王玉川 ，秦麗媛 ，何海艷 ，陳 林 ，3，4，楊明摯 ，張漢波 ，4**

（1．昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000；2．云南大學生命科學院，云南 昆明 650091；3．云南大學生態(tài)與環(huán)境科學學院，云南 昆明 650091；4．省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091）

天麻（Gastrodia eleta） 是蘭科天麻屬（Gastrodia）多年生草本植物，是名貴中藥材之一[1]。其種子無胚乳，必須依靠侵染的紫萁小菇（Mycena osmundicales）等真菌才能萌發(fā)，種子萌發(fā)后又需要侵染的蜜環(huán)菌來提供營養(yǎng)才能長大[2-4]。自1989年徐錦堂和郭順星首次報道天麻種子的萌發(fā)菌為紫萁小菇（M.osmundicales） 以來[5]，陸續(xù)有一些新的萌發(fā)菌報道，如蘭小菇Mycena orchidicola、石斛小菇Mycena dendrobii、開唇蘭小菇Mycena anoectochili[6]。盡管Liu等（2010） 表明來自其他4個屬Chaetomium、Epulorhiza、Cephalosporium、Ceratorhiza的真菌也可以促進天麻萌發(fā)[7]。相對來說，小姑屬真菌仍然是目前最為有效和廣泛地用于人工栽培天麻的萌發(fā)真菌類群[8-9]。

萌發(fā)菌小菇屬真菌為弱腐生菌，培養(yǎng)條件苛刻[10]，培養(yǎng)過程中存在著生長時間過長，生物量偏低的問題。目前各天麻產(chǎn)區(qū)對菌種的需求量日益擴大。天麻萌發(fā)菌一級、二級種的質(zhì)量會影響三級種的質(zhì)量，而三級種的質(zhì)量直接影響天麻的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，了解小菇屬真菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)因子需求并進行培養(yǎng)基優(yōu)化研究，探討小菇屬真菌營養(yǎng)因子間的相互作用關(guān)系，對于解決這一現(xiàn)實問題具有重要意義[9]。均勻設(shè)計是王元和方開泰于1978年提出的[11-12]，該方法最大的特點是試驗點在試驗范圍內(nèi)均勻散布，較之其他試驗設(shè)計方法如正交試驗設(shè)計等，可以很大程度地減少試驗次數(shù)，以較少的試驗點獲得最多的試驗信息[13]。本試驗運用均勻設(shè)計法對小菇屬真菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化并研究某些營養(yǎng)因子間的相互作用，旨在了解小菇屬真菌對營養(yǎng)因子的需求規(guī)律，為縮短小菇屬真菌的一級種培養(yǎng)時間，高效獲取優(yōu)質(zhì)接種菌劑奠定一定基礎(chǔ)。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗菌株

天麻萌發(fā)菌菌株BZZ由昭通市天麻研究院根據(jù)徐錦堂和冉硯珠的方法[14-15]，從天麻原球莖分離、純化得到。經(jīng)過ITS基因序列測定，該菌株與小菇屬真菌（Mycenasp.）具有最近的親緣關(guān)系，但目前尚未鑒定到種。

1.2 試驗方法

1.2.1 優(yōu)化營養(yǎng)因子的確定

查閱文獻選取14個影響真菌生長的因素來優(yōu)化小菇屬真菌培養(yǎng)基，分別為：葡萄糖（X1）、α-乳糖（X2）、蔗糖（X3）、可溶性淀粉（X4）、蛋白胨（X5）、酵母膏（X6）、NH4Cl（X7）、(NH4)2SO4（X8）、甘露醇（X9）、甘氨酸（X10）、煙酸（X11）、維生素（X12）、KH2PO4（X13）、MgSO4·7H2O（X14），根據(jù)文獻確定這些因素使用的濃度梯度均為5個，具體見表1?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，天麻種子萌發(fā)菌的最佳生長溫度為25℃，適宜生長的pH值范圍為5.0～6.0[5]，因此本試驗固定了培養(yǎng)基pH值為5.5，培養(yǎng)溫度為25℃。

1.2.2 菌株培養(yǎng)

