朱仙娜,戴璐瑤,張一斐,金 燕,陳梅蘭

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院,浙江杭州 310015)

在黃酒的釀造過程中,浸米是一個重要環(huán)節(jié),它不僅能使大米充分吸水膨脹便于蒸煮,更可以使?jié){水中的產(chǎn)酸菌利用大米的營養(yǎng)物質迅速繁殖,代謝產(chǎn)生大量酸類物質,使?jié){水酸度增加以調節(jié)發(fā)酵醪液的酸度,保障發(fā)酵的安全進行[1]。米漿水中含有豐富的蛋白質、糖類、氨基酸及大量有機酸,包括乳酸、乙酸、甲酸、蘋果酸、草酸等[2]。米漿水中的有機酸對于黃酒的口感風味影響較大,乳酸、蘋果酸和檸檬酸口感較為爽凈,而乙酸是一種刺激性酸,口味較軟。小分子有機酸還是黃酒中重要的助香物質,對于豐富酒質香味和提高酒品質有著至關重要的作用[3],而且適量的有機酸攝入能夠促進人體的代謝、增強免疫力。米漿水是黃酒生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物,由于其含豐富的營養(yǎng)物質,因此國內較多廠家不斷嘗試米漿水的循環(huán)利用。例如,胡健[4]等人研究了米漿水的回用技術對黃酒釀造的影響。但由于米漿水中含大量的有機酸導致酸度較高,影響了米漿水的后續(xù)的循環(huán)利用,目前對米漿水中有機酸含量變化研究主要在集中在對乳酸的研究。如姬中偉[5]研究總酸和乳酸的含量變化及對黃酒品質的影響,未涉及具體的有機酸含量的變化研究。因此,研究米漿水中各類有機酸含量隨大米產(chǎn)地、包裝方式及浸米時間的變化,可以有效地控制有機酸在黃酒生產(chǎn)過程中的生產(chǎn)量,從而提高米漿水回收利用的效率,不僅節(jié)能環(huán)保,而且能促進我國黃酒產(chǎn)業(yè)的長遠發(fā)展。

目前檢測有機酸的方法較多,主要有離子色譜電導法[6-7]、離子排斥色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、毛細管電泳法[13]、柱后緩沖電導法[14]、梯度淋洗-離子色譜法測定[15]等。如黃海蘭[16]等使用離子色譜法測定藍藻培養(yǎng)液中有機酸和無機陰離子,楊春霞[17]等采用離子色譜法分析了葡萄酒釀造過程中有機酸的變化規(guī)律等。其中離子色譜電導檢測法是小分子有機酸的最佳檢測方法[18],可以同時分離和測定有機酸和無機陰離子,該方法操作簡單,方便可行,但是所需要的檢測時間較長,其檢出限較高,容易受基質干擾。本研究采用傳統(tǒng)的離子色譜法檢測浸米漿水中的有機酸含量,并對方法進行優(yōu)化,縮短了檢測時間對實驗的影響,并根據(jù)建立的方法對浸米發(fā)酵過程中不同產(chǎn)地、包裝方式及浸米時間對于黃酒生產(chǎn)過程中有機酸(乳酸、乙酸、甲酸、草酸、蘋果酸)含量的變化進行了研究,從而為黃酒生產(chǎn)過程中有機酸含量的控制和米漿水在黃酒生產(chǎn)過程中的循環(huán)利用提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

散裝江蘇鹽城糯米、散裝吉林糯米 市售;氮氣保護包裝吉林糯米 吉林寶龍倉農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司;氮氣保護包裝江蘇糯米 金壇市江南制粉有限公司;甲酸、乳酸、蘋果酸、草酸、乙酸標品 華東醫(yī)藥股份有限公司;超純水 Millipore,Molisheim,France,電阻率18.2 MΩ·cm。

