陳偉 李曉 陳美華 王曉丹 馬健 王浩 張繼國

中圖分類號 R965 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1760-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.08

摘 要 目的：探究葡萄籽原花青素（GSP）對阿爾茨海默?。ˋD）模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其機制。方法：將50只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和GSP高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg），除假手術(shù)組外其余大鼠海馬組織注射β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）建立AD模型，造模后48 h開始灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃相同體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥21 d。給藥14 d后采用新物體識別實驗檢測各組大鼠的新事物識別指數(shù)（TI）；從給藥16 d開始進行Morris水迷宮實驗，學(xué)習(xí)5 d記錄逃避潛伏期，末次給藥后記錄探索潛伏期和探索次數(shù)，Western blot法檢測大鼠海馬組織中NOD樣受體蛋白3（NLRP3）的表達水平；酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠海馬組織中白細胞介素6（IL-6）、IL-1β的含量。結(jié)果：5組大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)5 d內(nèi)的逃避潛伏期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TI明顯減小，探索潛伏期明顯延長，探索次數(shù)明顯減少，海馬組織中NLRP3、IL-6、IL-1β水平均明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，GSP各劑量組大鼠探索潛伏期明顯縮短，探索次數(shù)和TI均明顯增加，海馬組織中NLRP3、IL-6、IL-1β水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：GSP可改善AD模型大鼠的記憶能力，其機制可能與抑制NLRP3炎性小體通路，減少炎癥因子IL-6、IL-1β的產(chǎn)生有關(guān)。

關(guān)鍵詞 葡萄籽原花青素；阿爾茨海默??；β-淀粉樣蛋白1-42；NOD樣受體蛋白3；炎癥因子

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effects and its mechanism of grape seed proanthoeyanidins （GSP） on learning and memory ability of Alzheimers disease （AD） model rats. METHODS： Totally 50 rats were randomly divided into sham operation group， model group and GSP high-dose， medium-dose and low-dose groups （400， 200， 100 mg/kg）. Those groups were given Aβ1-42 in hippocampus of rats to establish AD model except sham operation group and given relevant medicine intragastrically 48 h after modeling. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 21 d. 14 d after administration， new object recognition test was adopted to test new recognition index （TI）. Morris water maze test was conducted since 16 d after administration. The escape incubation period of rats were recorded 5 d during learning. Exploration incubation period and the times of exploration were recorded after last administration. Western blot was used to detect the expression of NLRP3 in rat hippocampus. ELISA was used to determine the content of IL-6 and IL-1β in rat hippocampus. RESULTS： There was no statistical significance in escape incubation period among 5 groups within 5 d of Morris water maze learning （P>0.05）. Compared with sham operation group， TI of model group was decreased significantly， while exploration incubation period was prolonged significantly； the times of exploration was decreased significantly； the levels of NLRP3， IL-6 and IL-1β in hippocampus were increased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， exploration incubation period of GSP groups were shortened significantly， while the times of exploration and TI were increased significantly； the levels of NLRP3， IL-6 and IL-1β in hippocampus were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： GSP can improve the memory ability of AD model rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting NLRP3 inflammatory corpuscle pathway and reducing the generation of inflammatory factors as IL-6 and IL-1β.

KEYWORDS Grape seed proanthoeyanidins； Alzheimers disease；Aβ1-42；NLRP3； Inflammatory factors

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病率逐年升高，但其發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)有治療方法效果均不甚滿意[1]。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）聚集是AD患者腦內(nèi)的主要病理學(xué)特征之一。Aβ沉積后激活小膠質(zhì)細胞引起的炎癥反應(yīng)是AD的發(fā)病機制[2]。NLRP3炎性小體屬于胞內(nèi)模式識別受體NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs），在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3]。葡萄籽原花青素（Grape seed proanthoeyanidins，GSP）是從葡萄籽中提取的多酚類化合物，可改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4]，可保護Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元損傷[5]，但對AD的作用尚未見公開報道。本研究以海馬組織內(nèi)注射Aβ1-42建立AD大鼠模型[6]，研究GSP對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其抑制炎癥反應(yīng)的可能機制，為GSP治療AD提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

5804 R型高速臺式低溫離心機（德國Eppendorf公司）；STRONG-Ⅱ型腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；INFINITE200 pro型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Powerpac Basic型垂直電泳、電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

