張 齊 ， 李云濤 ， 汪立平 *

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

褐藻膠（Alginate）是由 β-1，4-D-甘露糖醛酸（M）和α-1，4-L-古羅糖醛酸 （G）兩種單體通過(guò)1，4-糖苷鍵鏈接而成的線性多糖聚合物，主要來(lái)自于海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻類植物[1]。近年來(lái)，褐藻膠的酶解產(chǎn)物褐藻膠寡糖因其能促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)[2]、能促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)[3]、抗氧化活性[4]、抗病原體[5]等生理活性而受到越來(lái)越多的關(guān)注。

褐藻膠裂解酶能通過(guò)β消去機(jī)制催化褐藻膠的降解成寡糖和不飽和的糖醛酸，其作用位點(diǎn)是1，4糖苷鍵[6]。褐藻膠裂解酶主要來(lái)源于海洋藻類、海洋軟體動(dòng)物和海洋微生物[7]。

褐藻膠裂解酶可直接將彈性的褐藻藻體轉(zhuǎn)變?yōu)闈{狀，同時(shí)釋放出降解的褐藻膠寡糖，而這種將褐藻變成高附加值原料的技術(shù)關(guān)鍵在于褐藻膠裂解酶。為了大規(guī)模的應(yīng)用褐藻膠裂解酶來(lái)降解褐藻，需要提供大量低成本的酶。目前，相對(duì)于細(xì)菌來(lái)源的褐藻膠裂解酶，軟體動(dòng)物來(lái)源的褐藻膠裂解酶的研究較少；目前已經(jīng)從角蠑螺Turbo cornutus[8]、濱螺Littorina sp.[9]、 黑斑海兔 Littorina brevicula[10]、皺紋盤鮑Haliotis discus hannai[11-12]等軟體動(dòng)物分離出褐藻膠裂解酶。雖然人們已經(jīng)反復(fù)研究了軟體動(dòng)物來(lái)源的褐藻膠裂解酶的常規(guī)生化特性，但目前僅成功克隆了皺紋盤鮑Haliotis discus hannai[11]、短濱螺Aplysia kurodai[13]、黑斑海兔Littorina brevicula[14]少數(shù)種類軟體動(dòng)物褐藻膠裂解酶的基因。皺紋盤鮑重組蛋白為包涵體，復(fù)性后沒(méi)有活性，短濱螺、黑斑海兔重組酶的比酶活分別為1 147.2 U/mg和2 100 U/mg；均具有多聚甘露糖醛酸底物特異性。

本研究中，以鮑魚來(lái)源的一種適冷性和多聚甘露糖醛酸底物特異性的褐藻膠裂解酶為研究對(duì)象，參考皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶的cDNA序列，通過(guò)RT-PCR克隆到編碼鮑魚褐藻膠裂解酶成熟肽的cDNA片段，將其連接至pET-28a（+）原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)；純化了重組蛋白，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種 大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）：購(gòu)自北京天根生物科技公司；克隆載體pEASY-T3：購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pET-28a（+）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Total RNA Extractor（Trizol）試劑盒、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、甲叉雙丙烯酰胺、Tris base、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)G250、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶Bam HI和Nde I，T4 DNA連接酶：購(gòu)自New England Biolabs；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Taq PCR MasterMix：購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒：購(gòu)自全式金生物有限公司；蛋白質(zhì)純化Ni-NTA Agarose：購(gòu)自QIAGEN。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 algl基因克隆 取適量新鮮肝胰腺組織，使用Total RNA Extractor試劑盒提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280鑒定，紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)其濃度后貯于-80℃冰箱備用。用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成第一鏈cDNA。參考皺紋盤鮑褐藻膠裂解 酶 的 核 苷 酸 序 列 （GenBank：AB110094.1），用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)正向引物AlgF（5'-GCTGCGGCA GAAAGTCGACCAG-3'）和反向引物AlgR（5'-GATGTGGCGTGTACATG-3'），用以擴(kuò)增鮑魚褐藻膠裂解酶的全長(zhǎng)cDNA。采用T-A克隆法，將擴(kuò)增得到的cDNA連接到pEASY-T3載體，將連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10后，涂布于含氨芐青霉素和IPTG的抗性平板，37℃靜置培養(yǎng)16～20 h。通過(guò)藍(lán)白班篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pEASYT3-algl。

