許青蓮，李少華,2，稅玉儒，楊華,3，李宣林，林洪斌*，邢亞閣

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)2(威遠縣市場監(jiān)督管理局，四川 內江，642450)3(宜賓西華大學研究院，食品非熱技術重點實驗室，食品非熱工程技術研究中心，四川 宜賓，644004)

檸檬(Citruslimon)屬蕓香科柑橘屬常綠小喬木，鮮果含有類黃酮、香豆素類等多種活性成分，具有降血壓、降血脂、抗氧化等功效[1-2]。四川安岳檸檬種植規(guī)模大、產量多[3]。檸檬是非呼吸躍變型果實，在運輸中可能會發(fā)生果蒂脫落、因運輸溫度太高而腐爛、貯藏時因CO2濃度不當而果實變味等現(xiàn)象[4]。針對上述易出現(xiàn)的問題，國內外學者研發(fā)多種檸檬貯藏保鮮技術，如低溫保鮮、氣調保鮮、留樹保鮮、涂膜保鮮等[5]。其中，殼聚糖精油的復合涂膜保鮮技術能夠抑制微生物生長和繁殖、控制果實腐爛，延長果蔬貨架期[6-8]。

目前，復合涂膜保鮮技術發(fā)展迅速，保鮮效果明顯。LIU等[9]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖-氯化鈣-抗壞血酸復合涂膜能有效抑制鮮切蘋果褐變及維持其硬度；邢亞閣等[10]發(fā)現(xiàn)殼聚糖/納米TiO2復合涂膜對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好。但是，殼聚糖復合涂膜保鮮液在檸檬方面的應用較少，劉清化等[11]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖與茶多酚對檸檬保鮮均有較好效果，但未深一步研究兩者共同作用對檸檬的保鮮效果。本文以殼聚糖為基質，添加抗褐變劑和植物精油制備成復合涂膜保鮮液應用于鮮切檸檬片，并優(yōu)化研究了最佳涂膜液配方。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

尤力克檸檬(Limoncv.Eureka)，采摘于安岳縣龍臺鎮(zhèn)；殼聚糖(脫乙酰度>90%)，濟南海得貝海洋生物有限公司；檸檬酸、抗壞血酸、CaCl2、冰乙酸、蔗糖脂肪酸酯、吐溫80(均為食品級)，鄭州市福泰程化工產品有限公司；丁香精油、肉桂精油，徐州艾佩斯商貿有限公司。

1.2 主要儀器設備

乳化剪切機、SH-3加熱磁力攪拌器，天津市泰斯特儀器有限公司；WF 32型手持色差儀，深圳威福光電科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

選取成熟新鮮、大小均勻、無病蟲害和機械損傷的檸檬整果，去頭去尾后留取中間部分并切分成厚度為5～8 mm的薄片，紗布擦去表面汁液，于復合保鮮涂膜液中浸泡2 min，撈出瀝干并裝盒包裝，在不同溫度條件下定期測定相關指標。

1.3.2 褐變度測定

參考祖鶴[12]的方法，稱取檸檬鮮切片果肉1.0 g，加入10 mL去離子水研磨勻漿后，4 ℃，6 000 r/min離心10 min，取上清液在410 nm下測定吸光度值A410，褐變度(BD)=10×A410。

1.3.3 色差測定

用色差儀測定鮮切檸檬片混合樣色度[12]，每個處理測定3個樣品，每個樣品測定3次。結果L、a、b采用公式(1)、(2)計算色差ΔE與ΔE′(ΔE越大處理效果越好；ΔE′越小處理效果越好)：

(1)

(2)

式中：ΔL，樣品處理組L與空白處理組L差值；Δa，樣品處理組a與空白處理組a差值；Δb，樣品處理組b與空白處理組b差值；ΔL′，樣品處理組貯藏8 d后L與初始L差值；Δa′，樣品處理組貯藏8 d后a與初始a差值；Δb′，樣品處理組貯藏8 d后b與初始b差值。

1.3.4 涂膜保鮮劑制備

分別取一定量的殼聚糖(1.00%)溶于含有0.5%乙酸的250 mL蒸餾水中[7,13]，室溫下磁力攪拌10 min后至完全溶解，加入抗褐變劑(0.5% CaCl2)，室溫攪拌10 min至完全溶解，加入乳化劑(0.1%蔗糖脂肪酸酯)完全溶解后再加入精油(0.1%丁香精油)，剪切速率為10 000 r/min，剪切時間為15 s，得到的溶液低溫避光平衡1 h備用。

