吳青一 瞿燕萍 周旭如

摘 要 目的：對建立的阿奇霉素片含量測定的高效液相色譜法進(jìn)行方法驗(yàn)證。方法：色譜柱為Waters XBridge C18（4.6 mm×75 mm， 5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈（8∶3∶9），檢測波長210 nm，流速1.5 ml/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣體積50 ml。結(jié)果：該方法的專屬性、系統(tǒng)適用性、重復(fù)性、中間精密度、溶液穩(wěn)定性、耐用性均符合驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)，阿奇霉素在149. 47～348.77 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 99，平均加樣回收率為100.7%，RSD為0.68%（n=9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，適用于阿奇霉素片含量的定量分析。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 阿奇霉素片 含量

中圖分類號：R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）17-0076-04

Determination of the content of azithromycin tablets by HPLC

WU Qingyi*， QU Yanping， ZHOU Xuru

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To validate the method for determination of the content of azithromycin tablets by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Waters XBridge C18 column （4.6 mm×75 mm， 5 μm） with a mixture of phosphate buffermethanol-acetonitrile （8：3：9） as the mobile phase at the detection wavelength of 210 nm， the flow velocity of 1.5 ml/min and the column temperature of 50 ℃ with sample volume of 50 μl. Results： The specificity， system applicability， repeatability， intermediate precision， stability of the solution and durability of this method could meet the criteria for validation， the standard curve of azithromycin showed good linearity in the range of 149.47-348.77 mg/ml with the correlation coefficient （r） of 0.999 99. The average recovery of samples was 100.7% with RSD of 0.68% （n=9）. Conclusion： This method is accurate and reliable and suitable for quantitative assay of azithromycin tablets.

KEy WORDS HPLC； azithromycin tablets； assay

阿奇霉素（azithromycin）是第一個十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也是第一個氮雜內(nèi)酯類抗生素，相比紅霉素，其最大的特點(diǎn)是對酸穩(wěn)定。本品臨床給藥次數(shù)少，療程短，被認(rèn)為是一個很有效的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，臨床應(yīng)用廣泛，尤其適合于混合感染的治療[1]。其制劑阿奇霉素片被列為國家基本藥物，具有廣泛的市場。本公司為了提高產(chǎn)品質(zhì)量，對其處方及工藝進(jìn)行了改進(jìn)。為了保證分析檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可有效地控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量，必須對所采用的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。依據(jù)《中國藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則及《藥品GMP指南》要求[2-3]，本研究對阿奇霉素片含量測定的HPLC法進(jìn)行驗(yàn)證，并對每個驗(yàn)證參數(shù)設(shè)立了可接受標(biāo)準(zhǔn)。通過方法驗(yàn)證，確定該方法可以在本實(shí)驗(yàn)室用于阿奇霉素片含量的定量分析，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XS205電子分析天平（瑞士Mettler公司）；DL-800B智能超聲清洗器（上海之信儀器有限公司）；L600型臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；阿奇霉素對照品（批號：130593-201301，含量：94.4%，中國食品藥品檢定研究院）；阿奇霉素原料藥（批號：AIF-1609001，含量：94.34%，上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司海門基地）；磷酸氫二鉀、1-辛烷磺酸鈉、磷酸二氫銨（HPLC純，Alfa Aesar公司）；甲醇、乙腈（HPLC純，美國默克公司）；磷酸（HPLC純，美國TEDIA公司）；氨水（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）稀釋液 磷酸二氫銨溶液（稱取磷酸二氫銨1.73 g，加水1 000 ml溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH至10.0±0.05）-甲醇-乙腈（7∶7∶6）。

2）對照品溶液 精密稱取阿奇霉素對照品約26.2 mg，置于100 ml量瓶中，加稀釋液適量使其溶解，再用稀釋液定容，搖勻，作為對照品溶液。

3）供試品溶液 取本品20片，研磨成細(xì)粉，精密稱取細(xì)粉約92 mg（約含阿奇霉素50 mg），置200 ml量瓶中，加入稀釋液約150 ml，超聲15 min，冷卻至室溫后加入稀釋液定容，搖勻。取溶液適量，以6 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

4）空白全輔料溶液 精密稱取空白全輔料約39.6 mg，置200 ml量瓶中，余同供試品溶液操作，取上清液作為空白全輔料溶液。

5）線性測試溶液 精密稱取阿奇霉素對照品約26.2 mg，置于50 ml量瓶中，加稀釋液適量使其溶解，再用稀釋液定容，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密量取該溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 ml置10 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的線性測試溶液。

6）回收率測試溶液 精密稱取空白全輔料3份各39.6 mg，分別與阿奇霉素41.9、52.4、62.9 mg一起置于3個200 ml量瓶中，余同供試品溶液操作，配制成80%、100%和120%的回收率測試溶液各3份。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18柱（4.6 mm×75 mm，5μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（4.4 g磷酸氫二鉀和0.5 g 1-辛烷磺酸鈉溶解于1 000 ml水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH至8.2）-甲醇-乙腈（8∶3∶9），檢測波長210 nm，流速1.5 ml/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣體積50 ml，進(jìn)樣時間：15 min。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取空白溶劑（稀釋液）、空白全輔料溶液、對照品溶液各50 ml，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明空白溶劑（稀釋液）、空白全輔料溶液在阿奇霉素峰位置無雜質(zhì)峰（圖1中保留時間6.506 min），對阿奇霉素含量測定無干擾。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