1.2.2 pET-28a-algl表達(dá)載體構(gòu)建 提取pEASYT3-algl質(zhì)粒，以其為模板，設(shè)計(jì)分別添加Nde I和Bam HI酶切位點(diǎn)的正向引物ExF （5'-CGAACAATGTATTGTGACACATAAAG-3'）和反向引物 ExR（5'-GATGTTGGATCCTACATG TGTACA-3'）對(duì)編碼algl成熟肽的cDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的片段進(jìn)行Nde I、Bam HI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳割膠回收目的片段，將其與用同樣酶處理過(guò)的表達(dá)載體pET-28a按15∶1連接，在T4 DNA連接酶作用下，16℃保溫16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌TOP10，通過(guò)菌落PCR、雙酶切和DNA測(cè)序?qū)χ亟M表達(dá)載體pET-28a-algl進(jìn)行篩選。

1.2.3 algl基因的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒pET-28aalgl提純后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于10 mL含50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，取1 mL轉(zhuǎn)接入100 mL含50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，取1 mL菌液做未誘導(dǎo)對(duì)照；剩余培養(yǎng)液加入IPTG至1 mmol/L，28℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)6 h，菌液10 000 r/min離心10 min，4℃離心收集菌體，菌體重懸于10 mL裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，20% 甘 油 ，1%Trition X-100），用超聲波破碎菌體，破碎條件：破碎功率150 W，工作/間隙時(shí)間為4 s/8 s，時(shí)間15 min，冰浴。破碎液10 000 r/min、4℃離心10 min，分別收集上清液、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 包涵體蛋白純化、復(fù)性 包涵體重懸于2 mL溶解緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L尿素，12 mmol/L 2-巰基乙醇），室溫下不停攪拌1 h。13 000 r/min、離心15 min，4℃離心收集上清液，去除沉淀。

先用4 mL平衡Ni-NTA resin，緩慢倒入2 mL包涵體溶解液，使蛋白質(zhì)與Ni-NTA樹脂充分結(jié)合（4 ℃，150 r/min，1 h），隨后用 5 mL 漂洗緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L 尿素 ，10 mmol/L咪唑）漂洗兩次來(lái)洗掉未結(jié)合成分，最后用1 mL洗脫緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L 尿素，250 mmol/L咪唑）將重組蛋白Algl洗脫下來(lái)。

通過(guò)Ni-NTA純化得到的重組蛋白Algl逐滴滴加到10 mL復(fù)性緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5 mmol/L還原型谷胱甘肽，1 mmol/L氧化型谷胱甘肽）中至蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度20 μg/mL，4℃下不停的攪拌24 h。將蛋白質(zhì)溶液放入處理好的透析袋中，兩端用細(xì)線系好，將透析袋放入裝有50mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）的燒杯，4 ℃攪拌透析 24 h。透析后的蛋白質(zhì)溶液即為復(fù)性的重組蛋白Algl溶液，用于酶活測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.2.5 酶活力測(cè)定 褐藻膠裂解酶酶活力測(cè)定參照Preiss方法[15]，將0.1 mL酶液加入2.9 mL體積分?jǐn)?shù) 0.1%褐藻酸鈉 （50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中混合，在35℃下保溫20 min后測(cè)量反應(yīng)前后在235 nm處的吸光度值。在235 nm處反應(yīng)液吸光度值每分鐘增加0.01定義為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.6 溫度、pH對(duì)褐藻膠裂解酶活性及穩(wěn)定性的影響 重組蛋白最適催化溫度和溫度穩(wěn)定性測(cè)定，將0.1 mL酶液添加到2.9 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%海藻酸鈉溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中，在 20～70℃水浴條件下反應(yīng)20 min后測(cè)定酶活，將最高酶活力設(shè)為100%；將酶液放置在不同的溫度下保溫1 h后按1.2.5測(cè)定殘余酶活力，將初始酶活力設(shè)為100%。

重組蛋白最適催化pH值和pH穩(wěn)定性測(cè)定，將0.1 mL酶液添加到2.9 mL不同pH的0.1%海藻酸鈉溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 3.0～10.6）中，在 35℃保溫20 min后測(cè)定酶活，將最高酶活力設(shè)為100%；將酶液添加到不同pH的緩沖液中冰浴1 h后按1.2.5測(cè)定酶的殘余活力，將初始的酶活力設(shè)為100%。

1.2.7 EDTA、金屬離子對(duì)酶活的影響 將金屬離子 化 合 物 KCl、NaCl、CaCl2、MnCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、ZnCl2和 EDTA、SDS 分別加入 Tris-HCl（50mmol/L，pH 8.0）中配制成1 mmol/L的溶液，以添加相同體積水作為對(duì)照組，調(diào)節(jié)pH至8.0，測(cè)定不同反應(yīng)體系下的酶活力。

1.2.8 褐藻膠裂解酶底物特異性以及動(dòng)力學(xué)測(cè)定多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）、不規(guī)則雜合片段（pMG）的制備參照Gacesa[16]的方法。將海藻酸鈉、多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）、不規(guī)則雜合片段（pMG）四種底物加入Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0）配成0.1%的反應(yīng)液，按1.2.4方法測(cè)定不同時(shí)間的吸光度值。