1.3.5 涂膜保鮮劑單因素實驗

殼聚糖濃度設為0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%；抗褐變劑CaCl2、抗壞血酸、檸檬酸濃度均設為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%；抗菌成分丁香、肉桂精油濃度均設為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%；乳化劑吐溫-80、蔗糖脂肪酸酯濃度均設為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。上述各處理均以蒸餾水代替保鮮液作為空白組，每隔1 d測定褐變度與色差ΔE進行評價。

1.3.6 涂膜保鮮劑響應面試驗設計

以單因素實驗為基礎，繼續(xù)優(yōu)化復合涂膜保鮮液配方，選擇殼聚糖、CaCl2、丁香精油、蔗糖脂肪酸酯設計四因素三水平的BBD響應面試驗。對照組采用蒸餾水浸泡2 min，將處理后的檸檬片撈出控干表面水分進行裝盒包裝，(0±0.5)℃貯藏。以褐變度、色差ΔE′為響應值來優(yōu)化得出最佳涂膜配方。

1.3.7 數據處理

實驗數據由SPSS 22.0、Design Expert 9.0軟件分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 不同溫度下鮮切涂膜檸檬片褐變度的測定

鮮切涂膜檸檬片褐變度隨著貯藏時間而增加，且不同貯藏溫度褐變度變化程度不同。如圖1、圖2所示，10 ℃貯藏條件下，鮮切涂膜檸檬片褐變度始終最大，貯藏6 d后褐變度值為1.67，第8天時檸檬片出現(xiàn)腐敗變質不可繼續(xù)貯藏。0 ℃貯藏6 d時與其他溫度貯藏褐變度差異顯著(P<0.05)，褐變度值為1.18，囊衣出現(xiàn)輕微變黃，可能是因為檸檬汁液的滲出。貯藏到10 d時，0與4、7 ℃差異極顯著(P<0.01)，4 ℃和7 ℃無顯著性差異(P>0.05)，3個溫度的褐變度值分別達到1.81、2.2、2.3。低溫0 ℃和冷藏4 ℃能夠有效抑制氧化過程形成醌類物質，能有效控制鮮切涂膜檸檬片貯藏過程中褐變度[14]。

圖2 不同貯藏天數對鮮切檸檬片的影響Fig.2 Appearance image of fresh-cut lemon after coated with composite membrane liquid at different storage days

2.1.2 不同濃度殼聚糖對鮮切檸檬片褐變的影響

殼聚糖具有阻水性、選擇透氣性，能在檸檬表面成膜防止水分散失，給檸檬創(chuàng)造穩(wěn)定的濕度環(huán)境[15-16]。通過不同濃度殼聚糖制備保鮮液探究鮮切檸檬在低溫貯藏8 d后的褐變情況，如圖3所示。殼聚糖濃度小于1.25%時，褐變度隨著濃度增加而下降，濃度為1.25%～1.50%時褐變度上升。

圖3 殼聚糖濃度對鮮切檸檬片褐變度、色差(ΔE)的影響Fig.3 Effects of concentration of chitosan on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

不同濃度殼聚糖涂膜液貯藏下檸檬色差ΔE隨著濃度上升而上升，其中1.25%與1.50%處理后的色差ΔE無顯著差異(P>0.05)，表明低濃度膜的透明度較高、透光性好。孫莎[17]研究也表明1.50%殼聚糖制得的復合涂膜透光性能較好，但綜合褐變度，添加1.25%殼聚糖制備的保鮮液對鮮切檸檬褐變抑制效果較好。

2.1.3 不同濃度抗褐變度對鮮切檸檬片褐變的影響

不同濃度CaCl2、抗壞血酸和檸檬酸對鮮切檸檬褐變和色差ΔE抑制效果如圖4。濃度為0.3%的CaCl2涂膜保鮮液的褐變度最小，色差ΔE最大，褐變抑制效果最佳，這與張小琴[18]和KUKURA[19]研究結果稍有不同，可能是檸檬pH低于水蜜桃和皇冠梨，Ca2+與細胞壁的果膠酸結合度不同，降低褐變與水分散失的程度不同。

a-褐變度；b-色差圖4 不同抗褐變劑濃度對鮮切檸檬片褐變度和色差(ΔE)的影響Fig.4 Effects of concentration of anti-browning agent on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