賽默飛ICS 5000離子色譜儀、配電導檢測器、抑制器Suppressor. DionexTMAERTM500(4 mm)、Dionex KOH自動淋洗液發(fā)生器、IonPac AS11-HC分析柱(4 mm×250 mm)、IonPac AG11-HC保護柱(4 mm×50 mm) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;TGL-16B離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 用超純水配制乳酸、乙酸、甲酸、蘋果酸、草酸5種有機酸(1000 mg/L)的標準貯備液,使用時配制成1、2、5、10、20 mg/L濃度的混合標準溶液。

1.2.2 米漿水的制備 取4種不同產(chǎn)地大米(散裝江蘇鹽城糯米、散裝吉林糯米、氮氣保護包裝江蘇糯米、氮氣保護包裝吉林糯米)各10份,每份均為100 g,分別置于500 mL三角瓶中,注入150 mL清水浸制,將三角瓶置于生化培養(yǎng)箱中,并保持培養(yǎng)箱溫度為20～22 ℃,每隔1 d,取出1個三角瓶中的米漿水進行檢測[19]。

1.2.3 樣品的前處理 分別取10 mL浸米時間為1、2、3、5、6、7、8 d的米漿水于10 mL圓底離心管中,在TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機中,于4000 r/min的轉速下離心20 min后,取上清液于1.5 mL尖底離心管中,放入TGL-16B離心機以13000 r/min的轉速運行5 min,再次取上層清液于0.45 μm濾膜過濾,濾液進色譜分析。

1.2.4 色譜條件優(yōu)化 查閱文獻[20]可知,浸米漿水中可能存在甲酸、乳酸、蘋果酸、草酸、乙酸等有機酸。為獲得理想的分離度和峰形,實驗嘗試了30 mmol/L KOH高濃度等度洗脫,10 mmol/L KOH低濃度等度洗脫和1～50 mmol/L KOH時間梯度洗脫。

1.2.5 樣品及加標樣品的制備 取浸米時間1、2、3、5、6、7、8、9 d的米漿水先按照1.2.3的樣品前處理的方法處理稀釋合適倍數(shù)進行測定。另取對浸取2 d的米漿水進行加標實驗(主要是考慮到米漿水發(fā)酵2 d后乳酸、乙酸含量不高,加標后的量在實驗的線性范圍之內),加標量為1.0 mg/L進行測定。

1.2.6 定量分析 在1.2.4的色譜條件下,對5種濃度有機酸標樣分別測定8次,變色龍6.80軟件進行峰面積計算,對濃度和峰面積進行線性回歸,得線性方程。樣品每天在同一時間取樣,重復6次計算平均峰面積,代入回歸方程,計算各有機酸的含量。對樣品進行加標回收實驗來驗證方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 色譜優(yōu)化結果

根據(jù)多次實驗優(yōu)化結果,確定的最終色譜條件為:流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,淋洗程序見表1。色譜圖見圖1。

圖1 5種有機酸分離色譜圖

表1 淋洗液梯度程序

2.2 方法的線性范圍及檢出限

按1.2.4的色譜條件對甲酸、乳酸、蘋果酸、草酸、乙酸5種有機酸標準溶液進樣分析,并進行濃度和峰面積線性回歸(線性范圍為1、2、5、10、20 mg/L),回歸系數(shù)和相對標準偏差(5 mg/L的標準溶液重復進樣8次)如表2所示。由表2可知,5種有機酸所建立的回歸方程相關系數(shù)R2分別為1.0000、0.9995、1.0000、0.9999、0.9999,檢出限0.0787、0.1006、0.0346、0.1283、0.1037 mg/L,相對標準偏差分別為2.06%、2.26%、2.37%、2.13%、2.89%,該方法具有良好的重現(xiàn)性和檢出限。