配制雙抗PDA培養(yǎng)基30皿，并在無菌操作下將滅好菌的玻璃紙貼于培養(yǎng)基，將菌種接于培養(yǎng)基中心，待菌絲長滿，備用。按照均勻設(shè)計法確定的配方配制培養(yǎng)基，每個配方培養(yǎng)基配制100 mL，制備5個培養(yǎng)皿，采用無菌操作，將滅好菌的玻璃紙貼于培養(yǎng)基。將長滿PDA培養(yǎng)皿的菌絲用6 mm無菌打孔器打上菌片（圖1）。在每個培養(yǎng)皿圓心處接種1個菌片，封好封口膜，倒置培養(yǎng)于25℃恒溫培養(yǎng)箱。

圖1 菌絲打孔圖Fig.1 Mycelial dishes for inoculation

1.2.3 數(shù)據(jù)測量

接上菌片后，每天觀察并測量菌落直徑。待試驗結(jié)束時，將每種培養(yǎng)基上的菌落刮下測量其鮮重。

1.3 配方優(yōu)化和驗證

根據(jù)測量得到的菌落直徑和生物量數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸，得到這兩個指標關(guān)于各因素的方程。用此方程計算優(yōu)化配方，并進行試驗驗證。為了進一步了解優(yōu)化配方中重要因子的相互作用，用三維等高線圖研究兩因子間相互作用，其他因子用優(yōu)化配方中的值固定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

均勻設(shè)計法采用DPS 7.5軟件，二次多項式逐步回歸，三維等高線圖用MATLAB 2010b軟件進行計算和繪制[16]。其他數(shù)據(jù)用IBM SPSS statistics和Excel軟件進行處理。

2 試驗結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基的均勻設(shè)計

利用DPS7．5軟件進行均勻設(shè)計，形成30個組合配方，該組配方的參數(shù)分別為中心化偏差CD=0．994，L2－偏差 D=0．0009，修正偏差 MD=3．2794，對稱化偏差 SD=23．7993，可卷偏差 WD=3．7742，條件數(shù) C=2．0635，D－優(yōu)良性=0，A－優(yōu)良性=0．0172，由參數(shù)可知該配方均勻性較好可用于后續(xù)試驗。按照均勻設(shè)計的配方配制培養(yǎng)基后培養(yǎng)菌株并測量、記錄菌落直徑和生物量（表1）。

隨著時間的推移菌落不斷生長，至第18天菌落直徑較大的配方為N8、N12、N25、N28、N29；生物量較重的配方為N8、N12、N29，其中直徑最大且生物量最重的為N12配方組合。單因素方差分析結(jié)果表明，在整體水平上組間達到極顯著差異（P＜0．01）。

利用DPS7．5和MATALB軟件，根據(jù)表1各配方的菌落直徑和生物量分別進行二次多項式逐步回歸，得到相應(yīng)方程（1） 和方程（2）。

其中，Y1代表菌落直徑，Y2代表生物量，X1～X14分別為影響萌發(fā)菌生長的因子（表1）。方程（1）相關(guān)系數(shù) R=0．9954，F(xiàn) 值=133．5997，P=0．0001，剩余標準差 S=2．5 554，Durbin－Watson 統(tǒng)計量 d=2．1255；方程（2） 相關(guān)系數(shù) R=0．9989，F(xiàn)=283．2258，P=0．0001，剩余標準差 S=0．0097，Durbin－Watson 統(tǒng)計量d=2．0352。說明2個方程能夠正確反映各因子對萌發(fā)菌生長情況的影響。由方程（1）可以看出選擇的14個因素中有12個因素影響菌落直徑的大小，煙酸和MgSO4·7H2O在試驗范圍內(nèi)對菌落直徑影響較小，其中葡萄糖和蔗糖、乳糖和蛋白胨、乳糖和磷酸二氫鉀等8組因素有一定交互作用。由方程（2）可以看出選擇的14個因素有13個因素影響生物量大小，維生素B1在試驗范圍內(nèi)對生物量影響不大，其中乳糖和氯化銨、乳糖和磷酸二氫鉀、蔗糖和可溶性淀粉等13組因素有一定交互作用。

2.2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化結(jié)果

以均勻設(shè)計中菌落直徑、生物量為優(yōu)化對象，約束條件根據(jù)表1中最好的N12配方的結(jié)果，確定為菌落直徑≥64．7 mm、生物量≥0．5092 g，且考慮各因素實際使用范圍，以0．1個單位為求解步長，采用窮舉法[17]將參數(shù)設(shè)置范圍內(nèi)的數(shù)值以矩陣方式代入模型計算，通過聯(lián)立優(yōu)化，進一步確定較優(yōu)培養(yǎng)基配方，結(jié)果見表2。