較對照處理組，各濃度抗褐變劑的褐變度均有顯著差異(P<0.05)，其中0.3% CaCl2處理組褐變度與其他處理組均差異顯著(P<0.05)，其他處理組褐變度間結果不顯著(P>0.05)；抗壞血酸褐變度低濃度(0.1%、0.3%)、高濃度(0.9%)與較高濃度(0.5%、0.7%)之間差異顯著(P<0.05)，但低濃度與高濃度間無顯著性差異(P>0.05)；0.1%檸檬酸的褐變度最低，與0.3%、0.9%檸檬酸褐變度無顯著性差異(P>0.05)，但0.1%檸檬酸褐變度與對照組、0.5%、0.7%檸檬酸處理組差異顯著(P<0.05)。

不同濃度CaCl2色差ΔE均有顯著差異(P<0.05)，其中0.3% CaCl2處理組色差與其他處理組均差異顯著(P<0.05)，其他處理組色差ΔE之間結果不顯著(P>0.05)；抗壞血酸組色差ΔE在0.1%、0.7%與0.5%、0.9%之間差異顯著(P<0.05)；檸檬酸的對照處理組色差ΔE與其他濃度處理組之間差異顯著(P<0.05)，但各濃度處理組之間僅0.1%與0.3%差異顯著(P<0.05)，色差結果不同可能是由于鮮切檸檬片果肉中本身含有豐富的檸檬酸和抗壞血酸，且含不同濃度檸檬酸、抗壞血酸的保鮮液涂膜后含量分布不均勻，導致作用效果不同。

檸檬酸是一種金屬螯合劑，能夠有效抑制多酚氧化酶活性[20]，從而有效抑制鮮切檸檬片貯藏后的褐變度?？箟难岷蜋幟仕崾莾深惓Ｓ每寡趸瘎?，檸檬本身含量較為豐富，LIU等[9]研究發(fā)現(xiàn)CaCl2與殼聚糖復合作用對褐變抑制效果更佳，因此，0.3% CaCl2處理效果較好。

2.1.4 不同濃度精油對鮮切檸檬片褐變的影響

在涂膜液中添加不同濃度丁香、肉桂精油確定最適精油種類與濃度，結果如圖5所示。

a-褐變度；b-色差圖5 不同精油濃度對鮮切檸檬片褐變度和色差的影響Fig.5 Effects of concentration of essential oil on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

空白對照組與各濃度丁香精油、肉桂精油之間褐變度均差異顯著(P<0.05)，在各濃度丁香精油處理組中，0.10%與其他濃度組褐變度差異顯著(P<0.05)，0.05%與0.15%褐變度差異不顯著(P>0.05)，0.20%與0.25%褐變度差異不顯著(P>0.05)，0.10%丁香精油處理組褐變度最低，為1.42。但0.05%、0.10%、0.15%肉桂精油處理組貯藏8 d后褐變度與高濃度(0.20%、0.25%)處理組結果之間差異顯著(P<0.05)，肉桂精油處理組中褐變度最低值僅為1.83(0.25%肉桂精油)。

空白對照組與各濃度2種精油處理組色差值之間均差異顯著(P<0.05)，不同濃度丁香精油處理組的色差ΔE最大為1.1(濃度為0.20%)，0.10%色差ΔE與0.05%、0.20%之間差異顯著(P<0.05)。而肉桂精油低濃度(0.05%、0.10%)處理組色差與其他3個濃度處理組色差ΔE結果之間差異顯著(P<0.05)。肉桂精油較空白處理組色差ΔE最大僅為0.8(肉桂濃度0.25%)。

由于精油濃度香氣濃郁，檸檬鮮切后本身氣味散失，為保持檸檬特殊風味，僅添加少量精油可抑制貯藏過程中微生物增長，丁香精油中的主要抑菌活性物質是丁香酚[21]。綜上，0.1%丁香精油較符合。

2.1.5 不同濃度乳化劑對鮮切檸檬片褐變的影響

聚山梨酯-80(又稱吐溫-80)和蔗糖脂肪酸酯(簡稱蔗糖酯)是廣泛應用于涂膜材料中的乳化分散劑，能夠促進混合保鮮液體系的穩(wěn)定性、均勻性。在殼聚糖復合涂膜保鮮液中添加不同濃度吐溫-80和蔗糖酯來確定最佳種類和濃度，結果如圖6所示。

a-褐變度；b-色差圖6 不同乳化劑濃度對鮮切檸檬片褐變度和色差的影響Fig.6 Effects of concentration of ascorbic acid on browning degree and ΔE of fresh-cut lemon

