王思儀　黎潔瑤　于濤　許稷豪　陳其奎　夏忠勝

【摘要】 目的 觀察丁酸對(duì)高葡萄糖誘導(dǎo)下結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460增殖的影響，探討高遷移率族蛋白1（HMGB1）/晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）通路在其中的作用。方法 用33 mmol/L D-葡萄糖誘導(dǎo)正常人結(jié)腸細(xì)胞系NCM460，并予4 mmol/L丁酸干預(yù)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法、細(xì)胞免疫熒光及ELISA檢測(cè)細(xì)胞HMGB1和RAGE的表達(dá)情況。測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)量和細(xì)胞增殖的情況。過(guò)表達(dá)及下調(diào)NCM460的HMGB1，觀察HMGB1對(duì)細(xì)胞表達(dá)RAGE及增殖的調(diào)控作用。結(jié)果 高糖誘導(dǎo)下，NCM460細(xì)胞增殖能力增高，HMGB1和RAGE的表達(dá)升高，細(xì)胞上清中HMGB1的含量亦增加（P均<0.001）。過(guò)表達(dá)HMGB1可上調(diào)RAGE的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)丁酸對(duì)異常增殖的抑制作用，而下調(diào)HMGB1表達(dá)可抑制RAGE的表達(dá)，抑制異常增殖（P均<0.05）。結(jié)論 高糖誘導(dǎo)下的NCM460存在增殖異常，HMGB1和RAGE表達(dá)增加。丁酸通過(guò)下調(diào)HMGB1/RAGE通路，抑制高糖誘導(dǎo)下NCM460的異常增殖。

【關(guān)鍵詞】 丁酸；高糖；NCM460細(xì)胞；增殖；高遷移率族蛋白B1

【Abstract】 Objective To observe the effect of butyrate on the proliferation of colonic epithelial NCM460 cells induced by high glucose and to explore the role of high-mobility group box 1 protein （HMGB1） /the receptor for advanced glycation end products （RAGE） pathway during this process. Methods The normal human colonic cell lines NCM460 were induced by D-glucose at a dosage of 33 mmol/L and treated with butyrate at a dose of 4 mmol/L. The expression levels of HMGB1 and RAGE in the treated NCM460 cells were quantitatively measured by real-time fluorescent quantitative PCR （RT-qPCR），western blot analysis， immunofluorescent staining. The expression level of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） was measured and the cell proliferation was investigated. The level of HMGB1 was over-expressed and down-regulated in NCM460 cells. The effect of HMGB1 upon the expression level of RAGE and the proliferation of NCM460 cells was assessed. Results Under high-glucose induction， the proliferation of NCM460 cells was accelerated， the expression levels of HMGB1 and RAGE were significantly up-regulated and the content of HMGB1 was considerably elevated in the NCM460 cells （all P

【Key words】 Butyrate； High glucose； NCM460 cell； Proliferation； High-mobility group box 1 protein

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展及人們生活習(xí)慣的改變，糖尿病與結(jié)腸癌的發(fā)病率日益升高。大量研究表明糖尿病增加結(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但其機(jī)制尚未明確[1]。有研究提示糖尿病狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞存在異常增殖，這可能與增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2]。前期研究顯示晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）在糖尿病并發(fā)癥中起著重要作用，RAGE及其配體高遷移率族蛋白B1（HMGBl）可能參與了增加糖尿病患者結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分子機(jī)制[3-5]。有研究表明2型糖尿病患者外周血HMGB1的水平高于非糖尿病人群[6-7]。HMGB1與RAGE 結(jié)合，激活多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)CyclinD1基因轉(zhuǎn)錄，加速細(xì)胞G期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]。丁酸是一種短鏈脂肪酸，糖尿病小鼠腸道菌群豐度分析顯示產(chǎn)丁酸菌明顯下降[9]。有研究表明丁酸可以抑制多種結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖[10]。但目前有關(guān)高糖誘導(dǎo)下丁酸對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖的影響尚未明確。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者擬研究高糖誘導(dǎo)及丁酸處理對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460的增殖、HMGB1和RAGE蛋白表達(dá)的影響，探討丁酸對(duì)高糖誘導(dǎo)下NCM460異常增殖的調(diào)控作用及機(jī)制，為研究糖尿病與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供新思路。

