，依據(jù)回歸分析確定其最適作用條件?！窘Y(jié)果】胰蛋白酶是提取鮑魚內(nèi)臟多糖的適宜酶制劑；各因素對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響排序?yàn)榱弦罕?pH>加酶量，料液比與pH的交互作用對多糖提取率影響顯著（P<0.05），而料液比與加酶量、pH與加酶量的交互作用對多糖提取率影響不顯著（P>0.05）。胰蛋白酶提取鮑魚內(nèi)臟多糖的最適工藝條件為：料液比1∶49（g/mL）、pH 8.6、加酶量2.1%、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度37 ℃，在此條件下，鮑魚內(nèi)臟多糖提取率為6.97%，與預(yù)測值（6.99%）接近?！窘Y(jié)論】通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的胰蛋白酶酶解工藝可有效提取鮑魚內(nèi)臟多糖，建立的回歸模型可用于實(shí)際生產(chǎn)預(yù)測。

關(guān)鍵詞： 鮑魚；內(nèi)臟；酶解法；多糖提取率；響應(yīng)面分析

中圖分類號： S986.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1389-07

0 引言

【研究意義】多糖、蛋白質(zhì)與核酸并稱為三大生命物質(zhì)（蔡孟深和李中軍，2007），其中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等作用（Zhu et al.，2010a，2010b；Li et al.，2011；鄒文文，2013；Wang et al.，2014），在功能食品和臨床醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用。我國是世界第一養(yǎng)鮑大國，養(yǎng)殖產(chǎn)量從2006年的2.16萬t快速增長至2016年的13.97萬t，近十年來的年均增長率達(dá)54.68%（農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，2017）。鮑魚內(nèi)臟占總體質(zhì)量的20%左右，有很大的開發(fā)利用空間，但目前我國對鮑魚加工副產(chǎn)物尚未充分利用，不僅造成原材料浪費(fèi)，還易引起環(huán)境污染。因此，研究鮑魚內(nèi)臟多糖的提取工藝，對提高鮑魚資源綜合利用率和鮑魚加工產(chǎn)品的附加值具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在鮑魚多糖的組成和活性功能方面，吳耀文等（2002）對雜色鮑中分離出的一種硫酸酯多糖組成進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要由半乳糖、葡萄糖和少量木糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸組成；劉春燕（2011）通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鮑魚內(nèi)臟多糖具有免疫活性；羅曉航（2012）研究發(fā)現(xiàn)鮑魚內(nèi)臟粗多糖可能具有抗氧化能力。在鮑魚多糖提取方面，殷紅玲等（2006）通過正交試驗(yàn)對酶法提取鮑魚肉中多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，木瓜蛋白酶的適宜反應(yīng)條件為溫度55 ℃、時(shí)間2 h、pH 8.0、料液比1∶40、加酶量2.0%，在此條件下多糖提取率為19.60%；余鑫（2012）研究鮑魚內(nèi)臟粗多糖提取工藝，得到最佳工藝條件為酶解時(shí)間2.5 h、料液比1∶6、加酶量2.4×104 U/g、酶解溫度55 ℃；Xu等（2016）通過酶水解、陰陽離子交換樹脂等方法提取出鮑魚內(nèi)臟多糖，結(jié)果表明這些方法均具有可行性，所得內(nèi)臟多糖純度較高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，利用響應(yīng)面法優(yōu)化鮑魚內(nèi)臟多糖提取工藝的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化鮑魚內(nèi)臟酶解工藝，以獲得最適的酶解工藝條件，為鮑魚內(nèi)臟多糖的提取和高值化利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

雜交鮑內(nèi)臟取自福建連江產(chǎn)雜交鮑，經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎混勻制成樣品，于-20 ℃冷凍保藏。堿性蛋白酶（580000 U/g）和中性蛋白酶（100 U/mg）購自廣州柏棠貿(mào)易有限公司，Alcalase蛋白酶（2.4 AU/g）、胃蛋白酶（10000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）和木瓜蛋白酶（800 U/mg）購自廣州齊云生物技術(shù)有限公司，鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：Sunrise-basic Tacan吸光酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、LFP-800T萊芙粉碎機(jī)（永康紅太陽機(jī)電有限公司）、Alpha 1-4冷凍干燥機(jī)（德國Marin Christ公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 鮑魚內(nèi)臟多糖提取工藝流程 鮑魚內(nèi)臟→凍干→粉碎過40目篩→鮑魚內(nèi)臟粉→調(diào)節(jié)料液比→調(diào)節(jié)pH→酶解預(yù)定時(shí)間→沸水滅酶10 min→冷卻，調(diào)中性→離心（4500 r/min）10 min→加上清液3倍體積的95%乙醇→醇沉過夜→離心→測多糖提取率。