5次連續(xù)進(jìn)樣測定的主峰面積RSD為0.49%（應(yīng)≤1.5%），對照品溶液主峰理論板數(shù)為4 574（應(yīng)≥1 000），拖尾因子為1.42（應(yīng)≤2.0）（表1）。結(jié)果表明系統(tǒng)重復(fù)性良好，系統(tǒng)適用性符合規(guī)定。

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

以線性溶液濃度C為橫坐標(biāo)、阿奇霉素峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=3 220 442C+844，r=0.999 99，表明該方法在149.47～348.77 mg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（表2）。

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)（含量測定中加樣回收率的檢測）

取3種不同濃度的回收率測試溶液分別進(jìn)樣測試，每個濃度樣品進(jìn)行3次平行測試?；厥章拾赐鈽?biāo)法以峰面積的平均值計算。結(jié)果表明，平均回收率為100.7%（應(yīng)為98.0%～102.0%），RSD為0.68%（應(yīng)≤2.0%），均符合規(guī)定（表3）。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取阿奇霉素片171107批，按含量測定方法，配制6份供試品溶液進(jìn)行檢測，6份平行樣的含量分別為100.98%、100.78%、99.34%、99.69%、99.84%、99.41%，平均含量為100.01%，RSD為0.71%（應(yīng)≤2.0%），符合規(guī)定。

2.6 中間精密度試驗(yàn)

取阿奇霉素片171107批，由不同人在不同日期及不同儀器按含量測定方法進(jìn)行檢測，即2人各做3份，6次數(shù)據(jù)分別為99.69%、99.84%、99.41%、98.88%、98.19%、98.96%，平均含量為99.16%，RSD為0.62%（應(yīng)≤2.0%），符合規(guī)定。

2.7 溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

對照品溶液和供試品溶液于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h時分別進(jìn)樣測試，結(jié)果表明：對照品溶液和供試品溶液于室溫下放置20 h內(nèi)穩(wěn)定，其主峰面積的RSD分別為0.50%，0.88%（應(yīng)≤1.5%），符合規(guī)定。

2.8 耐用性

平行制備供試品溶液2份，每份進(jìn)樣2次，分別考察預(yù)定不同的有機(jī)相比例的流動相（①甲醇比例不動，鹽相和乙腈比例±5%；②鹽相比例不動，甲醇和乙腈比例±5%）、波長±2 nm、柱溫±5 ℃、流速±0.2 ml/min條件下的系統(tǒng)適用性及含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各條件波動范圍內(nèi)，對照品溶液主峰的理論板數(shù)均≥1 000、拖尾因子均≤2.0，符合要求；各條件下含量（n=6）的RSD均<1.5%（應(yīng)≤1.5%）。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的耐用性良好。

2.9 樣品檢測

取三批阿奇霉素片，按本法進(jìn)行含量檢測，結(jié)果分別為100.88%、98.92%、98.89%（應(yīng)為90.0%～110.0%），均符合規(guī)定。

3 討論

《中國藥典》2005年版采用抗生素微生物檢定法進(jìn)行阿奇霉素的含量分析，盡管該法能真實(shí)體現(xiàn)該藥品的抗菌活性，但檢驗(yàn)周期較長、操作較繁瑣。而HPLC法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，省時方便，是阿奇霉素含量測定的有效手段[4-5]。

《中國藥典》2015年版的含量檢測方法[6]，需要進(jìn)系統(tǒng)適用性溶液，且應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)適用性圖譜一致，故使用250 mm長柱，主峰出峰時間約為30 min，流動相配制過程對pH的要求較高。

潘強(qiáng)[4]、韓正爽等[5]的含量測定方法選用250 mm長柱，流動相組分中無甲醇，流速較低，以致檢測時間延長，工作效率偏低。

本研究建立的方法參照美國藥典方法[7-8]，選用75 mm長的短柱，使得主峰出峰時間提早到6～7 min，考慮空白輔料的影響，每針檢測時間只需15 min，大大縮短檢測時間，提高工作效率；且不需使用系統(tǒng)適用性對照品，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)阿奇霉素對照品溶液主峰理論板數(shù)（應(yīng)≥1 000），拖尾因子（應(yīng)≤2.0）符合規(guī)定即可。含量測定的色譜條件與溶出度的一致，使得檢驗(yàn)過程更加便捷。故該方法簡便、快速，能有效地降低分析成本，減小實(shí)驗(yàn)室污染。并且本法用離心的方法獲得供試品溶液，杜絕了使用過濾器帶來的不利影響。同時，在檢測中減少了不必要的稀釋步驟，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，在濕度符合要求的情況下，稱量過程中由一人操作，避免多人操作帶來的人為誤差。因標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程對阿奇霉素含量測定準(zhǔn)確度的影響較大[9]，故本法可以通過加大對照品稱樣量，來減少不確定度對結(jié)果的影響，從而更好地控制藥物分析的測量結(jié)果。

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