材料與方法

一、細(xì) 胞

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460購(gòu)自INCell公司；培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中（Gibco公司，美國(guó)）。在37℃、5% 二氧化碳飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。

二、主要試劑

丁酸（Sigma公司，美國(guó)），TotalRNAKit（Invitrogen公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒RTreagentkit（Takara公司，日本），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce 公司，美國(guó)），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 MTS（Sigma公司，美國(guó)），人HMGB1的ELISA 試劑盒（北京欣博盛生物科技有限公司）。 β-actin單克隆抗體（Epitomics公司，美國(guó)）， HMGB1多克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)），RAGE多克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）多克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)），羊抗兔二抗（KPL公司，美國(guó)）。小干擾RNA（siRNA）-HMGB1 和siRNA-NC 陰性對(duì)照、過(guò)表達(dá)pcDNA3.1-HMGB1真核表達(dá)質(zhì)粒及其陰性對(duì)照pcDNA3.1-NC由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)及合成，LipofectamineTM 2000 購(gòu)于Invitrogen 公司。

三、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組

復(fù)蘇NCM460，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），傳代24 h后，于細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入藥物干預(yù)，并分為5組：5 mmol/L葡萄糖（陰性對(duì)照組，NG組），33 mmol/L葡萄糖（高糖組，HG組），33 mmol/L甘露醇（滲透壓對(duì)照組，MNG組），5 mmol/L葡萄糖及4 mmol/L丁酸（NG-Bu組），33 mmol/L葡萄糖及4 mmol/L丁酸（HG-Bu組）。每日換液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.總RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR （QPCR）反應(yīng)

收集上述各組細(xì)胞，用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度及純度后合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行QPCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后得到各個(gè)樣本和內(nèi)參β-actin的Ct值，以目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值（RQ值），即為RNA的相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

3.蛋白免疫印跡法

細(xì)胞裂解：分別收集上述各組加藥干預(yù)后的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，于冰上充分裂解細(xì)胞30 min，離心后獲取蛋白上清，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜在5%脫脂奶粉及室溫環(huán)境下封閉1 h，加一抗于4 ℃過(guò)夜，接著加用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫溫育2 h。用ECL法檢測(cè)結(jié)合的目的條帶。用圖像分析軟件AlphaImager 2200測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度。

4.ELISA檢測(cè)上清

按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1的含量。所有樣品設(shè)立復(fù)孔，并在同一批次內(nèi)檢測(cè)。

5.MTS實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCM460

細(xì)胞密度調(diào)整為1×104/L，接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)按分組給予不同的處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 。然后每孔加入10 μl 的MTS溶液，繼續(xù)孵育4 h， 在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（A），用吸光度表示細(xì)胞的增殖活性。

6.細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記

將細(xì)胞置于24孔板爬片后，用4%多聚甲醛固定，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉，加入相應(yīng)一抗后于4 ℃孵育過(guò)夜。第2日，加入熒光二抗，室溫避光孵1 h，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細(xì)胞核后，放熒光淬滅劑封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。

7.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將NCM460接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到50% ～60%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)用無(wú)血清培養(yǎng)基完成轉(zhuǎn)染。分組如下： 轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列siRNA（siNC組）和干擾組（siHMGB1組），轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HMGB1（plaHMGB1組）及其陰性對(duì)照pcDNA3.1-NC（plaNC組），轉(zhuǎn)染6 h后換含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用±s表示，2組間比較用t檢驗(yàn)；多組間比較用方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后再采用LSD-t法行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高糖誘導(dǎo)及丁酸干預(yù)對(duì)NCM460細(xì)胞增殖的影響