1. 2. 2 最佳用酶選擇 蛋白酶由于來源及其酶切位點(diǎn)不同，因此對生物的酶解效果有所差異（黃小葳，2011）。利用不同種類的蛋白酶對鮑魚內(nèi)臟進(jìn)行酶解，酶解條件見表1，按照1.2.1方法提取分離得到多糖，以多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，選擇最佳蛋白酶。

1. 2. 3 胰蛋白酶的單因素試驗(yàn) 根據(jù)最佳用酶的試驗(yàn)結(jié)果，選用胰蛋白酶作為酶解蛋白酶，準(zhǔn)確稱取一定量的鮑魚內(nèi)臟粉，以料液比、pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和加酶量為可變因素，采用1.2.1方法提取多糖，并測定多糖含量。

1. 2. 4 鮑魚內(nèi)臟多糖酶解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，選擇對多糖提取率有顯著影響的3個(gè)因素（料液比、pH和加酶量），根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理（趙志霞等，2017），以多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化鮑魚內(nèi)臟酶解工藝。響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)如表2所示。

1. 3 多糖含量測定

采用苯酚—硫酸法測定鮑魚內(nèi)臟多糖含量（程婷婷等，2008）。

多糖提取率（%）=提取物中多糖含量（g）/原料干品質(zhì)量（g）×100

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析，Design Expert 8.0.6對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 最佳用酶篩選結(jié)果

由圖1可知，采用胰蛋白酶酶解鮑魚內(nèi)臟的多糖提取率最高，可達(dá)3.56%，而胃蛋白酶多糖提取率最低，僅有2.09%。影響提取率最重要的因素是酶的種類及提取工藝條件，不同蛋白酶在其底物的酶切位點(diǎn)不同，其具有專一性。由于酶具有專一性即只對某一特定蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行酶切，而動(dòng)物多糖大多與蛋白相連，因此為了提取多糖，必須將蛋白與多糖分離開，故酶的專一性越差多糖提取率就越高。從試驗(yàn)結(jié)果來看，選擇胰蛋白酶為最佳水解酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 料液比對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響 在酶解溫度37 ℃、pH 8.0、酶解時(shí)間3 h、加酶量2.0%的條件下，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）對酶法提取鮑魚內(nèi)臟多糖效果的影響。由圖2可看出，料液比從1∶20到1∶50遞變時(shí)，鮑魚內(nèi)臟多糖提取率逐漸增加，在1∶50時(shí)達(dá)最大值（6.46%），料液比從1∶50到1∶60遞變時(shí)，多糖提取率逐漸降低。料液比1∶40、1∶50和1∶60間的多糖提取率無顯著差異（P>0.05，下同），但與1∶20存在顯著差異（P<0.05，下同）。料液比太大或太小均會(huì)對多糖提取造成負(fù)面影響，比值太大時(shí)，體系黏度過大，流動(dòng)性較差，不利于底物與酶的充分反應(yīng)，從而對酶促反應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用；比值太小時(shí)，底物濃度和酶濃度都會(huì)被稀釋，造成酶與底物接觸的幾率降低，也不利于多糖提?。ɡ铎o等，2014）。綜合考慮，胰蛋白酶提取鮑魚內(nèi)臟多糖的適宜料液比為1∶50。

2. 2. 2 pH對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響 在酶解溫度37 ℃、料液比1∶40、酶解時(shí)間3 h、加酶量2.0%的條件下，考察pH（7.0、7.5、8.0、8.5和9.0）對酶法提取鮑魚內(nèi)臟多糖效果的影響。由圖3可看出，pH從7.0到8.5遞變時(shí)，多糖提取率逐漸增加，pH 8.5時(shí)達(dá)最大值（6.94%），pH從8.5到9.0遞變時(shí)，多糖提取率逐漸降低。pH在8.0、8.5和9.0時(shí)，多糖提取率間無顯著差異，但三者與pH 7.0和7.5的多糖提取率存在顯著差異。在酶催化過程中，pH通過影響酶活性，從而影響酶的催化速率（程婷婷等，2008）。綜合考慮，胰蛋白酶提取鮑魚內(nèi)臟多糖的最適pH為8.5。