GSP原料藥（陜西省天之潤生物科技有限公司，批號：TZR20140825，純度：95.36%）；BCA蛋白試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20161109）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國Thermo Scientific Pierce公司）；Aβ1-42（美國Sigma公司，批號：A9810，純度：≥95%）；白細胞介素6（IL-6）和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號：20161223、20161008）；NLRP3抗體（美國Santa Cruz公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物公司）。

1.3 動物

SPF級8周齡SD大鼠，♂，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。本實驗通過泰山醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 分組與給藥

所有大鼠自由飲食飼養(yǎng)7 d，按隨機數(shù)字表法分組，分為假手術(shù)組、模型組和GSP高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg），每組10只，GSP給藥劑量按文獻[4]與預(yù)實驗確定。GSP以生理鹽水制備混懸液，用前搖勻。造模48 h后各組大鼠開始灌胃相應(yīng)劑量的藥物，假手術(shù)組和模型組灌胃相同體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)21 d。

2.2 建模

實驗前一周以生理鹽水將白色干粉Aβ1-42溶解制成5 μg/μL溶液，并置于37 ℃溫箱中孵育1周，老化為具有神經(jīng)毒性的凝聚狀態(tài)的Aβ1-42。大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀，暴露前囟，以前囟為原點，向后4.0 mm，旁開2.5 mm穿刺點轉(zhuǎn)穿顱骨，自腦表面進針3 mm，將2 μL凝聚狀態(tài)Aβ1-42在10 min內(nèi)緩慢注入海馬組織CA1區(qū)，假手術(shù)組注入等量生理鹽水，留針5 min以保證其充分擴散；緩慢退針，局部消毒并縫合皮膚[6]。

2.3 新物體識別實驗

首次給藥14 d后各組大鼠進行新物體識別實驗評價大鼠的學(xué)習(xí)能力[7]。實驗分為適應(yīng)、訓(xùn)練和測試三個階段。適應(yīng)階段中，將大鼠逐個放入空箱中適應(yīng)環(huán)境，每只大鼠適應(yīng)10 min。24 h后開始訓(xùn)練，將2個完全一樣的物體A放入行為箱的2個角落并固定，然后逐個放入大鼠探究學(xué)習(xí)A，訓(xùn)練10 min；間隔1 h后進入測試階段，將行為箱中的其中一個物體A換成顏色、形狀均不同的新物體B，記錄大鼠對物體A和B的探究時間，分別表示為TA和TB，每只大鼠的測試時間為5 min，計算新物體識別指數(shù)TI=（TB-TA）/（TB+TA）。每只大鼠實驗結(jié)束后清除糞便，并用75%乙醇擦拭行為箱和物體，清除排泄物及殘留味道。

2.4 Morris水迷宮實驗

實驗分為定位航行實驗和對位空間探索實驗兩部分[6]。給藥后第16天開始進行定位航行實驗評價大鼠的學(xué)習(xí)能力，在第一象限放置隱蔽平臺，選任一象限將大鼠面向池壁放入水池，記錄大鼠從入水至爬上隱蔽平臺所需的時間，即為逃避潛伏期。如2 min內(nèi)大鼠未找到隱蔽平臺，則將大鼠引導(dǎo)至平臺并停留10 s，并將逃避潛伏期記錄為2 min。每天訓(xùn)練4次，計算所需時間的平均值為當(dāng)天的逃避潛伏期，連續(xù)訓(xùn)練5 d，每天固定時間段訓(xùn)練。給藥21 d后進行對位空間探索實驗評價大鼠的記憶能力，即將隱蔽平臺撤掉，在原放置平臺的對位象限處放入大鼠，記錄大鼠首次進入原平臺位置的時間，即探索潛伏期，并記錄2 min 內(nèi)大鼠進入原平臺區(qū)的次數(shù)，即探索次數(shù)。

2.5 Western blot法檢測海馬組織中NLRP3表達水平

對位空間探索實驗后，處死大鼠，分離腦海馬組織，-80 ℃凍存。用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液勻漿后冰上裂解30 min，4 ℃下12 000×g離心20 min，經(jīng)BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，加上樣緩沖液后煮沸5 min。取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），凝膠蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，8%脫脂奶粉封閉4 h，β-actin（1 ∶ 2 000）、NLRP3（1 ∶ 800）抗體室溫孵育2 h，4 ℃過夜，TBST緩沖液充分洗膜后，經(jīng)山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，加ECL于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件檢測灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以NLRP3與內(nèi)參灰度值的比值表示海馬組織中NLRP3的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2.6 ELISA法測定大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β的含量