MTS法檢測(cè)表明，增殖活性在各組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.61，P與NG組比較，*為P<0.001；與HG組比較，&為P=0.001

二、高糖誘導(dǎo)下NCM460的HMGB1和RAGE表達(dá)增加

各指標(biāo)各組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HMGB1 mRNA的F= 68.17、P<0.001，圖2B、C）。

三、丁酸下調(diào)高糖誘導(dǎo)下NCM460的HMGB1和RAGE的表達(dá)

HG-Bu組中HMGB1的mRNA表達(dá)量為0.270±0.051，比無(wú)丁酸處理的HG組的HMGB1表達(dá)量1.024±0.082低（t=7.719，P<0.001，圖3B、C）。

四、高糖誘導(dǎo)及丁酸干預(yù)對(duì)HMGB1在細(xì)胞內(nèi)外表達(dá)分布的影響

在NG及MNG組，HMGB1主要在NCM460的胞核表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈弱陽(yáng)性紅色熒光染色（圖4A、B），HG組NCM460胞質(zhì)紅色熒光染色較NG及MNG組強(qiáng)（圖4C）；在高糖誘導(dǎo)同時(shí)加入丁酸干預(yù)32 h后NCM460胞質(zhì)的熒光染色較未予丁酸處理弱（圖4D），42 h后NCM460胞質(zhì)的熒光染色進(jìn)一步減弱（圖4E）。

五、高糖誘導(dǎo)及丁酸干預(yù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1水平的影響

HMGB1水平在各組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 31.79，P與NG組比較， *為P<0.05；與HG組比較，&為P<0.05

六、HMGB1調(diào)控RAGE的表達(dá)及NCM460的細(xì)胞增殖

siRNA轉(zhuǎn)染后，siHMGB1組的HMGB1的mRNA及蛋白表達(dá)水平分別為0.246±0.030及（0.147±0.026）ng/ml，較siNC組的1.054±0.060及（0.573±0.050）ng/ml低（分別為t=12.080、P<0.001，圖6D～F）。以上結(jié)果表明siRNA有效干擾了NCM460表達(dá)HMGB1，而HMGB1重組質(zhì)粒有效上調(diào)NCM460中HMGB1的表達(dá)。

進(jìn)一步觀察調(diào)控HMGB1表達(dá)后，細(xì)胞RAGE表達(dá)及細(xì)胞增殖的改變情況，結(jié)果顯示，與siNC組的RAGE表達(dá)量1.158±0.080和PCNA表達(dá)量0.914±0.070相比，siHMGB1組的0.748±0.069和0.644±0.073均較低（分別為t=3.894、P=0.005，t=2.669、P=0.028，圖6G、H）。

除了高糖誘導(dǎo)外，還同時(shí)用丁酸干預(yù)plaNC組和plaHMGB1組（高糖誘導(dǎo)無(wú)丁酸處理為對(duì)照），各指標(biāo)各組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（RAGE的F=9.507、P=0.003，PCNA的F=10.880、P=0.002），其中plaNC組的RAGE和PCNA的蛋白表達(dá)水平（0.632±0.062）ng/ml及（0.618±0.060）ng/ml較對(duì)照組的（1.189±0.123）ng/ml及（0.942±0.065）ng/ml低（RAGE的LSD-t= 3.417、P=0.007，PCNA的LSD-t= 3.232、P=0.007，圖6I～K）。而HMGB1上調(diào)后的plaHMGB1組，其細(xì)胞RAGE和PCNA的的蛋白表達(dá)水平（1.295±0.145）ng/ml及（1.067±0.083）ng/ml與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（RAGE的LSD-t= 0.650、P=0.529，PCNA的LSD-t= 1.253、P=0.235，圖6I～K）。說(shuō)明上調(diào)NCM460的HMGB1表達(dá)水平后，丁酸對(duì)高糖誘導(dǎo)下表達(dá)增加的RAGE蛋白及細(xì)胞異常增殖的抑制作用減弱。

