郭思遠(yuǎn) 馬寶偉 吳曉毅 李佳 高偉 黃璐琦

摘要 目的：測(cè)定雷公藤屬植物葉片中5種萜類(lèi)成分的含量并比較差異，研究3個(gè)物種間的化學(xué)親緣關(guān)系。方法：采用HPLC法測(cè)定28批雷公藤屬植物葉片中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚新內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素5個(gè)成分的含量，并進(jìn)行方差分析和聚類(lèi)分析。結(jié)果：雷公藤屬植物葉片中，雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚新內(nèi)酯含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。運(yùn)用系統(tǒng)聚類(lèi)將28批雷公藤屬植物聚為4類(lèi)：第I類(lèi)為東北雷公藤和昆明山海棠；第II類(lèi)為雷公藤；第III類(lèi)為雷公藤；第IV類(lèi)為雷公藤和昆明山海棠。結(jié)論：雷公藤屬植物葉片中部分萜類(lèi)成分含量差異明顯。東北雷公藤與雷公藤化學(xué)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；昆明山海棠混在2者之間，與2者無(wú)明顯區(qū)分。

關(guān)鍵詞 雷公藤屬；萜類(lèi)成分；含量測(cè)定；化學(xué)分類(lèi)

Abstract Objective：To study the relative relationship among the three species of Tripterygium genus by measuring the contents of 5 terpenoid compositions in plant leaves of Tripterygium genus and comparing the differences.Methods：HPLC was used to measure the 5 composition contents including Triptolide，Triptonide，Neotriptophenolide，Triptophenolide and Tripterine in 28 batches of plant leaves of Triptergium genus.ANOVA and cluster analysis were also performed to verify the results.Results：There were significant differences among the contents of Triptolide，Triptophenolide and Tripterine in the plant leaves of Triptergium genus （P<0.05）； There was no significant difference between Triptonide and Neotriptophenolide.Hierarchical clustering was used to divide the 28 batches of plants of Triptergium genus into 4 kinds：I：Tripterygium regelii Sprague et Takeda and Tripterygium hypoglaucum； II：Tripterygium； III：Tripterygium； IV：Tripterygium and Tripterygium hypoglaucum.Conclusion：The differences of some contents of terpenoid compositions in plant leaves of Tripterygium genus were significant.The relative relationship of Tripterygium regelii Sprague et Takeda and Tripterygium was distant； Tripterygium hypoglaucum was between the two，which had no significant difference.

Key Words Tripterygium genus； Terpenoid composition； Content determination； Chemotaxonomy

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.002

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、東北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）和昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.）3者均屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物。雷公藤為傳統(tǒng)中藥，又名黃藤、黃臘藤、斷腸草等[1]。藥理研究顯示，其有較好的抑制免疫、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等作用[2]，臨床上主要用于腎病綜合征、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病的治療[3]。目前，雷公藤和昆明山海棠可作為藥用植物，而東北雷公藤尚無(wú)用藥歷史[4]。

文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]顯示，綜合形態(tài)特征、生物特性和地理分布分析，認(rèn)為雷公藤和昆明山海棠應(yīng)劃分為同一物種的2個(gè)類(lèi)型，將分布于浙江和福建等海拔300～500 m以上的物種劃分為雷公藤種內(nèi)的一個(gè)新變形，即中間型雷公藤[5]。有文獻(xiàn)通過(guò)RAPD分子標(biāo)記方法研究3者遺傳關(guān)系和遺傳多樣性，結(jié)果顯示東北雷公藤明顯與其他種有顯著地遺傳差異可作為一個(gè)獨(dú)立物種，而雷公藤與昆明山海棠之間存在大量的中間類(lèi)型，中間類(lèi)型連接了這2個(gè)種，建議將2個(gè)種合并。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤中含有二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、倍半萜類(lèi)等活性成分[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以雷公藤的萜類(lèi)活性成分：雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚新內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素為指標(biāo)，對(duì)不同產(chǎn)地的雷公藤葉片、東北雷公藤葉片和昆明山海棠葉片進(jìn)行含量測(cè)定，并參照藥用植物化學(xué)分類(lèi)研究方法[8]對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，為進(jìn)一步研究3者萜類(lèi)含量差異和物種分類(lèi)提供化學(xué)角度支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent 1200，安捷倫科技有限公司），冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-2LDplus，德國(guó)格馬有限責(zé)任公司），混合球磨儀（MM400，德國(guó)RETSCH公司），循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（SB-1100，上海愛(ài)朗儀器有限公司），低速臺(tái)式離心機(jī)（SIGMA 1-14，德國(guó)Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司）。

1.2 試劑 雷公藤甲素（成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)MUST-14092510），雷公藤內(nèi)酯酮（成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)MUST-14111115），雷酚新內(nèi)酯（藥渡經(jīng)緯信息科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)YD0000883-170220），雷酚內(nèi)酯（上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)Y25A3S1），雷公藤紅素（成都普思生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)R0130198）；上述對(duì)照品HPLC純度≥98%。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical），甲醇（分析純，北京化工廠生產(chǎn)），磷酸（色譜純，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)），DMSO（純度>99.5%，SIGMA-ALORICH中國(guó)公司生產(chǎn)），娃哈哈純凈水（純化水，娃哈哈宏振飲料有限公司生產(chǎn)）。