取大鼠海馬組織，4 ℃下1 500×g離心20 min，收集上清液，經(jīng)BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。上清液加入平衡液，根據(jù)IL-6、IL-1β ELISA試劑盒說明書，樣品加入預(yù)先包被IL-6、IL-1β抗體的酶標(biāo)板孔中，于37 ℃反應(yīng)1 h，充分沖洗酶標(biāo)板孔，再與HRP酶底物共同孵育顯色，加入終止液，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度，計算IL-6、IL-1β的含量。實驗重復(fù) 3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計處理，各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采取單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用 SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TI

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TI明顯減少（P<0.05），提示注射Aβ1-42會損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。與模型組比較，GSP高、中、低劑量組大鼠的TI明顯增加（P<0.05），且各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示從灌胃GSP 14 d開始已經(jīng)發(fā)揮改善學(xué)習(xí)能力的作用。各組大鼠的TI測定結(jié)果見表1。

3.2 逃避潛伏期

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠學(xué)習(xí)期內(nèi)的逃避潛伏期均有所延長，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，GSP高、中、低劑量組大鼠學(xué)習(xí)期內(nèi)的逃避潛伏期均有縮短，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠學(xué)習(xí)期內(nèi)的逃避潛伏期見表2。

3.3 探索潛伏期與探索次數(shù)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的探索潛伏期明顯延長（P<0.05），探索次數(shù)明顯減少（P<0.05）；與模型組比較，GSP高、中、低劑量組大鼠的探索潛伏期均明顯縮短（P<0.05），探索次數(shù)明顯增加（P<0.05），但各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠的探索潛伏期和探索次數(shù)見表3。

3.4 海馬組織中NLRP3的表達

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中NLRP3的相對表達量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，GSP高、中、低劑量組大鼠海馬組織中NLRP3的相對表達量明顯減少（P<0.05），但各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠海馬組織中NLRP3表達的電泳圖見圖1，測定結(jié)果見表4。

3.5 海馬組織中IL-6、IL-1β含量的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β的含量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，GSP高、中、低劑量組大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β的含量明顯減少（P<0.05），但各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β的含量見表5。

4 討論

隨著人口老齡化進展，AD成為危害公共健康最嚴重的疾病，醫(yī)學(xué)工作者一直在努力探索AD的發(fā)病機制，并提出膽堿能學(xué)說、tau蛋白磷酸化學(xué)說及Aβ學(xué)說等，其中Aβ學(xué)說占據(jù)主導(dǎo)地位[8]。目前關(guān)于炎癥學(xué)說的研究愈漸增多[2]，研究認為Aβ沉積可以激活小膠質(zhì)細胞，釋放炎癥因子，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或死亡[3]。還有研究證實，某些化合物如積雪草苷通過減少IL-6、TNF-α的生成抑制炎癥反應(yīng)，可以保護AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[6]。

GSP是從葡萄籽中提取的多酚類化合物，具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤[9]、肝保護[10]等。有研究認為GSP可通過抗氧化作用改善血管性癡呆模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶等[4]，但GSP對AD的作用及機制尚未見文獻報道。本實驗采用經(jīng)典的向海馬組織中注射Aβ1-42的方法建立AD大鼠模型，探究GSP對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。結(jié)果表明，GSP在第14天時即可明顯增加AD模型大鼠的TI，表現(xiàn)出明顯的改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。隨后本研究通過Morris水迷宮實驗驗證GSP治療AD的效果，其中定位航行實驗學(xué)習(xí)期持續(xù)5 d，經(jīng)重復(fù)訓(xùn)練，大鼠均能找到隱蔽平臺，GSP具有縮短AD模型大鼠的逃避潛伏期的趨勢；第21天對位空間探索實驗中，GSP可明顯縮短AD模型大鼠的探索潛伏期，增加探索次數(shù)，進一步表明GSP可以改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)由NLR蛋白、凋亡相關(guān)點樣蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）的前體（pro-Caspase-1） 組成，NLR 蛋白可以識別配體和危險信號，比如Aβ及細菌、病毒的DNA等，ASC 通過CARD結(jié)構(gòu)域募集并激活效應(yīng)蛋白pro-Caspase-1[11]。NLRP3炎性小體是目前研究最多的炎性小體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在于星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中，NLRP3炎性小體參與AD的發(fā)生發(fā)展過程[12]，這一理論為 AD 治療的研究提供新靶點和新思路。實驗證實，激活NLRP3炎性小體，可以增加APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ堆積，加快AD病理演變進程，而NLRP3的基因缺失，可促進Aβ的消除，明顯改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間記憶障礙[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，GSP給藥21 d時可明顯減少注射Aβ1-42的海馬組織中NLRP3的表達，表明GSP可以抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化，發(fā)揮抗炎作用。