優(yōu)化配方為可溶性淀粉 4 g·L－1、蛋白胨 4 g·L－1、酵母膏 4 g·L－1、甘露醇 8 mg·L－1、煙酸 4 mg·L－1、KH2PO41．6 g·L－1、MgSO4·7H21．6 g·L－1。以 N12 配方作為驗證此優(yōu)化配方的對照配方，重新培養(yǎng)菌株，得到菌落直徑和生物量，見表2。

由表2可以看出，以菌落直徑和生物量同時作為指標的優(yōu)化組合達到了較好的優(yōu)化效果，隨著時間的推移，從第9天到第21天菌落直徑均在增長，且優(yōu)化組合的增速大于N12配方。測量第21天時優(yōu)化組合配方與未優(yōu)化配方（N12）相比，菌落直徑和生物量分別提高了48%和59%，差異極其顯著（P＜0．01）。

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基條件下營養(yǎng)因素相互作用探討

為進一步探討在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下各個因素對小菇屬真菌菌落直徑和生物量的影響，將優(yōu)化培養(yǎng)基各個因素的用量帶入方程（1） 和方程（2），計算得到二者的優(yōu)化方程（3）和方程（4）。結(jié)果表明，可溶性淀粉（X4）和KH2PO4（X13）的交互作用，蛋白胨（X5）和酵母膏（X6）的交互作用對菌落直徑有顯著影響（優(yōu)化方程（3））；除甘露醇（X9）平方項和MgSO4·7H2O（X14）平方項對生物量有影響外，蛋白胨（X5）和MgSO4·7H2O（X14）的交互作用，甘露醇（X9）和MgSO4·7H2O（X14）的交互作用同樣也對生物量有顯著影響（優(yōu)化方程（4））。因此，通過Matlab 2010b三維等高線圖和曲線圖，進一步研究這些平方項和交互項對小菇屬真菌菌落直徑和生物量的影響。

方程（1） 簡化為：

研究X4和X13對菌落直徑的影響時，固定其他因素用量為優(yōu)化培養(yǎng)基用量，即X5=4，X6=4，代入方程 （3），計算得到 Y=0．215*X13*X4＋52．7，上述方程繪制三維等高線圖（圖2A）。由圖2A可知，可溶性淀粉和磷酸二氫鉀共同對小菇屬真菌菌落直徑影響為正，隨著二者濃度增大小菇屬真菌菌落直徑增大；當二者用量較大時，協(xié)同促進菌落直徑快速增大；研究X5和X6對菌落直徑的影響時，固定其他因素用量為優(yōu)化培養(yǎng)基用量，即X4=4，X13=1．6，代入方程 （3），計算得到 Y=0．0276*X5*X6＋ 55．0，將上述方程繪制三維等高線圖（圖2B）。由圖2B可知，蛋白質(zhì)和酵母膏共同對小菇屬真菌菌落直徑影響為正，隨著二者濃度增大小菇屬真菌菌落直徑增大；當二者用量較大時，協(xié)同促進菌落直徑快速增大。

表1 合成培養(yǎng)基均勻設(shè)計配方Tab.1 Uniform design formula of synthetic media

表2 優(yōu)化配方的菌落直徑和生物量Tab．2 Mycena colony diameter and biomass obtained by optimized formula

圖2 部分營養(yǎng)因子對小菇屬真菌直徑的交互影響Fig．2 Interactions of some nutrient factors on the colony diameter of Mycena sp．

