張 虎，巫建新，許建民，宋 微

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

芫花(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)為瑞香科瑞香屬落葉灌木，主要分布在中國(guó)黃河流域以南地區(qū)。芫花花期在春季，花常3至7朵簇生于短花軸上，先于葉開放，其花朵錦簇，花色艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值，為我國(guó)優(yōu)良野生花卉資源[1-3]。芫花性寒，有毒，全株可入藥，是我國(guó)重要的中藥材和生物農(nóng)藥[4-6]。

從20世紀(jì)60年代開始，尤其是90年代以后，芫花的生境遭到嚴(yán)重破壞，種群分布范圍縮小，居群數(shù)量及個(gè)體數(shù)量急劇下降，其野生可利用資源逐漸減少[7]。研究芫花的繁殖技術(shù)成為保護(hù)和利用該植物資源的迫切要求。采用組織培養(yǎng)方法繁殖芫花，可保持母本優(yōu)良性狀，為優(yōu)良單株的快速擴(kuò)大繁殖提供有效途徑。

國(guó)內(nèi)外對(duì)芫花的藥理學(xué)研究表明，芫花含有黃酮苷元等多種藥用成分，其不同器官中所含藥物成分及其含量不盡相同，通過(guò)不同加工與炮制方法，可有效提高其藥用成分含量，其藥用成分具有抗早孕、抗炎、抗腫瘤活性等作用[8-14]。對(duì)芫花生物農(nóng)藥的研究表明，芫花具有β-谷甾醇、雪松醇等殺蟲活性成分，其提取物對(duì)抑制、殺死天牛和尺蠖等害蟲具有活性[15-17]。對(duì)芫花抑菌效果的研究表明，芫花提取物具有多種抑菌成分，對(duì)辣椒疫霉病、番茄灰霉病等植物病原菌具有抑菌活性[18-19]。但對(duì)芫花作為觀賞植物的研究相對(duì)較少，董春玲等對(duì)芫花開發(fā)成新花卉作物的前景進(jìn)行了分析，初步探討了其在園林應(yīng)用的主要形式[20]。目前關(guān)于芫花繁殖與栽培技術(shù)的相關(guān)研究不多，其莖段外植體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本研究以芫花莖段為外植體，研究其初代組織培養(yǎng)技術(shù)，以建立可以快速繁殖的芫花組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為芫花種質(zhì)資源保存、工廠化育苗等研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芫花母本植株選自江蘇省句容市，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院林木種質(zhì)資源圃。芫花莖段外植體采自野生芫花優(yōu)株播種繁殖的2年生苗。芫花組織培養(yǎng)試驗(yàn)于2016年10月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝工程中心植物組織培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 方法

采集生長(zhǎng)健壯，腋芽飽滿，無(wú)病蟲害的芫花當(dāng)年生枝條，去除葉片，剪截成10 cm左右?guī)б秆壳o段，用洗衣粉液浸泡，清洗20 min，接著用流水沖洗12 h。

在超凈工作臺(tái)上，把外植體剪為3—4 cm莖段，用無(wú)菌水沖洗3遍。采用75%乙醇消毒莖段30 s，放入0.1%的升汞加3—5滴吐溫80的混合液浸泡消毒，處理時(shí)間分別為8，10，12，14 min；用無(wú)菌水沖洗后，剪截成2 cm左右具節(jié)莖段，接入MS固體培養(yǎng)基；每處理莖段30個(gè)，重復(fù)3次。

用消毒獲得的無(wú)菌帶芽莖段進(jìn)行初代培養(yǎng)試驗(yàn)。采用MS+0.2 mg/L NAA+(0.5，2.0，5.0) mg/L 6-BA和MS+0.1 mg/L NAA+(1.0，1.5，2.0) mg/L ZT，共6個(gè)處理進(jìn)行試驗(yàn)。每處理30個(gè)莖段，重復(fù)3次。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

將接種外植體置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，室內(nèi)溫度(24±1) ℃，相對(duì)濕度75%，光照強(qiáng)度2 500 lx，光周期L14∶D10 ，培養(yǎng)25 d。MS固體培養(yǎng)基加入蔗糖30 g/L及瓊脂7 g/L，按配方質(zhì)量濃度加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及調(diào)整酸堿度至pH為5.8。

1.4 數(shù)據(jù)處理

觀測(cè)污染率、死亡率、存活率、萌發(fā)率、玻璃化率、萌芽均高等指標(biāo)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在培養(yǎng)25 d時(shí)進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用 SPSS 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。相關(guān)指標(biāo)計(jì)算如下:

污染率(%)=(外植體污染數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

死亡率(%)=(外植體死亡數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

存活率(%)=100-污染率(%)-死亡率(%);

萌發(fā)率(%)=(腋芽萌發(fā)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

玻璃化率(%)=(玻璃化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100;

萌芽均高(cm)=萌發(fā)新梢長(zhǎng)度之和/接種外植體總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式對(duì)外植體滅菌效果的影響

