史桂桃，陸春雪

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特，010050；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，湖南衡陽 421001）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，包括A、B、C、D等19種血清型，其中D-K型可引起人類泌尿生殖道感染。Ct是細(xì)菌性性傳播疾病最常見的病原體，感染者可出現(xiàn)盆腔炎、不孕不育等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。目前，Ct感染臨床治療最棘手的問題是絕大部分感染者初期癥狀不典型，一般不會尋求系統(tǒng)的治療，從而使下生殖道入侵的病原體得以逐漸上行感染至上生殖道；此外，Ct自然感染后免疫力不持久及性伴侶的隱性感染均導(dǎo)致Ct感染人群不斷擴(kuò)大，顯然研制出新型有效的Ct疫苗是預(yù)防控制Ct疾病的關(guān)鍵[2]。

脂蛋白是細(xì)菌胞壁的結(jié)構(gòu)成份，也是分枝桿菌和螺旋體等無脂多糖（LPS）細(xì)菌的重要致病物質(zhì)及疫苗研究靶標(biāo)[3]，衣原體細(xì)胞壁LPS缺乏內(nèi)毒素活性，提示其脂蛋白也可能具有重要作用。巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白（Microphage infectivity potentiator,MIP）是衣原體胞壁重要的脂蛋白成份，可體外刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放前炎癥因子。本課題組前期采用自行制備的MIP單克隆抗體證實，MIP蛋白結(jié)構(gòu)保守，在沙眼衣原體各血清型廣泛分布，且MIP單克隆抗體能有效中和Ct的感染性，可能是重要的潛在Ct疫苗候選分子[4]。本研究采用基因重組技術(shù)將Ct D型MIP編碼基因定向克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-l，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli XLl-Blue,實現(xiàn)了MIP在E.coli中高效表達(dá)，并對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化及免疫活性分析，為研究MIP亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Ct血清型D標(biāo)準(zhǔn)株為本室保存株[5]。

1.1.2 細(xì)胞與動物 HeLa-229細(xì)胞株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌株保存中心（ATCC，cat#CCL2）；Balb/c小鼠由南華大學(xué)實驗動物部提供。

1.1.3 主要試劑 Pfx DNA聚合酶、BamH I、Not I限制性內(nèi)切酶、DNA及蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、Glutathione Sepharose 4B Beads等為Invitrogen公司產(chǎn)品，Cy3 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（H+L）、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3購自Jackson ImmunoResearch公司，PreScission Protease（GST融合蛋白剪切酶）為GE Healthcare公司產(chǎn)品，QuickClean PCR純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 MIP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 從GenBank獲取 Ct D型標(biāo)準(zhǔn)株 MIP基因全長序列（GI：15605270），設(shè)計并合成一對特異引物，上游、下游引物中分別引入BamHI、NotI限制性酶切位點。引物如下（下劃線為酶切位點）：5’-CGC-GGATCCATGAAGAATATATTAAGTTGGATG-3’；DNA 為 模板，PCR擴(kuò)增MIP基因，酶切后插入pGEX-6p-l原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coliXLl-Blue；測序鑒定。

1.2.2 pGEX-6p-l/MIP重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá)和純化 將鑒定后的陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h后離心收集菌體，超聲破菌上清與Glutathione Sepharose 4B Beads室溫結(jié)合1 h后，采用GST融合蛋白剪切酶（該酶特異性結(jié)合Beads并精確剪切GST標(biāo)簽與目的蛋白間 LeuGluValLeuPheGlnGlyPro基序的Gln-Gly殘基）室溫作用Beads 2 h，離心收集酶切后的上清液（主要含酶切后的目的蛋白）及Beads洗脫液（非特異性結(jié)合的酶切后目的蛋白），最后采用超濾離心管（Millipore,Billerica，MA）離心濃縮，獲得純化的無GST標(biāo)簽純蛋白。SDS-PAGE電泳觀察蛋白表達(dá)情況和純化效果。

