劉曉靜，陳曉佳，于立梅*，曾曉房，韓 珍

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣東中興綠豐發(fā)展有限公司，廣東河源 517000)

檸檬的利用價值極高，是加工各種產(chǎn)品的主要原材料。目前檸檬已經(jīng)被開發(fā)成多種產(chǎn)品，如檸檬凍干片、檸檬汁飲品、檸檬酒等。其中，檸檬凍干片采用了真空冷凍干燥技術(shù)，能夠較好地保持檸檬原有的色澤、香氣、味道、形態(tài)和各種生物活性營養(yǎng)成分，有效地解決了新鮮檸檬貯藏期短的問題，因此深受消費者的喜愛[1]。但由于檸檬本身含有豐富的褐變底物，僅是檸檬汁便含有(456±9)mg/L的VC、(89.8±2.0)mg/L的總酚和0.148 g/L的總糖[2]，因此在檸檬凍干片貯藏過程中這些底物將繼續(xù)反應(yīng)從而導(dǎo)致其出現(xiàn)人們所不期待的非酶褐變現(xiàn)象。目前研究非酶褐變產(chǎn)物的方法一般是根據(jù)美拉德(Maillard)反應(yīng)和酚類化合物以及抗壞血酸氧化均可生成褐色素的理論，以褐變度作為監(jiān)測指標(biāo)，采用醇提方法[3]。隨著褐變反應(yīng)的進行，營養(yǎng)物質(zhì)會生成醛、酮等還原性物質(zhì)，對食品具有一定的抗氧化能力，特別是對防止食品中油脂的氧化較為顯著[4]。因此，筆者研究檸檬凍干片褐變產(chǎn)物的提取工藝和進一步探索大孔吸附樹脂對其分離純化效果，旨在為檸檬凍干片褐變產(chǎn)物的分離純化和開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與主要試劑。檸檬凍干片，由廣東中興綠豐農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供；乙醇(分析純)、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)，均購于廣州一馬生物有限公司；大孔吸附樹脂(XAD16、HZ816、HPD722、D4020、D3520、AB-8)，購于鄭州和成新材料科技有限公司，物理性能見表1。

1.1.2主要儀器與設(shè)備。THZ-82/YLD-6000冷凍水浴恒溫振蕩器，金壇市中大儀器廠；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；XT-A500型多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；722N可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1單因素試驗

1.2.1.1料液比對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。隨機稱取1.0 g檸檬凍干片粉5份，按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)料液比加入50%乙醇溶液，研磨均勻后在70 ℃水浴振蕩浸提1.5 h，冷卻后真空抽濾過濾膜，稀釋一定倍數(shù)于波長420 nm下測定吸光值。

1.2.1.2乙醇濃度對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。隨機稱取1.0 g檸檬凍干片粉5份，按1∶30(g∶mL)料液比加入10%、30%、50%、70%、90%濃度的乙醇溶液，研磨均勻后在70 ℃水浴振蕩浸提1.5 h，冷卻后真空抽濾過濾膜，稀釋一定倍數(shù)于波長420 nm下測定吸光值。

1.2.1.3提取時間對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。隨機稱取1.0 g檸檬凍干片粉5份，按1∶30(g∶mL)料液比加入50%乙醇溶液，研磨均勻后在70 ℃水浴振蕩各浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，冷卻后真空抽濾過濾膜，稀釋一定倍數(shù)于波長420 nm下測定吸光值。

表1 大孔吸附樹脂物理性能

1.2.1.4提取溫度對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。隨機稱取1.0 g檸檬凍干片粉5份，按1∶30(g∶mL)料液比加入50%乙醇溶液，研磨均勻后分別在40、50、60、70、80 ℃下水浴浸振蕩提1.5 h，冷卻后真空抽濾過濾膜，稀釋一定倍數(shù)于波長420 nm下測定吸光值。

1.2.2正交試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行L9(34) 正交試驗，確定檸檬凍干片褐變產(chǎn)物提取的最佳工藝條件。正交試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.2.3大孔吸附樹脂的篩選。

1.2.3.1大孔吸附樹脂預(yù)處理。先用95%乙醇浸泡樹脂24 h，使其充分溶脹，除去表面懸浮小顆粒，過濾后用蒸餾水清洗至無白色混濁、無乙醇味且溶液顯中性，然后分別用5% HCl溶液和5% NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水清洗至中性，鋪平晾干水分，備用。