重組酶動(dòng)力學(xué)分析，通過(guò)測(cè)定酶在Tris-HCl緩沖液 （pH 8.0）中不同底物質(zhì)量濃度 [S]（0.625～5.0 mg/mL）下的反應(yīng)速度V來(lái)確定酶催化的最大速度Vmax和米氏參數(shù)Km。取2.9 mL不同濃度的海藻酸鈉溶液加入0.1 mL酶液，總反應(yīng)體系3 mL，于35℃保溫20 min，再測(cè)定反應(yīng)液在235 nm處的吸光度值。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk），將反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V對(duì)底物濃度的倒數(shù)1/[S]作圖，通過(guò)計(jì)算橫截距和縱截距求出米氏常數(shù)Km和Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 algl基因的克隆

以鮑魚肝胰腺第一鏈cDN為模板，用一對(duì)根據(jù)皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)的特異性引物AlgF、AlgR，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到algl的cDNA，見(jiàn)圖1。將其與pEASY-T3載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)藍(lán)白斑篩選得到的陽(yáng)性克隆子pEASY-T3-algl進(jìn)行DNA測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明，該片段全長(zhǎng)822 bp，編碼273個(gè)氨基酸algl基因GenBank登錄號(hào)為：KP406582。

圖1 鮑魚肝胰腺總RNA和algl基因PCR擴(kuò)增Fig.1 Total RNA of abalone hepatopancreas and PCR amplification of algl gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pEASY-T3-algl為模板，以ExF、ExR為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到編碼Algl成熟肽片段，將Algl成熟肽片段和pET-28a經(jīng)Nde I和Bam HI雙酶切及純化回收后，通過(guò)T4 DNA連接酶連接后得到重組表達(dá)載體pET-28a-algl。通過(guò)菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在約 1 060 bp處有清晰條帶，見(jiàn)圖2（a），與理論相符；進(jìn)一步對(duì)該載體采用Nde I和Bam HI雙酶切處理，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，該載體經(jīng)雙酶切后存在兩條譜帶，其中一條約為780 bp的譜帶屬于目的片段，見(jiàn)圖2（b）；最后通過(guò)DNA測(cè)序，結(jié)果顯示目的基因沒(méi)有突變并且讀碼框正確。

圖2 重組表達(dá)載體pET-28a-algl的菌落PCR雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant expression vector pET-28a-algl by PCR and restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 、鑒定及包涵體的純化

含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-algl的大腸桿菌BL21（DE3）在 28 ℃、1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng) 6 h后，成功表達(dá)了重組蛋白Algl（圖3，泳道2）。細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后，通過(guò)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)以包涵體形式存在（圖3，泳道4）。包涵體蛋白質(zhì)溶解，變性條件下經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱親和層析純化后，復(fù)性、透析得到重組褐藻膠裂解酶（圖3，泳道5）。由圖3可以看出，重組蛋白Algl相對(duì)分子質(zhì)量大約32 000，與預(yù)期的融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量一致。純化后的重組蛋白Algl測(cè)定酶活為15.6 U/mL，比酶活為644.6 U/mg。

2.4 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

酶最適的反應(yīng)溫度通過(guò)測(cè)定其在不同溫度下酶活力確定。由圖4知，酶的最適反應(yīng)溫度35℃，其酶活為15.6 U/mL。在30～40℃范圍內(nèi)有較高的催化活性，當(dāng)溫度降低到20℃或升高到50℃時(shí)，酶活力都迅速下降。酶的溫度穩(wěn)定性見(jiàn)圖4。酶在40℃及以下較穩(wěn)定，40℃處理1 h后殘留酶活力為初始值的59.7%；而當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，殘留酶活力下降很快，在60℃下處理1 h，酶幾乎失活；表明該褐藻膠裂解酶Algl的溫度穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。

圖3 Alyl的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of Alyl

圖4 Alyl最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and thermostability of Alyl

2.5 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

酶最適反應(yīng)的pH通過(guò)測(cè)定其在不同pH下酶活力確定，結(jié)果見(jiàn)圖5。最適酶反應(yīng)pH條件為8.0，其酶活為15.6 U/mL。當(dāng)pH為7.0時(shí)，酶活力為峰值的61.9%，而當(dāng)pH升高到9.0時(shí)，酶活力僅為峰值的32.1%。當(dāng)褐藻膠裂解酶在pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)處理1 h后，殘留酶活力能達(dá)到60%以上，pH值再降低或升高時(shí)殘余酶活力較低，當(dāng)pH降到4.0或升高到10.0時(shí)，殘留酶活力幾乎為零。此酶是一個(gè)嗜堿酶。