1.2.3 動物免疫 雌性Balb/c小鼠共15只，隨機(jī)分為EB免疫組、MIP蛋白免疫組及PBS對照組，每組 5 只。將 50 μL 1×106IFU 的純化 EB、30 μg純化的MIP蛋白或PBS，分別與10 μg CpG混勻后，各加入等量油性弗氏不完全佐劑（IFA），超聲乳化后，注射于小鼠兩側(cè)臀部。每只小鼠于第0天，14天，28天各免疫1次，共免疫3次。小鼠在每次免疫前及最后1次免疫后2周，尾靜脈采血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小鼠特異性抗體及亞型檢測 ELISA測定EB免疫組、MIP蛋白免疫組及PBS對照組血清總抗體和IgG亞類。以10 μg/mL EB菌體包被酶標(biāo)板，4℃過夜，1%BSA室溫封閉1 h，加入稀釋好的血清，37℃孵育1 h，0.05%PBST洗滌3次后分別加入羊抗鼠總抗體或 IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3 抗體孵育1 h，加入底物ABTS，37℃避光反應(yīng)15 min后，酶標(biāo)儀讀取405 nm波長的吸光值。

1.2.5 細(xì)胞因子檢測 末次免疫2周后，處死小鼠，無菌條件下分離脾臟，制備脾細(xì)胞懸液；用含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×106/mL，加入24孔板，1 mL/孔，每份脾淋巴細(xì)胞懸液設(shè)3個組，第1組用紫外線滅活的EB（UV-EB）刺激，第2組用10 μg重組的MIP抗原刺激，第3組加入培養(yǎng)基作為對照，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)72 h后收集上清，酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法定量檢測Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生水平。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-6p-l/MIP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增CtD血清型MIP全長基因（編碼產(chǎn)物：M1-E243），1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段長度約為729 bp，與預(yù)期結(jié)果一致,見圖1。經(jīng)BamH I和Not I雙酶切重組質(zhì)粒以及對測序結(jié)果的BLAST分析證實克隆質(zhì)粒序列完全正確。

圖1 MIP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 pGEX-6p-l/MIP重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli XLl-Blue,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的表達(dá)產(chǎn)物，與Glutathione Sepharose 4B beads結(jié)合，得到與Beads結(jié)合的GST-MIP融合蛋白復(fù)合物，再用特異性的GST融合蛋白剪切酶酶切復(fù)合物以去除GST標(biāo)簽，獲取游離的MIP蛋白。將Beads-GST-MIP復(fù)合物，酶切后上清、Beads洗脫液及酶切后的Beads均用12%SDS-PAGE膠電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖2所示，在相對分子質(zhì)量約53 KD處可見一清晰條帶，與預(yù)測的重組MIP融合蛋白相對分子質(zhì)量一致（GST相對分子質(zhì)量約26 KD，MIP相對分子質(zhì)量約27 KD）；酶切后無GST標(biāo)簽的純化蛋白MIP大量存在于酶切上清及洗脫液中，收集酶切后的上清及洗脫液，經(jīng)超濾離心管濃縮后結(jié)果見圖3。

圖2SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)和純化

圖3 無GST標(biāo)簽MIP蛋白純化終產(chǎn)物SDS-PAGE分析

2.3 小鼠血清抗衣原體EB特異性IgG及亞型檢測 重組表達(dá)的MIP蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體，能有效識別衣原體EB包被的ELISA反應(yīng)孔，而對照組小鼠血清未檢測出特異性的EB抗體；MIP蛋白免疫組小鼠，產(chǎn)生的IgG亞型與EB全菌免疫接種組類似，以IgG2a為主，且IgG2a/IgG1比值大于1，見圖 4。