1.2.3.2靜態(tài)吸附試驗。稱取6種新鮮樹脂AB-8、D4020、D3520、HPD722、HZ816、XAD16各3 g于150 mL的三角錐形瓶中，分別加入等濃度40 mL的檸檬凍干片褐變產(chǎn)物粗提液，水浴恒溫振蕩24 h(110 r/min，30 ℃)，將吸附平衡液依次進行抽濾，取濾液在波長420 nm處測定吸光值，計算吸附率。

稱取6種已吸附飽和的大孔樹脂3 g，分別加入40 mL 80%的乙醇溶液，水浴恒溫振蕩24 h(110 r/min，30 ℃)，然后進行抽濾，取濾液在波長420 nm處測定吸光值，計算解吸率。對試驗結(jié)果進行方差分析，從而篩選出分離檸檬凍干片褐變產(chǎn)物最佳的大孔樹脂[5]。

式中，A0為吸附前粗提液吸光值；A為吸附后粗提液的吸光值；A1為解吸后樣品液的吸光值。

1.2.4數(shù)據(jù)分析。該研究所有試驗皆設(shè)置3個平行組，使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行正交處理以及方差分析(P<0.05)，結(jié)果采用Excel和Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和圖形處理。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1料液比對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。由圖1可知，隨著料液比中溶劑量的不斷增加，褐變度呈先下降后上升再降低的趨勢。當(dāng)料液比為1∶10(g∶mL)時，因溶液體積過少，且在加熱的情況下溶劑可能有所揮發(fā)，導(dǎo)致褐變度偏高；當(dāng)料液比為1∶40(g∶mL)時，此時褐變度為0.320，與其他料液比褐變度差異顯著(P< 0.05)。在一定范圍內(nèi)增加提取的溶劑量能提高擴散率，增加褐變產(chǎn)物的溶出量；但溶劑量過高，超出一定范圍，溶出率降低，因此選擇1∶40(g∶mL)作為最佳料液比。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters in the picture indicate significant differences at 0.05 level圖1 料液比對提取液褐變度的影響Fig.1 Influence of solid-liquid ratio on browning degree of extract

2.1.2乙醇濃度對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。雖然水的溶解范圍廣，成本較低且容易獲得，但其選擇性差，褐變產(chǎn)物溶出率低。有研究表明，使用適當(dāng)濃度的乙醇溶液能更穩(wěn)定地提取褐變產(chǎn)物[6]。由圖2可知，不同乙醇濃度對褐變產(chǎn)物褐變度差異顯著(P<0.05)。當(dāng)乙醇濃度達到70%時，褐變度最大，為0.766，當(dāng)乙醇濃度再進一步上升時，濃度過大，抑制褐變產(chǎn)物在溶劑中的溶出。因此，選擇乙醇濃度70%為最佳提取濃度。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters in the picture indicate significant differences at 0.05 level圖2 乙醇濃度對提取液褐變度的影響Fig.2 Influence of ethanol concentration on browning degree of extract

2.1.3浸提時間對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響。如圖3所示，隨著浸提時間的增加，褐變度先增加后下降。起始褐變度為0.588，且變化不顯著(P<0.05)。這是由于檸檬凍干片與溶液未能得到充分反應(yīng)，導(dǎo)致褐變產(chǎn)物溶出率低，繼續(xù)延長浸提時間，褐變度顯著升高(P<0.05)。當(dāng)浸提時間為2.0 h時，褐變度最高，為0.730，繼續(xù)浸提，褐變度極顯著下降(P<0.01)。因此，選擇浸提時間2.0 h為最佳提取時間。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters in the picture indicate significant differences at 0.05 level圖3 浸提時間對提取液褐變度的影響Fig.3 Influence of extraction time on browning degree of extract

2.1.4浸提溫度對褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響 。由圖4可知，隨著浸提溫度的升高，褐變度顯著上升后下降(P<0.05)。當(dāng)浸提溫度為60 ℃時，褐變度最高，為0.724，這是因為溫度過高，使得褐變產(chǎn)物結(jié)構(gòu)受到破壞。適宜的溫度能使褐變產(chǎn)物在乙醇溶液中得到穩(wěn)定地溶解[7]，因此，選擇60 ℃作為最佳的浸提溫度。