表2 5種有機酸的線性方程、回歸系數(shù)和相對標準偏差

2.3 樣品測定及方法的回收率

樣品的測定具體見表3,色譜圖見圖2,樣品加標回收率均在90.23%～97.43%之間。

表3 米漿水中5種有機酸的測定值及加標回收率

圖2 米漿水樣品(2 d)稀釋200倍的有機酸色譜圖

2.4 不同產(chǎn)地、包裝方式及浸米時間對米漿水中有機酸含量的影響

2.4.1 不同產(chǎn)地對有機酸含量的影響 不同產(chǎn)地的糯米對浸米漿水中有機酸含量的影響如表4所示。由表4可知,對于包裝糯米而言,江蘇糯米與吉林糯米浸米漿水中乳酸的含量差異最大,達到970.37 mg/L;其次兩個產(chǎn)地之間草酸、乙酸差異明顯,分別相差232.89、66.29 mg/L;甲酸、蘋果酸兩地含量差異較小,總體上,江蘇糯米浸米漿水種有機酸含量大于吉林糯米。對于散裝糯米而言,江蘇糯米與吉林糯米浸米漿水中乳酸的含量差異最大,達到876.58 mg/L;其次兩個產(chǎn)地之間草酸、乙酸差異明顯,分別相差168.60、54.87 mg/L;甲酸、蘋果酸兩地含量差異較小,與包裝糯米的結果一致;說明產(chǎn)地對黃酒生產(chǎn)過程中米漿水中有機酸含量有一定影響,江蘇糯米浸米漿水中有機酸含量大于吉林糯米。其原因是,浸米過程就是乳酸菌發(fā)酵分解微量元素產(chǎn)生有機酸[21],而米漿水的起發(fā)速度與米中微量成分如維生素、核苷酸等的含量有關,這些微量成分能夠促進乳酸菌快速生長、繁殖并影響發(fā)酵產(chǎn)物的多少,微生物成份多,起發(fā)快,微量成份少,起發(fā)慢,不同產(chǎn)地糯米中這些微量成分的含量有所差異,最終可能影響各種有機酸含量的高低。另外,由于不同產(chǎn)地的糯米的精白度不同,在相同條件下浸漬,其米漿水總酸和漿水中微生物是不同的;即浸米特性是不同的[22],最終導致有機酸含量的不同。

表4 不同產(chǎn)地、包裝方式米漿水中5種有機酸含量峰值(mg/L)

2.4.2 不同包裝方式對有機酸含量的影響 由表4可知,不同包裝方式糯米浸米漿水中有機酸含量不同。其中,對于產(chǎn)地江蘇的糯米而言,包裝糯米的乳酸含量大大超過了散裝糯米含量,兩者相差3600.42 mg/L,乙酸、草酸含量比散裝糯米高164.05、168.58 mg/L,甲酸、蘋果酸含量差異不大。對于產(chǎn)地吉林糯米而言,包裝糯米的米漿水中乳酸、乙酸、草酸分別比散裝糯米高3506.63、152.63、104.29 mg/L,與產(chǎn)地江蘇的糯米一致。由此可見,包裝糯米米漿水中有機酸含量總體高于散裝糯米。原因可能是包裝方式明顯影響浸米過程中微生物的生理生化反應,散裝糯米的米質相對于包裝糯米的米質較差,散裝糯米吸潮后表面微生物發(fā)生變化,在實驗過程中散裝米放置時間久,米漿水明顯出現(xiàn)發(fā)黃,散裝米長期裸露在空氣中受潮還會在其表面滋生大量霉菌,嚴重影響有益菌生長。

2.4.3 不同浸米時間對有機酸含量的影響 通過離子色譜分離電導檢測法,所得米漿水浸出有機酸的含量隨時間的變化結果如圖8～圖9所示,圖8是甲酸、乙酸及蘋果酸隨時間的變化規(guī)律,圖9是乳酸及草酸隨時間變化圖,實驗所用的糯米為散裝江蘇鹽城糯米。從圖7和圖8可知,在整個浸米過程中,5種有機酸的含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在第2 d時,甲酸、乙酸、蘋果酸達到峰值,分別為17.26、237.31、31.32 mg/L。在第5 d時,草酸含量達到峰值1706.82 mg/L。乳酸含量在浸米的第7 d達到峰值10746.03 mg/L。由于乳酸和草酸含量在5種有機酸中最高,占主體地位,因此在整個浸米周期中(現(xiàn)代黃酒生產(chǎn)浸米周期約8～12 d)[19],米漿水中的總酸含量是逐漸增加的。