1.3 分析樣品 本實(shí)驗(yàn)所用雷公藤屬植物葉片由本課題組野外采集，其基原植物經(jīng)鑒定為雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、東北雷公藤（Tripterygium regelii Sprague et Takeda）、昆明山海棠（Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.）。3者取其葉，在-80 ℃冰箱中保存，再于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），洗脫梯度（0～12 min，38%A；12～25 min，38%～60%A；25～30 min，60%～65%A；30～35 min，65%A；35～48 min，65%～85%A；48～52 min，85%A；52～54 min，85%～83%A，54～65 min，83%A）；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取雷公藤甲素對(duì)照品2.38 mg、雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)照品1.44 mg、雷酚新內(nèi)酯1.53 mg、雷酚內(nèi)酯1.67 mg，于2 mL容量瓶中，用50%DMSO甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻即得，含雷公藤甲素對(duì)照品1 190 μg/mL、雷公藤內(nèi)酯酮對(duì)照品720 μg/mL、雷芬新內(nèi)酯對(duì)照品765 μg/mL、雷酚內(nèi)酯對(duì)照品835 μg/mL、雷公藤紅素對(duì)照品930 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。進(jìn)樣10 μL。對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取昆明山海棠、雷公藤、東北雷公藤干燥葉片適量。取昆明山海棠、雷公藤樣品于2 mL離心管中，混合球磨儀粉碎2 min，加入10倍量體積（w/v）80%甲醇水溶液，超聲提取2 h，搖勻，離心10 min（14 000 r/min），上清液離心5 min（14 000 r/min），上清液微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，即得；取東北雷公藤樣品研成粉末于15 mL離心管中，加入10倍量體積（w/v）80%甲醇水溶液，超聲提取2 h，抽濾，濃縮，用80%甲醇水溶液定容至2 mL，離心10 min（14 000 r/min），上清液離心5 min（14 000 r/min），上清液微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，即得。進(jìn)樣15 μL。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用50%DMSO甲醇溶液溶解逐漸稀釋配制成5個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，用“2.1項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，回歸方程及線性關(guān)系。見(jiàn)表1。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果 按2.3項(xiàng)下的制備方法制備供試溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。見(jiàn)表2。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)雷公藤屬3個(gè)物種化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，不同物種間雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同物種間雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚新內(nèi)酯含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2。

2.7 聚類(lèi)分析 以雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚新內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素五種化學(xué)指標(biāo)作為聚類(lèi)指標(biāo)，以各產(chǎn)區(qū)樣品各指標(biāo)作為聚類(lèi)數(shù)據(jù)，采用系統(tǒng)聚類(lèi)法對(duì)不同樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，樣品可被聚為四類(lèi)，雷公藤74、雷公藤75、雷公藤76、雷公藤77被聚為一類(lèi)，雷公藤68a、雷公藤78、雷公藤79、雷公藤80和雷公藤81被聚為一類(lèi)，昆明山海棠1、雷公藤69、雷公藤70a、雷公藤72被聚為一類(lèi)；東北雷公藤和昆明山海棠2、3、4、5被聚為另一類(lèi)?？梢?jiàn)，東北雷公藤樣品可明顯與雷公藤樣品區(qū)分，2者萜類(lèi)成分整體含量有較大差異；而昆明山海棠樣品混在2者之間不能區(qū)分。此外，雷公藤樣品不能聚為一類(lèi)，說(shuō)明不同雷公藤樣品之間萜類(lèi)成分含量有差異，樣品質(zhì)量的穩(wěn)定性不如東北雷公藤。雷公藤74、75、76、77與東北雷公藤樣品可聚為一大類(lèi)，這可能與其所處海拔與采收時(shí)間有關(guān)，使其萜類(lèi)含量與東北雷公藤接近。

3 討論

3.1 提取方法及色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)在選擇提取方法時(shí)，參考了不同文獻(xiàn)[9-12]，比較了浸提法、加熱回流法、煎煮法和超聲提取法，綜合提取時(shí)間，提取效率考慮，最終選擇了超聲提取法。

在確定色譜條件時(shí)，參考了不同的文獻(xiàn)[13-16]，比較了0.05%磷酸水溶液、0.05%乙酸水溶液、與0.05%磷酸水溶液相同pH值的乙酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，比較了流速為1 mL/min和0.8 mL/min時(shí)的分離效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以0.05%磷酸水溶液為水相，流速為0.8 mL/min時(shí)，分離效果較好且基線相對(duì)平坦。