方程（2） 簡化為：

研究X9平方項對菌落生物量的影響時，固定其他因素用量為優(yōu)化培養(yǎng)基用量，即X5=4，X14=1．6代入方程 （4），計算得到 Y=4．6*10^(－4)*X9^2 ＋6．3*10^(－4)*X9＋ 0．354，將上述方程進行繪圖 （圖3A）。由圖3A可知，隨著甘露醇量的增加小菇屬真菌生物量增大，且呈現(xiàn)開始增速慢，而后隨著濃度增大增速加快的趨勢；研究X14平方項對生物量的影響時，固定其他因素用量為優(yōu)化培養(yǎng)基用量，即，X5=4，X9=8，代入方程 （4），計算得到 Y=－ 3．28*10^(－4)*X14^2 ＋ 0．00457*X14＋ 0．382，將上述方程進行繪圖（圖3B）。由圖3B可知，隨著MgSO4·7H2O的增加小菇屬真菌生物量增大，且隨著濃度的增加增速近乎一致；研究X5和X14對生物量的影響時，固定其他因素用量為優(yōu)化培養(yǎng)基用量，即X9=8代入方程（4）， 計 算 得 到 Y=0．00315*X14＋3．55*10^(－4)*X14*X5－ 3．28*10^(－4)*X14^2 ＋ 0．382，將上述方程進行三維等高線圖繪制（圖3C）。由圖3C可知，蛋白胨和MgSO4·7H2O協(xié)同促進小菇屬真菌生物量；研究X9和X14對生物量的影響時，固定X5=4，代入方程（4）計算得到 Y=－ 3．28*10^(－4)*X14^2 ＋ 3．94*10^(－4)*X14*X9＋ 0．00142*X14＋ 4．6*10^(－4)*X9^2 ＋ 0．353，將上述方程繪制三維等高線圖（圖3D）。由圖3D可知，甘露醇和MgSO4·7H2O兩因子協(xié)同促進生物量的增加，且當兩因子用量均較大時，對生物量的協(xié)同促進作用較明顯。

3 討論

目前在各天麻產(chǎn)區(qū)，生產(chǎn)用菌種的需求量日益擴大[9]。研究影響萌發(fā)菌生長的營養(yǎng)因子，無論是對大規(guī)模深層液體發(fā)酵工藝還是傳統(tǒng)固體技術(shù)進行制種[18-19]，都具有重要理論和現(xiàn)實意義。然而，目前對萌發(fā)菌生長的基本營養(yǎng)要求尚缺乏深入的比較研究。

圖3 部分營養(yǎng)因子對小菇屬真菌生物量的交互影響Fig.3 Interaction of some nutrient factors on the biomass of Mycena sp.

本試驗運用均勻設(shè)計法較為系統(tǒng)研究了目前在真菌培養(yǎng)過程中常見營養(yǎng)因子對小菇屬真菌的生長影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在選擇的14個因素中有11個因素影響菌落直徑的大小，其中葡萄糖和蔗糖、乳糖和蛋白胨、乳糖和磷酸二氫鉀等8組因素有交互作用。以生物量看，選擇的14個因素有13個因素影響有效應(yīng)。其中乳糖和氯化銨、乳糖和磷酸二氫鉀、蔗糖和可溶性淀粉等13組因素有交互作用。而可溶性淀粉和KH2PO4的交互作用，蛋白胨和酵母膏的交互作用對菌落直徑有顯著影響；蛋白胨和MgSO4·7H2O的交互作用，甘露醇和MgSO4·7H2O的交互作用對生物量大小有影響（圖2、圖3）。這些結(jié)果表明影響小姑屬真菌生長的營養(yǎng)因子不但多，而且大多數(shù)因子都為交互作用。比如，甘露醇和MgSO4·7H2O在用量較大時，對小菇屬真菌生物量影響較大，如果調(diào)整配方時，稍下調(diào)其中1個的使用量，將會使小菇屬真菌生物量大幅下降。因此，在調(diào)整優(yōu)化配方時要綜合衡量，平衡調(diào)整，盡量調(diào)整影響小并且與其他因子交互作用較弱的因子。

在驗證優(yōu)化培養(yǎng)基時，N12培養(yǎng)基中測量得到的菌落直徑和生物量均相比均勻設(shè)計時有所下降，并且優(yōu)化配方的生物量也較方程計算生物量有所下降（表1、表2）。這可能是由于不同試驗批次中采用的接種菌絲活力，培養(yǎng)理化條件等波動造成。但當利用優(yōu)化配方與配方N12在同一條件下進行培養(yǎng)時，優(yōu)化培養(yǎng)基較配方N12的小菇屬真菌直徑和生物量均較大（表2）。因此，可以認為優(yōu)化的方向是正確的，本優(yōu)化培養(yǎng)基配方能較好促進小菇屬真菌生長。