2.6 EDTA、金屬離子對(duì)酶活力影響

在酶的反應(yīng)底物中加入1 mmol/L的EDTA、SDS和不同的金屬離子化合物，測(cè)定其酶活；以不加任何離子時(shí)的酶活力15.6 U/mL為100%。根據(jù)表1，K+、Na+、Ca2+、Mn2+對(duì)酶活有激活作用，K+對(duì)酶活的刺激作用最大，可使酶活提高19%；而Mg2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+對(duì)酶活有抑制作用，Zn2+的抑制作用在金屬離子中最強(qiáng)。 EDTA、SDS對(duì)酶活的抑制相對(duì)于金屬離子的作用更明顯。

圖5 Algl的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性Fig.5 Optimal pH and atability of Algl

表1 金屬離子對(duì)酶活的影響Table 1 Effect of metal cations on AlgL activity

2.7 底物特異性

四種底物用來(lái)研究褐藻膠裂解酶的底物特異性，結(jié)果見(jiàn)圖6。發(fā)現(xiàn)酶與多聚甘露糖醛酸的反應(yīng)液在波長(zhǎng)235 nm處的吸光度變化值最高，海藻酸鈉、不規(guī)則雜合片段吸光度值變化依次減小，而在多聚古洛糖醛酸中吸光度沒(méi)有發(fā)生變化。表明褐藻膠裂解酶Algl具有多聚甘露糖醛酸底物特異性，不能降解多聚古洛糖醛酸。

圖6 酶的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of AlgL

2.8 酶催化動(dòng)力學(xué)

以不同質(zhì)量濃度的海藻酸鈉為底物，測(cè)定重組酶的酶活。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，將酶活力的倒數(shù)1/V對(duì)底物濃度的倒數(shù)1/[S]作圖，得到一條直線，結(jié)果見(jiàn)圖7。通過(guò)計(jì)算直線與縱軸的截距得到最大反應(yīng)速度Vmax=19.08 U/mL，直線與橫軸的截距得到米氏常數(shù)Km=1.71 mg/mL。

圖7 Algl水解褐藻膠的Lineweaver－Burke雙倒數(shù)圖Fig.7 Lineweaver－Burke plots of the alginate degradation by the Algl

3 結(jié)語(yǔ)

從鮑魚肝胰腺中提取RNA，通過(guò)RT-PCR得到褐藻膠裂解酶（algl）的cDNA，將其構(gòu)建到pET-28a（+）上并在大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行高效誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體超聲波破碎后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)，該蛋白質(zhì)以包涵體的形式表達(dá)。包涵體的形成主要是蛋白質(zhì)合成速度過(guò)快，沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊；對(duì)含二硫鍵較多的重組蛋白質(zhì)而言，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的還原環(huán)境抑制二硫鍵的形成；重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺乏一些蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中所需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，是包涵體形成的又一原因[17]。

包涵體在變性條件下用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱親和層析純化，將純化后的重組蛋白質(zhì)復(fù)性，繼而對(duì)其進(jìn)行活性檢測(cè)和酶學(xué)特性研究。純化后的Algl測(cè)定其酶活為15.6 U/mL，比酶活為644.6 U/mg，低于報(bào)道中短濱螺（1 147.2 U/mg）、黑斑海兔（2 100 U/mg）比酶活。在pH 8.0時(shí)酶活力達(dá)到最大值，屬于嗜堿性酶；底物特異性分析表明，褐藻膠裂解酶Algl具有多聚甘露糖醛酸底物特異性，不能降解多聚古洛糖醛酸；據(jù)報(bào)道，短濱螺和黑斑海兔來(lái)源的褐藻膠裂解酶同樣只具有多聚甘露糖醛酸底物特異性[12-13]，所以Algl與其他軟體動(dòng)物來(lái)源的褐藻膠裂解酶同屬于多糖裂解酶家族14（PL14）。Algl最適溫度35℃，且在20～30℃處有60%以上的酶活性保留，則該酶具有適冷性，熱不穩(wěn)定性；而報(bào)道中短濱螺和黑斑海兔來(lái)源的褐藻膠裂解酶最適溫度分別為55℃和50℃[12-13]。重組酶Algl的這種適冷性和熱不穩(wěn)定性可以很好的用于工業(yè)生產(chǎn)，低溫反應(yīng)的酶可以降低因加熱而產(chǎn)生的生產(chǎn)成本，熱不穩(wěn)定性對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)是很有利的，只需要適當(dāng)?shù)奶岣邷囟染涂梢院苋菀缀瓦x擇性的滅活。