不同濃度吐溫-80、蔗糖酯保鮮液處理的鮮切檸檬貯藏8 d后的褐變度變化不一，其中濃度為0.10%的蔗糖酯的抑制效果較好，褐變度值為1.57，且與其他濃度處理組褐變度結果差異顯著(P<0.05)。吐溫-80處理后的褐變度較空白對照組均下降，其中0.20%吐溫-80褐變度值最低為1.67，褐變度也略大于0.10%蔗糖酯處理組。在乳化劑濃度大于0.20%時，鮮切檸檬褐變度隨濃度增加而上升，其可能原因是乳化劑的加入使保鮮液體系更加穩(wěn)定，膜的阻水性隨乳化劑濃度增大呈現(xiàn)出先增大后降低趨勢[22]，在濃度為0.2%時阻水性最佳，影響褐變度呈現(xiàn)出先減小后增大趨勢。

蔗糖酯色差ΔE結果在各濃度處理組之間0.05%與0.10%、0.25%差異顯著(P<0.05)，0.10%、0.15%、0.20%、0.25%色差ΔE結果之間不存在顯著性差異(P>0.05)，0.10%蔗糖酯對應色差ΔE最大為0.85。0.05%吐溫-80處理后的色差ΔE與其他處理濃度均具有顯著性差異(P<0.05)，而0.10%與0.15%、0.20%、0.25%之間均無顯著性差異(P>0.05)，0.15%吐溫-80對應色差ΔE最大為0.83，2類乳化劑的色差ΔE與空白組相差最大的為0.10%蔗糖酯。

2.2 響應面結果分析

2.2.1 響應面試驗設計

根據單因素實驗，選擇殼聚糖濃度(A)、CaCl2濃度(B)、丁香精油濃度(C)和蔗糖脂肪酸酯濃度(D)，這4個復合膜主要成分的因素，采用響應面分析，確定4因素對復合膜涂膜鮮切檸檬片貯藏后褐變度和色差ΔE′的影響。中心組合試驗設計與結果如表1、表2所示。

表1 Box-Benheken響應面試驗設計因素與水平Table 1 Box-Benheken response surface test design factors and levels

運用Design-Expert.V8.0.6軟件，設計出4因素水平的響應面試驗，共有27組，其中析因點24個，零點3個。3個零點為中心重復試驗，用來估算誤差。

表2 中心組合試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of center combination

2.2.2 褐變度響應面分析

對表2復合涂膜檸檬保鮮后測定褐變度進行多元回歸分析，得到褐變度的多元二次響應回歸方程(3)：

褐變度=1.55+0.026A-0.057B-0.061C-0.075D+(2.5E-3)AB-0.052AC+0.052AD-(2.5E-3)BC+0.1BD+0.092CD+0.12A2+0.14B2+0.18C2+0.18D2

(3)

由表3可知，模型的F值為7.841，P值為0.000 5，該模型顯著，R2為0.901 5，失擬項p=0.105 3>0.05，不顯著，模型擬合較好。預測R2為0.786 5，結果一般。CaCl2濃度、丁香精油濃度和蔗糖脂肪酸酯濃度，三者在一次項和二次項中P值均小于0.05，說明這3個因素對復合膜涂膜鮮切檸檬片褐變度均為顯著影響。同時，CaCl2與蔗糖脂肪酸酯、丁香精油與蔗糖脂肪酸酯的交互作用顯著(P<0.05)。相互作用對褐變度影響顯著的響應面三維曲面圖和等高線圖見圖7、圖8。

表3 褐變度回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for the quadratic polynomial model of browning degree

注：R2=0.901 5,AdjR2=0.786 5,PredR2=0.44,Adeq Precision=11.323。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,下同。

圖7為殼聚糖和丁香精油固定在零點濃度時，褐變度隨著CaCl2和蔗糖酯交互作用的結果。當CaCl2濃度一定時，褐變度隨著蔗糖酯濃度增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢；蔗糖酯濃度一定時，褐變度對蔗糖酯濃度變化不明顯，兩者交互作用不是很明顯。從等高線結果看，褐變度最低的CaCl2濃度在0.20%～0.48%，蔗糖酯濃度在0.07%～0.14%。

a-三維圖；b-等高線圖圖7 氯化鈣和蔗糖酯交互作用對褐變度的影響Fig.7 Interactive effect of CaCl2 and sugar esters concentration on BD