圖4 抗血清中IgG滴度及亞型的檢測

2.4 MIP免疫可誘導(dǎo)特異性回憶反應(yīng) 小鼠免疫3次后，取脾細(xì)胞，體外用UV-EB、MIP蛋白或無關(guān)抗原（細(xì)胞培養(yǎng)基）刺激，測定脾細(xì)胞上清IFN-γ水平。MIP免疫組小鼠脾細(xì)胞受EB和MIP蛋白的刺激，均能產(chǎn)生異性回憶應(yīng)答，分泌的IFN-γ（Th1型細(xì)胞因子）水平明顯高于相應(yīng)的PBS對照組，見圖5。但用無關(guān)抗原（Medium）刺激時，IFN-γ水平與對照組相比無明顯變化。

圖5 MIP蛋白免疫對細(xì)胞因子IFN-γ產(chǎn)生的影響

3 討論

沙眼衣原體泌尿生殖道感染防治形勢日趨嚴(yán)峻，但目前仍缺乏有效疫苗[1]。許多Ct亞單位疫苗，如Ct主要外膜蛋白MOMP[6]、包涵體膜蛋白IncA[7]等被證實有一定的保護(hù)作用，但均不完全。這可能因為衣原體血清型別多、候選的抗原分子免疫原性不夠強(qiáng)或構(gòu)象復(fù)雜、易變異等因素有關(guān)；也可能因為衣原體生活周期復(fù)雜，單一抗原難以在Ct吸附、穿入、增殖、釋放等各環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。鼠衣原體動物實驗研究證實采用多種亞單位疫苗聯(lián)合免疫小鼠產(chǎn)生的保護(hù)性效果優(yōu)于單一疫苗，開發(fā)新的亞單位疫苗候選抗原將為聯(lián)合疫苗的研制提供更多選擇。

Ct致病機(jī)制不清是制約疫苗成功研制的重要因素之一。Wang等[8]采用體外融合表達(dá)的908個Ct開放讀碼框編碼蛋白，與99份Ct泌尿生殖道感染婦女的血清進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Ct MIP蛋白能被40%以上感染婦女血清優(yōu)勢識別，是衣原體自然感染過程中優(yōu)勢表達(dá)的抗原；Zeng等[9]的動物實驗亦證實MIP抗體在90%以上感染小鼠存在，其抗體滴度明顯高于MOMP、CPAF和Pgp3等優(yōu)勢抗原[9]。以上的研究均提示MIP蛋白與衣原體的感染致病密切相關(guān)，并可能是Ct潛在的新型亞單位疫苗候選分子。

本研究采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了pGEX-6p-1/MIP重組質(zhì)粒，并在E.coli中高效表達(dá)GSTMIP融合蛋白，經(jīng)GST融合蛋白剪切酶作用后，獲得了高濃度的無標(biāo)簽MIP純蛋白。純化的蛋白免疫接種小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的針對衣原體EB的特異性抗體，這與筆者前期報道的MIP單克隆抗體具有中和作用的結(jié)果一致，說明MIP免疫可提供抗衣原體感染的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答；抗體亞型以IgG2a和IgG1為主，二者比值大于1，這種抗體亞型的產(chǎn)生情況提示MIP蛋白免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答；MIP免疫小鼠的脾細(xì)胞，在體外接受EB和MIP抗原的刺激，能分泌高水平的IFN-γ，進(jìn)一步證實Th1型特異性回憶應(yīng)答的存在。已知Ct為胞內(nèi)感染菌，抗Ct感染的細(xì)胞免疫主要依賴于CD4+Th1型細(xì)胞反應(yīng)，CD4+Th1型細(xì)胞及Th1型細(xì)胞因子IFN-γ等在清除衣原體感染中起著極其重要的作用[10]。

總之，本實驗采用基因工程方法原核表達(dá)純化的MIP蛋白，不含GST標(biāo)簽、且純度高；接種小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體和效應(yīng)T細(xì)胞均能有效識別衣原體菌體EB，發(fā)揮免疫保護(hù)作用；加之，MIP蛋白結(jié)構(gòu)保守，在Ct各血清型廣泛分布，可望成為新型有效的Ct候選亞單位疫苗。