注：圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著Note:Different lowercase letters in the picture indicate significant differences at 0.05 level圖4 浸提溫度對提取液褐變度的影響Fig.4 Influence of extraction temperature on browning degree of extract

2.2正交試驗通過單因素試驗分析可知，料液比、乙醇濃度、浸提時間、浸提溫度對檸檬凍干片褐變產(chǎn)物的提取均有顯著影響(P<0.05)。因此，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取4因素3水平來進行正交試驗并對結(jié)果進行方差分析，以此選擇出最優(yōu)的組合，進而得到最優(yōu)的提取方案。

由表3可知，料液比、乙醇濃度、浸提時間和浸提溫度4個因素對檸檬凍干片褐變產(chǎn)物的提取均起到一定的作用，且4個因素對提取率的影響都達到了極為顯著的水平(P<0.01)。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，各因素對褐變產(chǎn)物的提取效果影響順序為A>B>C>D，即料液比的影響程度最大，其次是乙醇濃度，再者是浸提時間，而浸提溫度的影響作用最小。正交表中試驗號2號即組合A1B2C2D2的褐變度最大，且與其他試驗號結(jié)果差異顯著(P<0.05)，而正交分析得到最優(yōu)的組合為A1B2C3D3，通過驗證分析和結(jié)合各因素對褐變產(chǎn)物提取效果的影響結(jié)果和實際生產(chǎn)情況，將組合A1B2C2D2作為最優(yōu)的提取方案。因此，選取70%的乙醇溶液作為檸檬凍干片褐變產(chǎn)物的提取溶劑，并按照料液比1∶30(g∶mL)在60 ℃下浸提2 h作為最優(yōu)方案。

表3 L9 (34)正交試驗結(jié)果

2.3大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附試驗王明慧等[6]曾報道，褐變產(chǎn)物可能是一類弱極性或是非極性的混合物，因此該試驗選取了弱極性和非極性的大孔吸附樹脂作為研究對象。影響大孔吸附樹脂吸附的因素主要有上樣液的極性、分子大小、上樣液濃度和流速等，解吸因素則與洗脫溶劑的溶度、種類和流速等有關(guān)。

由于大孔吸附樹脂孔徑和粒徑各不相同，使得其存在不同的吸附率和解吸率現(xiàn)象[8]。由圖5可知，不同型號的大孔吸附樹脂的吸附能力和解吸能力大多有顯著性差異(P< 0.05)，非極性的樹脂吸附率與解吸率比弱極性的樹脂相對較高。大孔吸附樹脂對褐變產(chǎn)物的吸附率存在顯著性差異(P< 0.05)，其大小順序為D4020 >HZ816 >D3520 >XAD16 >HPD722 >AB-8，其中D4020的吸附率最大，達74.04%；除了XAD16與D4020之間的解吸率不存在顯著性差異(P< 0.05)，其余樹脂均存在顯著性差異(P< 0.05)，解吸率的大小順序為HPD722 >D3520 >D4020 >XAD16 >AB-8 >HZ816，其中HPD722的解吸率最大，為89.91%，D4020的解吸率為86.94%。雖然HPD722和D3520的解吸率高于其他樹脂，但是兩者的吸附率都較低，相對之下，D4020解吸率適中但吸附率最高，因此選取D4020大孔吸附樹脂作為最佳分離純化樹脂。

圖5 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附試驗Fig.5 Macroporous adsorption resin static adsorption test

3 結(jié)論與展望

該研究考察了料液比、乙醇濃度、浸提時間和浸提溫度對檸檬凍干片褐變產(chǎn)物提取液褐變度的影響，通過單因素試驗和正交試驗得到的最佳提取工藝為料液比為1∶30(g∶mL)，乙醇濃度70%，浸提時間2 h，浸提溫度60 ℃。對6種大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率進行靜態(tài)吸附試驗，得出最佳的大孔吸附樹脂為D4020，吸附率達74.04%，解吸率為86.94%，且與其他樹脂有顯著性差異(P< 0.05)。今后可以在該研究的基礎(chǔ)上對褐變產(chǎn)物進行再次純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并對其抗氧化成分進行研究與開發(fā)。