圖8為1.25%殼聚糖和0.30% CaCl2濃度條件下，丁香精油和蔗糖酯濃度的交互作用情況。當丁香精油濃度一定時，褐變度隨蔗糖酯濃度增加表現(xiàn)為先降低再增加的趨勢，并且蔗糖酯濃度一定時，褐變度變化趨勢和丁香精油濃度一定時一致。從等高線結果看，丁香精油濃度在0.07%～0.14%，蔗糖酯濃度在0.07%～0.14%，褐變度最低。

a-三維圖；b-等高線圖圖8 丁香精油和蔗糖酯交互作用對褐變度的影響Fig.8 Interactive effect of clove essential oil and sugar esters concentration on BD

2.2.3 色差響應面分析

對表2復合涂膜檸檬保鮮后測定色差進行多元回歸分析，得到色差ΔE′的多元二次響應面回歸方程(4)：

ΔE′=0.083-0.06A-0.095B+0.23C-0.19D+0.15AB+0.017AC-0.013AD-0.02BC+0.06BD+0.34CD+0.23A2+0.3B2+1.68C2+0.43D2

(4)

表4 色差ΔE′回歸模型方差分析表Table 4 ANOVA for the quadratic polynomial model of ΔE′

注：R2=0.981 9,AdjR2=0.960 8,PredR2=0.896 7,Adeq Precision=20.305。

由表4得知，模擬項P值<0.000 1，模型極顯著，R2為0.981 9，失擬項p>0.05，不顯著，說明模型擬合較好，性噪比20.305﹥4，即性噪比大于臨界值，由此可知模型可行。C、D、CD、A2以及B2的P值均﹤0.05，說明丁香精油和蔗糖脂肪酸酯對鮮切檸檬片涂膜復合保鮮液后色差均影響顯著。

圖9為丁香精油和蔗糖酯交互作用對色差ΔE′的影響。結果表明，當丁香精油一定時，色差ΔE′隨蔗糖酯濃度增加逐漸變小；當蔗糖酯濃度一定時，色差ΔE′隨丁香精油濃度的增加表現(xiàn)先降低后升高，表明蔗糖酯與丁香精油濃度交互作用明顯，蔗糖酯能夠使丁香精油均勻分散在復合涂膜保鮮液中，增加復合膜液的透明度從而降低色差ΔE′。

a-三維圖；b-等高線圖圖9 蔗糖酯和丁香精油交互作用對色差ΔE′的影響Fig.9 Interactive effect of sugar and clove essential oil concentration on ΔE′

2.2.4 響應面試驗結果及最佳涂膜保鮮配方驗證

運用Design Expert進行分析，確定以褐變度最低，色差ΔE′在可接受范圍內為標準，預測出殼聚糖濃度1.23%，CaCl2濃度0.33%，丁香精油濃度0.10%，蔗糖酯濃度0.11%。褐變度為1.54，色差ΔE′為0.050。以預測參數進行驗證試驗，平行處理3組，將鮮切檸檬片浸泡于復合涂膜保鮮液2 min后撈出、瀝干，0 ℃保鮮貯藏8 d后測定褐變度和色差ΔE′。測得復合涂膜保鮮液的檸檬片褐變度為1.50，色差ΔE′為0.054。實際值與預測值差異不顯著，模型可靠。

3 結論

通過單因素試驗，篩選出殼聚糖、CaCl2、丁香精油和蔗糖酯因素進行四因素三水平的響應面分析法確定最佳涂膜保鮮液配方。以褐變度、色差ΔE′為響應值建立模型，得出回歸方程。結果表明，丁香精油和蔗糖酯存在明顯的交互作用，對褐變度和色差ΔE′影響均顯著(P<0.05)。對2個回歸方程進行聯(lián)合求解，得到褐變度最低，色差ΔE′適宜的復合膜液最佳配方，即殼聚糖濃度1.23%，CaCl2濃度0.30%，丁香精油濃度0.10%，蔗糖酯濃度0.10%。模型預測褐變度和色差ΔE′結果分別為1.55、0.050。最佳配方的實驗測定褐變度為1.50，色差ΔE′為0.054。預測值與實際值相對偏差分別為3.3%、7.4%，模型可靠。結論為將復合涂膜保鮮液配方應用于鮮切檸檬片品質保持提供數據與理論依據。