NLRP3炎性小體活化，可通過Caspase-1剪切無活性的促炎細胞因子 IL-6、IL-1β的前體成為成熟的IL-6、IL-1β等炎癥因子[14]。IL-6、IL-1β等炎癥因子可激活膠質(zhì)細胞中核因子κB（NF-κB），使細胞因子上調(diào)，并且通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38 信號增強神經(jīng)元中Aβ分泌酶1（BACE1）蛋白的活性，增加Aβ的合成和沉積[15]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，GSP可明顯減少大鼠海馬組織中IL-6、IL-1β的含量，據(jù)此推測GSP可能通過抑制 Aβ1-42誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化，減少IL-6、IL-1β的生成，進而發(fā)揮保護AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。但GSP抑制NLRP3炎性小體活化的具體機制尚不明確，還需進一步深入研究。

參考文獻

[ 1 ] RIEDERER BM，LEUBA G，VERNAY A，et al. The role of the ubiquitin proteasome system in Alzheimers disease[J]. Exp Biol Med （Maywood），2011，236（3）：268-276.

[ 2 ] CAMERON B，LANDRETH GE. Inflammation，microglia，and Alzheimers disease[J]. Neurobiol Dis，2010，37（3）：503-509.

[ 3 ] ZHANG YY，F(xiàn)AN YC，WANG M，et al. Atorvastatin attenuates the production of IL-1β，IL-6，and TNF-α in the hippocampus of an amyloid β1-42-induced rat model of Alzheimers disease[J]. Clin Interv Aging，2013，8（4）：103-110.

[ 4 ] 周恒，林煥冰，卓燁，等.葡萄籽原花青素對血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].藥學(xué)實踐雜志，2011，29（3）：208-211.

[ 5 ] 何清，楊思雨，汪琴，等.原花青素對Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)細胞毒性的影響[J].中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2014，22（5）：481-488.

[ 6 ] 黃雅蘭，黃江，宋大強，等.積雪草苷對阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織中PAPR-γ蛋白表達的影響[J].中國藥房，2016，27（34）：4791-4794.

[ 7 ] HATTIANGADY B，MISHRA V，KODALI M，et al. Object location and object recognition memory impairments，motivation deficits and depression in a model of Gulf War illness[J]. Front Behav Neurosci，2014.DOI：10.3389/fnbeh.2014.00078.

[ 8 ] HUANG Y，MUCKE L. Alzheimer merchanisms and therapeutic strategies[J]. Cell，2012，148（6）：1204-1222.

[ 9 ] 張慧瑛，邢芙玲，羅光宏，等.葡萄籽原花青素抑制小鼠 B16-F0黑色素瘤細胞黑色素生成的影響[J].中藥藥理與臨床，2017，33（1）：63-66.

[10] 李小麗，王楷揚，胡建輝，等.葡萄籽原花青素對CCl4誘導(dǎo)小鼠氧化性肝損傷的保護作用及其機制研究[J].中國藥房，2016，27（13）：1752-1755.

[11] SCHRODER K，TSCHOPP J. The inflammasomes[J]. Cell，2010，140（6）：821-832.

[12] TAN MS，YU JT，JIANG T，et al. The NLRP3 inflammasome in Alzheimers disease[J]. Mol Neurobiol，2013，48（3）：875-882.

[13] HENEKA MT，KUMMER MP，STUTZ A，et al. NLRP3 is activated in Alzheimers disease and contributes to pathology in APP/PS1 mice[J]. Nature，2013，493（7434）：674-678.

[14] YANG CS，SHIN DM，JO EK. The role of NLR-related protein 3 inflammasome in host defense and inflammatory diseases[J]. Int Neurourol J，2012，16（1）：2-12.

[15] MINKIEWICZ J，RIVEROVACCARI JP，KEANE RW.Human astrocytes express a novel NLRP2 inflammasome[J]. Glia，2013，61（7）：1113-1121.

（收稿日期：2018-01-10 修回日期：2018-05-16）

（編輯：鄒麗娟）