討 論

探討丁酸是否可以改善高糖誘導(dǎo)下結(jié)腸上皮細(xì)胞的異常增殖，可以為降低糖尿病患者的結(jié)腸癌發(fā)病率提供新思路。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者證明了丁酸通過(guò)下調(diào)HMGB1和RAGE來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)下結(jié)腸上皮細(xì)胞的異常增殖，提示丁酸及其下游分子HMGB1在糖尿病結(jié)直腸癌的預(yù)防控制中可能是至關(guān)重要的。

在本研究中，加入高糖培養(yǎng)基后的NCM460細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（圖1）；同時(shí)，NCM460的HMGB1和RAGE表達(dá)量升高（圖2）。在高糖誘導(dǎo)下的NCM460的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中，HMGB1的表達(dá)均升高（圖4、5）。有研究表明，在核內(nèi)表達(dá)的HMGB1可以從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步分泌至細(xì)胞外基質(zhì)作為信號(hào)分子發(fā)揮功能[11-13]。本研究顯示高糖誘導(dǎo)下NCM460內(nèi)存在HMGB1的易位，可能與其參與高糖誘導(dǎo)下NCM460細(xì)胞的異常增殖的相關(guān)機(jī)制有關(guān)。

進(jìn)一步行過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)HMGB1的研究，結(jié)果顯示，NCM460細(xì)胞增殖能力與HMGB1和RAGE表達(dá)水平相一致（圖6），提示HMGB1和RAGE可影響NCM460的細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明高糖可能刺激HMGB1和RAGE的表達(dá)，同時(shí)促使HMGB1從細(xì)胞核分泌到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)與RAGE結(jié)合， 而HMGB1和RAGE的結(jié)合可能引起

A～C：轉(zhuǎn)染后，HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，與另一組比較，*為P腸上皮細(xì)胞的異常增殖。根據(jù)以往的研究結(jié)果，Wnt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)正常的腸上皮細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用[14]。有研究者揭示了HMGB1/RAGE通路能調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)下結(jié)腸上皮細(xì)胞的異常增殖與HMGB1和RAGE升高有關(guān)。

丁酸可通過(guò)抑制HMGB1蛋白減弱心肌缺血時(shí)的肺損傷或炎癥反應(yīng)，但其中機(jī)制尚未明確[16-17]。本研究顯示丁酸可以下調(diào)高糖誘導(dǎo)下NCM460的HMGB1和RAGE的表達(dá)，同時(shí)降低高糖誘導(dǎo)下HMGB1在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞培養(yǎng)上清的表達(dá)，并且抑制NCM460細(xì)胞的異常增殖。這提示丁酸可能通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)而抑制高糖誘導(dǎo)下腸上皮細(xì)胞的異常增殖。另外，本研究顯示丁酸只有在高糖誘導(dǎo)下才抑制NCM460細(xì)胞的增殖，而不影響正常狀態(tài)下的細(xì)胞增殖。丁酸如何影響細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制是復(fù)雜的。有研究顯示，丁酸涉及許多復(fù)雜的分子機(jī)制[18-19]。根據(jù)本研究與以往的研究結(jié)果，筆者推測(cè)丁酸可能對(duì)正常腸上皮細(xì)胞和高糖誘導(dǎo)下腸上皮細(xì)胞的增殖調(diào)控具有不同的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)下NCM460的HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)增加，且與異常的增殖相關(guān)，而丁酸可以抑制HMGB1的表達(dá)，進(jìn)而改善NMC460的異常增殖，這為研究糖尿病結(jié)腸癌的發(fā)生提供了新思路。但丁酸調(diào)控腸上皮細(xì)胞增殖可能還通過(guò)其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)， 其完整的分子機(jī)制與涉及的信號(hào)通路還有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-01-22）

（本文編輯：洪悅民）