2. 2. 3 酶解時(shí)間對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響 在酶解溫度37 ℃、料液比1∶40、pH 8.0、加酶量2.0%的條件下，考察酶解時(shí)間（1、2、3、4和5 h）對酶法提取鮑魚內(nèi)臟多糖效果的影響。由圖4可看出，酶解時(shí)間1～5 h的多糖提取率間無顯著差異；酶解時(shí)間由1 h延長至2 h時(shí)，多糖提取率逐漸增加，酶解2 h后多糖提取率反而下降。可能是由于酶解反應(yīng)2 h時(shí)多糖已最大程度溶出，隨著酶解時(shí)間的延長，某些小分子量的多糖附著在大分子蛋白上，在醇沉過程中被除去，同時(shí)，酶解時(shí)間過長，酶解液易變質(zhì)，導(dǎo)致多糖提取率下降。因此，確定2 h是最佳酶解時(shí)間。

2. 2. 4 酶解溫度對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響 在酶解時(shí)間3 h、料液比1∶40、pH 8.0、加酶量2.0%的條件下，考察酶解溫度（27、32、37、42和47 ℃）對酶法提取鮑魚內(nèi)臟多糖效果的影響。由圖5可看出，酶解溫度為27～47 ℃的多糖提取率間無顯著差異；酶解溫度由27 ℃升至37 ℃時(shí)，多糖提取率逐漸增加，在37 ℃時(shí)達(dá)最大值（6.76%），酶解溫度從37 ℃升至47 ℃時(shí)，多糖提取率逐漸降低。隨著酶解溫度的逐漸升高，酶活力增強(qiáng)，但超過蛋白酶的最適溫度后，酶蛋白變性效應(yīng)會(huì)抵消其反應(yīng)速率，從而使酶活力減弱，提取率降低。因此，胰蛋白酶酶解的最適溫度為37 ℃。

2. 2. 5 加酶量對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響 在酶解時(shí)間3 h、料液比1∶40、pH 8.0、酶解溫度37 ℃的條件下，考察加酶量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%）對酶法提取鮑魚內(nèi)臟多糖效果的影響。由圖6可看出，加酶量在1.0%～2.0%范圍內(nèi)，多糖提取率逐漸增加，2.0%時(shí)達(dá)最大值（6.73%），加酶量在2.0%～3.0%范圍內(nèi)，多糖提取率逐漸降低。加酶量從1.5%增加至3.0%的多糖提取率間無顯著差異，但2.0%加酶量與1.0%加酶量存在顯著差異。在酶與底物飽和之前，加酶量越大，反應(yīng)越充分，多糖提取率越高；當(dāng)加酶量飽和后，蛋白與酶完全結(jié)合，若繼續(xù)添加酶制劑，不僅無法提高酶解效果，還會(huì)增加蛋白雜質(zhì)含量，同時(shí)一些小分子多糖會(huì)隨著醇沉被除去，導(dǎo)致多糖提取率下降。綜合考慮，胰蛋白酶提取鮑魚多糖的最適加酶量為2.0%。

2. 3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2. 3. 1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 利用SPSS 20.0對胰蛋白酶的單因素試驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，從圖2～圖6可發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間和酶解溫度對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率無顯著影響，而料液比、pH和加酶量對多糖提取率有顯著影響。因此，選取料液比（A）、pH（B）和加酶量（C）3個(gè)因素為自變量，以多糖提取率（Y）為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

2. 3. 2 回歸方程及參數(shù)分析 通過Design Expert 8.0.6對表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到二次回歸方程Y=6.980-0.066A+0.056B+0.038C+0.110AB-（2.500E-0.030）AC+0.052BC-0.230A2-0.180B2-0.230

C2。

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表4）表明，該回歸模型P=0.0011<0.01，表明二次方程擬合極顯著，失擬項(xiàng)P=0.6159>0.05不顯著，表明該模型準(zhǔn)確。R2=0.9468，表明方程能很好地代表各因素與多糖提取率之間的關(guān)系（王姣等，2015），可通過方程確定胰蛋白酶酶解鮑魚內(nèi)臟多糖的最佳工藝。根據(jù)F大小，各因素對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響順序?yàn)锳>B>C。根據(jù)P變化可知，A2、B2和C2對多糖提取率影響極顯著（P<0.01），AB對多糖提取率影響顯著，A、B和C不顯著，與單因素試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2. 3. 3 響應(yīng)面交互作用分析 采用Design Expert 8.0.6對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，繪制等高線和響應(yīng)面（圖7）。從擬合的響應(yīng)面圖可直觀看出各因素間的交互作用，曲面圖的陡峭程度代表各因素對多糖提取率的影響程度。響應(yīng)面坡度越陡，說明該因素影響較大。從圖7可看出，AB響應(yīng)面坡度較陡，而BC、AC響應(yīng)面坡度較平緩，說明料液比與pH的交互作用對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率影響顯著，而料液比與加酶量、pH與加酶量的交互作用對多糖提取率影響不顯著；料液比響應(yīng)面的陡峭程度大于pH和加酶量，pH響應(yīng)面的陡峭程度大于加酶量，說明料液比對多糖提取率的影響大于pH和加酶量，pH對多糖提取率的影響大于加酶量，與表4的方差分析結(jié)果相符合。