3.2 統(tǒng)計(jì)分析雷公藤屬植物的差異 雷公藤屬3個(gè)物種的萜類(lèi)含量測(cè)定結(jié)果顯示，雷公藤與昆明山海棠中的雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯酮含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而雷酚新內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。雷公藤與東北雷公藤中的雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚新內(nèi)酯含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。東北雷公藤與昆明山海棠中的雷公藤甲素和雷酚內(nèi)酯含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚新內(nèi)酯和雷公藤紅素含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3者比較，雷公藤、東北雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚新內(nèi)酯含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其中，雷公藤中雷公藤甲素、雷酚新內(nèi)酯和雷公藤紅素的含量在3者中最高；東北雷公藤中雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚內(nèi)酯的含量在3者中最高，而雷公藤甲素的含量在3者中最低；昆明山海棠中雷公藤內(nèi)酯酮、雷酚新內(nèi)酯、雷酚內(nèi)酯和雷公藤紅素的含量在3者中均最低。

3.3 雷公藤屬植物分類(lèi)學(xué)爭(zhēng)議 雷公藤屬植物在分類(lèi)學(xué)上一直存在爭(zhēng)議。在《中國(guó)植物志》中，雷公藤屬植物分為了雷公藤、東北雷公藤和昆明山海棠3個(gè)種。然而在隨后出版的《中國(guó)植物志》中，雷公藤屬植物的3個(gè)種均被命名為雷公藤。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，從遺傳分類(lèi)角度分析，雷公藤與昆明山海棠之間存在大量的中間類(lèi)型，使種間界限模糊，而東北雷公藤可作為一個(gè)獨(dú)立的物種。有定量分析表明[13]，雷公藤和昆明山海棠中19種化合物的含量存在顯著性差異。但是，對(duì)不同種群和個(gè)體的雷公藤屬植物進(jìn)行雷公藤甲素含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)東北雷公藤中雷公藤甲素含量很低，而雷公藤和昆明山海棠中雷公藤甲素含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）[17]。此外，還有文獻(xiàn)指出[4]，東北雷公藤和昆明山海棠中11個(gè)化學(xué)成分的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。本實(shí)驗(yàn)參照藥用植物化學(xué)分類(lèi)研究方法，基于萜類(lèi)成分對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)東北雷公藤與雷公藤可明顯區(qū)分，2者化學(xué)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而昆明山海棠混在2者之間，與2者無(wú)明顯區(qū)分。

參考文獻(xiàn)

[1]楊芳.雷公藤的研究進(jìn)展[J].第一軍醫(yī)大學(xué)分校學(xué)報(bào)，2003，26（2）：159-160.

[2]張倩，彭廣操，朱明軍.雷公藤的藥理作用及毒性研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14（15）：1753-1754.

[3]劉雪梅，劉志宏，張晶，等.雷公藤臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2015，33（2）：110-113.

[4]陳一龍，劉翔，翟顯友，等.雷公藤屬植物物種間的化學(xué)成分差異性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2017，42（2）：319-326.

[5]劉萬(wàn)水，郭寶林，陳玉婷，等.雷公藤屬3種植物遺傳關(guān)系與遺傳多樣性的RAPD分析[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（16）：1615-1620.

[6]劉玉鳳，潘麗，南麗紅，等.雷公藤藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（9）：37-39.

[7]謝晨瓊，周萍，李祥，等.昆明山海棠化學(xué)成分及藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（13）：1996-2010.

[8]劉建群，劉健.基于蕨素聚類(lèi)分析的鳳尾蕨屬藥用植物化學(xué)分類(lèi)研究[J].中國(guó)野生植物資源，2015，34（5）：4-9.

[9]徐曉勇，馬鳳森，方劍喬，等.響應(yīng)面法優(yōu)選雷公藤超聲提取工藝[J].中成藥，2016，38（5）：1030-1034.

[10]巴文強(qiáng)，王利勝，王玎，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選雷公藤提取工藝[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（14）：16-19.

[11]田振，劉志宏，宋洪濤.雷公藤有效部位提取純化工藝研究進(jìn)展[J].中草藥，2012，43（2）：408-412.

[12]劉超，郝慶秀，金艷，等.基于UPLC-Q-TOF-MS比較雷公藤與昆明山海棠葉片的代謝產(chǎn)物差異[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（9）：1710-1717.

[13]Guo L，Duan L，Liu K，et al.Chemical comparison of Tripterygium wilfordii and Tripterygium hypoglaucum based on quantitative analysis and chemometrics methods[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2014，95（3）：220-228.

[14]Su P，Cheng Q，Wang X，et al.Characterization of eight terpenoides from tissue cultures of the Chinese herbal plant，Tripterygium wilfordii，by high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Biomedical Chromatography，2014，28（9）：1183-1192.

[15]吳春敏.雷公藤化學(xué)成分與多組分含量測(cè)定研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，2010.

[16]馬鑫斌，巴文強(qiáng)，王玎，等.雷公藤藥材中雷公藤甲素及總二萜內(nèi)酯的含量測(cè)定[J].中國(guó)中醫(yī)藥，2014，12（6）：153-155.

[17]黃文華，郭寶林，斯金平，等.雷公藤屬3種植物不同群體和個(gè)體中雷公藤甲素的研究[J].中草藥，2005，36（7）：1065.