圖7 甲酸、乙酸、蘋果酸含量隨浸米時間變化曲線

圖8 乳酸和草酸含量隨浸米時間變化曲線

高溫乳酸菌的生長和繁殖過程中,乳酸菌能促進醋酸菌生長,抑制酪酸菌生長,因此前期乙酸含量增加較快,在第2 d時,乙酸達到峰值,但大部分乳酸菌又會產(chǎn)生細菌素,如乳鏈菌素、噬酸菌素[23],這些細菌素反過來使醋酸桿菌漸漸失去活性,而導致醋酸含量下降。其中部分乙酸會轉化成乙酸乙酯等酯類物質,從而產(chǎn)生酯類香味,因此米漿水中乙酸含量前期呈上升趨勢,后期乙酸逐漸減少。

蘋果酸是三羧酸循環(huán)(TCA)及其支路乙醛酸循環(huán)中的重要有機酸,也是CO2固定反應的產(chǎn)物[26]。微生物利用米漿水中的淀粉等糖類進行復雜的新陳代謝,或者通過直接發(fā)酵所產(chǎn)生。前期微生物生命活動十分旺盛,蘋果酸含量急速增長,在第2 d達到含量最高,后期微生物蘋果酸-乳酸發(fā)酵(二次發(fā)酵)[24],造成含量下降,也是米漿水后期敗壞的原因之一。同時,在米漿水發(fā)酵過程中也會產(chǎn)生少量甲酸,在第2 d到達最大值。

草酸發(fā)酵是氧化發(fā)酵的一種,它能從糖或檸檬酸、醋酸等有機酸形成大量草酸[25],因此在菌類和高等植物中普遍地看到草酸的生成,同樣草酸在第5 d時達到峰值,隨著后期供能物質的減少,一些草酸與醇類發(fā)生酯化反應。

米漿水中優(yōu)勢菌種主要是乳酸桿菌,乳酸桿菌是一群生活在機體內有益于宿主健康的微生物,其維護人體健康和調節(jié)免疫功能的作用[26]。當米漿水酸度提高到pH約為4.5時,浸米初期水漿表面主要是乳酸桿菌,乳酸含量隨時間變化大幅上升,乳酸在浸米的第7 d達到峰值達到峰值,后由于米漿水中的供能物質減少,部分乳酸菌自溶而產(chǎn)生酸性多糖磷酸質。因此,米漿水后期只能夠單靠酵母和低溫乳酸菌發(fā)酵提供營養(yǎng),由于供能物質的減少逐漸衰敗,乳酸菌死亡的同時會伴隨著大量霉菌的出現(xiàn),如黃曲霉等,因此后期乳酸含量開始下降。

3 結論

本文采用離子色譜分離電導檢測法測定米漿水中的有機酸,通過優(yōu)化分離條件和前處理方式,獲得了理想色譜峰。方法學考察表明,本方法具有較好的線性,回收率和重現(xiàn)性較高,其中方法的回歸系數(shù)R2≥0.9995,回收率在90.23%～97.43%,重現(xiàn)性RSD≤3.76%。并在該方法下研究了不同產(chǎn)地、不同包裝方式以及不同浸米時間等因素對糯米浸米漿水中有機酸含量的影響。結果表明:不同產(chǎn)地的糯米浸米漿水產(chǎn)生的有機酸含量存在差異,相比于吉林糯米,江蘇糯米產(chǎn)有機酸量更高。同時,其包裝方式對乳酸產(chǎn)量有很大的影響,包裝大米產(chǎn)乳酸量明顯高于散裝大米產(chǎn)乳酸量,原因可能是散裝大米因受潮等導致微生物發(fā)生變化,所以采購及貯存時應注意大米防潮措施。隨著浸米時間的延長,米漿水中的有機酸的含量均呈先增長后下降的趨勢,前期微生物利用米漿水中的供能物質進行新陳代謝,使有機酸的含量快速增長,其中乳酸在有機酸中的含量最高,在浸米的第7 d達到峰值10746.03 mg/L,隨后由于供能物質的減少,大量霉菌的出現(xiàn),微生物逐漸衰敗,有機酸的含量逐漸降低。