2.1.1 預(yù)處理無(wú)流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對(duì)芫花莖段外植體滅菌效果的影響 預(yù)處理采用洗衣粉液浸泡芫花莖段外植體20 min，消毒采用75%乙醇30 s+0.1%升汞8—14 min進(jìn)行滅菌處理,并調(diào)查污染率，將污染率數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 預(yù)處理無(wú)流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對(duì)芫花莖段外 植體滅菌效果的影響

同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

預(yù)處理無(wú)流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對(duì)芫花莖段外植體消毒處理的污染率為87.8%—100.0%，各處理無(wú)顯著差異。由此可知，預(yù)處理過(guò)程中無(wú)流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法，污染率高，外植體消毒效果不理想。

2.1.2 預(yù)處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法對(duì)芫花莖段外植體滅菌效果的影響 預(yù)處理采用洗衣粉液浸泡芫花莖段外植體20 min，接著用流水沖洗12 h；然后采用75%乙醇30 s +0.1%升汞加3—5滴吐溫80混合液8—14 min進(jìn)行滅菌處理，結(jié)果見表2。

表2 預(yù)處理加流水沖洗的消毒方法對(duì)芫花莖段外植體滅菌效果的影響

處理污染率/%死亡率/%存活率/%75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液8 min91.1 a3.3 b5.6 c75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液10 min70.0 b8.9 b21.1 b75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液12 min57.8 bc13.3 b28.9 a75%乙醇30 s+升汞吐溫混合液14 min44.4 c35.6 a20.0 b

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

預(yù)處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法其污染率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。消毒8 min處理的污染率為91.1%，顯著高于其他各處理；消毒14 min污染率最低，為44.4%，顯著低于8，10 min處理；消毒12，14 min處理污染率差異不顯著。

預(yù)處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法莖段外植體死亡率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升。消毒14 min死亡率為35.6%，顯著高于其他各處理；消毒8，10，12 min的處理，其死亡率均在13.3%以下，各處理間差異不顯著。

預(yù)處理加流水沖洗環(huán)節(jié)的消毒方法莖段外植體的存活率數(shù)據(jù)分析表明，消毒8min處理的存活率為5.6%，效果最差，顯著低于其他處理；消毒10 min和14 min存活率為21.1%和20.0%；消毒12 min效果最好，存活率達(dá)28.9%，顯著高于其他處理。

綜合分析污染率、死亡率與生存率的試驗(yàn)結(jié)果可知，芫花莖段外植體的最佳消毒方法為預(yù)處理采用洗衣粉液浸泡芫花莖段外植體20 min，接著用流水沖洗12 h；消毒采用75%乙醇30 s+0.1%升汞吐溫80混合溶液12 min處理，其污染率為57.8%，死亡率為13.3%，存活率為28.9%。

2.2 6-BA與ZT質(zhì)量濃度對(duì)初代培養(yǎng)的影響

采用6-BA與ZT不同質(zhì)量濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方處理對(duì)芫花莖段外植體萌發(fā)與生長(zhǎng)情況的影響見表3。

6-BA與ZT不同質(zhì)量濃度處理芫花莖段外植體，對(duì)萌芽率的影響結(jié)果表明，6-BA各質(zhì)量濃度處理其萌芽率在34.4%以下，ZT各質(zhì)量濃度處理其萌芽率在74.4%以上，6-BA處理萌芽率顯著低于ZT處理。由此可知，對(duì)芫花的外植體的初代培養(yǎng)細(xì)胞分裂素采用ZT，對(duì)芫花莖段外植體芽萌發(fā)的促進(jìn)效果顯著優(yōu)于6-BA。在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方處理中，MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT處理對(duì)芫花莖段外植體芽萌發(fā)效果顯著優(yōu)于其他處理，萌發(fā)率達(dá)到92.2%。

表3 6-BA與ZT質(zhì)量濃度對(duì)芫花莖段初代培養(yǎng)的影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

6-BA與ZT不同質(zhì)量濃度處理芫花莖段外植體，對(duì)玻璃化率的影響結(jié)果表明，隨著細(xì)胞分裂素6-BA與ZT質(zhì)量濃度升高，芫花莖段外植體初代培養(yǎng)玻璃化現(xiàn)象逐漸加劇。6-BA處理玻璃化率在52.2%以上，ZT處理玻璃化率在42.2%以下，6-BA處理玻璃化率顯著高于ZT處理。在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方處理中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L ZT 處理與MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT處理，對(duì)芫花莖段外植體初代培養(yǎng)中減少玻璃化現(xiàn)象顯著優(yōu)于其他處理，玻璃化率小于22.3%。