2. 3. 4 工藝優(yōu)化及模型驗(yàn)證 采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行分析處理，得到胰蛋白酶酶解鮑魚內(nèi)臟多糖的最優(yōu)條件為：料液比1∶48.9、pH 8.57、加酶量2.05%，在此條件下鮑魚內(nèi)臟多糖提取率為6.99%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，并考慮實(shí)際操作，將工藝參數(shù)優(yōu)化為料液比1∶49、pH 8.6、加酶量2.1%，以此條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到多糖提取率為6.97%，與預(yù)測值接近，表明建立的模型可用于預(yù)測實(shí)際值。

3 討論

多糖的提取方法通常有熱水浸提法、酸堿提取法、酶法提取和儀器輔助提取法等。由于熱水浸提法提取率低，酸堿提取法具有局限性，會(huì)破壞多糖活性，因此現(xiàn)階段主要采用酶法提取和儀器輔助提取法。程婷婷等（2008）通過單因素和正交試驗(yàn)得到堿性蛋白酶提取鮑魚內(nèi)臟多糖的最佳提取工藝：酶解溫度45 ℃、料液比1∶45、pH 10、加酶量2%、酶解時(shí)間3 h，在此條件下多糖提取率為6.5%；羅曉航等（2012）利用儀器輔助提取法，將樣品用高壓脈沖電場進(jìn)行前處理，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化鮑魚內(nèi)臟多糖提取工藝條件，多糖含量可達(dá)21.73%。本研究以雜交鮑內(nèi)臟為原料，通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶6種酶提取鮑魚內(nèi)臟多糖，以多糖提取率為考察指標(biāo)，最終得出胰蛋白酶的鮑魚內(nèi)臟多糖提取率最高。這是由于不同種類蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，可能鮑魚內(nèi)臟糖蛋白的胰蛋白酶酶切位點(diǎn)較多，使其內(nèi)臟多糖可更多的被切除出來，從而提高多糖提取率。因此確定胰蛋白酶作為提取鮑魚內(nèi)臟多糖的適宜酶制劑。通過響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取條件，在料液比1∶49、pH 8.6、加酶量2.1%的條件下得到鮑魚內(nèi)臟多糖提取率為6.97%，較酶篩選時(shí)的3.56%高，是由于篩選試驗(yàn)只是針對酶的最適環(huán)境，而提取過程是酶與底物的共同作用，因此其最適條件有所不同；響應(yīng)面優(yōu)化的工藝條件即為酶與底物的最佳工藝條件，因此其提取率會(huì)增加。本研究獲得的鮑魚內(nèi)臟多糖提取率與程婷婷等（2008）獲得的多糖提取率6.5%相近，可能由于均采用酶法提??；相比于羅曉航等（2012）的儀器輔助提取法，單一酶提取法的多糖提取率較低，下一步可將儀器輔助與復(fù)合酶法相結(jié)合進(jìn)行多糖提取工藝研究，如微波輔助復(fù)合酶法等。

殷紅玲等（2006）通過正交試驗(yàn)得到木瓜蛋白酶提取鮑魚肉中多糖的最佳提取工藝條件，但由于正交的局限性并不能得到理論的最優(yōu)值。響應(yīng)面可反映出因素間的交互作用并找出最優(yōu)點(diǎn)（何念武等，2016），本研究通過響應(yīng)面分析，得到單因素及兩兩因素間交互作用對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響，其中料液比與pH的交互作用影響顯著，而料液比與加酶量、pH與加酶量的交互作用影響不顯著；料液比對多糖提取率的影響大于pH和加酶量，pH對多糖提取率的影響大于加酶量。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的胰蛋白酶酶解工藝可有效提取鮑魚內(nèi)臟多糖，建立的回歸模型可用于實(shí)際生產(chǎn)預(yù)測。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）