6-BA與ZT不同質(zhì)量濃度處理芫花莖段外植體，對(duì)萌芽平均高度的影響結(jié)果表明，6-BA處理萌芽均高在0.66 cm以下，ZT處理萌芽均高在1.06 cm以上，6-BA處理萌芽均高顯著低于ZT處理。在不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方處理中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L ZT 處理與MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT處理，對(duì)芫花莖段外植體初代培養(yǎng)中萌芽平均高度顯著優(yōu)于其他處理，萌芽均高分別為1.67 cm和2.13 cm。

綜合分析萌發(fā)率、玻璃化率與萌芽均高的試驗(yàn)結(jié)果可知，芫花莖段外植體初代培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽的最佳配方為MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT，其萌發(fā)率為92.2%，玻璃化率為22.3%，萌芽均高為2.13 cm。

芫花莖段外植體誘導(dǎo)叢生芽，不同歷時(shí)的生長(zhǎng)情況見圖1。

圖1 芫花莖段外植體初代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論與討論

綜上所述，芫花莖段外植體的最佳消毒方法，為預(yù)處理采用洗衣粉液浸泡20 min，用流水沖洗12 h；消毒采用75%乙醇30 s+0.1%升汞吐溫80混合溶液12 min處理，其污染率為57.8%，死亡率為13.3%，存活率為28.9%。芫花莖段外植體初代培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽的最佳配方為MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L ZT，其萌發(fā)率為92.2%，玻璃化率為22.3%，萌芽均高為2.13 cm。

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體帶菌是最主要的污染來(lái)源[21]。外植體體表被毛或表面粗糙則消毒困難，采用乙醇、升汞等殺菌劑消毒，消毒時(shí)間短則污染率高，延長(zhǎng)消毒時(shí)間則會(huì)導(dǎo)致外植體中毒致死加劇[22]。消毒預(yù)處理過(guò)程中，外植體采用流水沖洗有助于去除附著在體表組織的污物，在消毒溶液中添加表面活性劑吐溫，有助于殺菌劑浸潤(rùn)外植體表面，進(jìn)而提高殺菌效果[23]。芫花莖段外植體消毒效果試驗(yàn)表明，預(yù)處理增加流水沖洗環(huán)節(jié)，升汞消毒添加吐溫80，是提高其外植體消毒效果的有效途徑。這與芫花新梢表面密被茸毛、污染物不易清潔的特性相關(guān)。

植物體細(xì)胞具有全能性，實(shí)踐中愈傷組織能否表達(dá)其全能性，進(jìn)而產(chǎn)生叢生芽具有不確定性。本試驗(yàn)采用芫花莖段外植體，誘導(dǎo)叢生芽的初代組織培養(yǎng)方法，較張恒基等采用腋芽外植體脫分化形成愈傷組織[24]，進(jìn)一步誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)方法更為便捷。2種方法研究思路不同，可互為補(bǔ)充。

植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程與植株的內(nèi)源和外源激素種類、含量及配比等有密切關(guān)系[25]。植物對(duì)于不同外源激素的響應(yīng)成因復(fù)雜。本試驗(yàn)芫花莖段外植體的初代培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素ZT對(duì)芫花莖段芽萌發(fā)與生長(zhǎng)的促進(jìn)效果明顯優(yōu)于6-BA，這一結(jié)論與張恒基等對(duì)芫花愈傷組織分化成芽和不定芽增殖試驗(yàn)研究結(jié)論相似[24]。這一結(jié)果表明，芫花莖段外植體組織培養(yǎng)時(shí)，在芽的分化、萌發(fā)、長(zhǎng)成階段，ZT作為外源激素具有重要促進(jìn)作用，6-BA不可替代其作用。

植物組織培養(yǎng)過(guò)程的玻璃化苗發(fā)生百分率和細(xì)胞分裂素成正相關(guān),其中6-BA的影響大于ZT和KT[26]。本試驗(yàn)中，6-BA較ZT更容易導(dǎo)致芫花試管苗的玻璃化現(xiàn)象，這一結(jié)論與陳兵先等結(jié)論相一致[26]。本試驗(yàn)中，ZT的質(zhì)量濃度為1.0—1.5 mg/L，其玻璃化率維持在17.8%—22.3%之間；ZT的質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí)，玻璃化率升高至42.2%，顯著高于ZT其他處理。從本試驗(yàn)結(jié)果看，芫花莖段外植體組織培養(yǎng)中，ZT質(zhì)量濃度應(yīng)限制在 2.0 mg/L以下。

張慧君等研究認(rèn)為，植物的外源激素須通過(guò)對(duì)內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)，來(lái)控制器官的生長(zhǎng)發(fā)育，各種植物生長(zhǎng)物質(zhì)的水平，都通過(guò)影響植物外植體的基因表達(dá)而引起器官分化[27]。芫花組織培養(yǎng)休眠芽的萌發(fā)、愈傷組織分化成芽、成枝的過(guò)程中，外源激素如何影響內(nèi)源激素，進(jìn)而完成形態(tài)構(gòu)成的機(jī)理，還有待進(jìn)一步研究。