李建軍，姜永成，孟慶祥，單琪凱，王 巖，朱世偉，華秀萍

（佳木斯大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

養(yǎng)菌是食用菌生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)受培養(yǎng)料物理特性（含水率、密度）影響[1]，適宜菌絲的微環(huán)境能使菌絲發(fā)育整齊，長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)；隨著養(yǎng)菌技術(shù)的發(fā)展，過(guò)氧化鈣作為食用菌培養(yǎng)料添加劑被廣泛應(yīng)用，其遇到培養(yǎng)料中的水分會(huì)發(fā)生分解反應(yīng)：2CaO2＋2H2O=2Ca(OH)2＋O2↑，在反應(yīng)中緩慢釋放氧氣而增加菌袋內(nèi)含氧量，從而滿(mǎn)足菌絲對(duì)氧氣需求。當(dāng)前對(duì)黑木耳（Auricularia auricula） 菌絲微環(huán)境理論研究不斷深入，張介馳等[2]分別以“黑29”一級(jí)母鐘和二級(jí)菌種為試驗(yàn)材料，分析了培養(yǎng)料含水率對(duì)木耳菌絲生長(zhǎng)和出耳影響；張躍華等[3]研究了過(guò)氧化鈣添加量對(duì)菌絲發(fā)育狀況影響。上述研究將含水率、過(guò)氧化鈣添加量?jī)H作為單一因素探究其與菌絲長(zhǎng)勢(shì)關(guān)系，得出菌絲生長(zhǎng)微環(huán)境模型，并未考慮兩者共同作用下菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)及其相互作用關(guān)系，所得環(huán)境參數(shù)并非最佳環(huán)境參數(shù)。

本研究以提高菌絲密度（長(zhǎng)度）為目標(biāo)，利用二次回歸正交試驗(yàn)，研究培養(yǎng)料含水率、密度、過(guò)氧化鈣添加量三因素及其交互作用對(duì)菌絲長(zhǎng)勢(shì)影響，通過(guò)方差分析與優(yōu)化，得出黑木耳黑威15二級(jí)菌種養(yǎng)菌階段菌絲微環(huán)境模型及其最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)表明，菌絲在所得參數(shù)環(huán)境下發(fā)育整齊，長(zhǎng)勢(shì)最佳，以期為木耳養(yǎng)菌階段菌絲微環(huán)境調(diào)控提供定量生理指標(biāo)和分析方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株選擇

黑木耳 （Auricularia auricula）“黑威 15”（HW15）二級(jí)菌種，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.2 菌種制作

馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯切塊200 g，置于1 L水中煮沸，熟而不爛為宜，濾液通過(guò)紗布倒入干凈鋁鍋內(nèi)，取20 g瓊脂放入濾液加熱，攪拌融化，再將濾液補(bǔ)足1 L放回鋁鍋，加入20 g葡萄糖，加熱攪拌融化。趁熱分裝于20 mm×20 mm的試管，裝入量為試管1/5；培養(yǎng)基試管分裝后進(jìn)行高壓滅菌；超凈工作臺(tái)接種，放入28℃恒溫箱，10 d長(zhǎng)滿(mǎn)斜面；每試管母種接5瓶原種，每瓶原種接30袋栽培種[4]。

1.3 栽培料制作

培養(yǎng)料原料：新鮮柞木刨花木屑、粗紅麩皮、粗稻殼糠、黃豆粉，分別以77%～79%、8%、7%、5%配比，輔料為過(guò)氧化鈣，原料經(jīng)自然風(fēng)干與輔料拌勻，再經(jīng)107℃烘干加水設(shè)定其含水率，采用15．5 cm×32 cm 丙烯袋手工裝袋，裝料 1 kg～1．25 kg，袋內(nèi)培養(yǎng)料密度一致，不打孔，封口后菌包體積為1．57×10－3m3[1]，采用高壓滅菌，其溫度 105℃，1．8 h后完成滅菌。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黑木耳為好氣性中溫型真菌，常溫下菌絲均可生長(zhǎng)，22℃～32℃為適宜溫度，潮濕、氧氣充足、寬松的生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，適宜濕度為55%～75%[5]，考慮本試驗(yàn)為研究培養(yǎng)料物理特性對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，且由于菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度要求相對(duì)較低，所以設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素時(shí)不考慮溫度，即設(shè)計(jì)三因素培養(yǎng)料含水率（A，%）、過(guò)氧化鈣添加量（B，%）、培養(yǎng)料密度（C，kg·m－3），單目標(biāo)菌絲密度（長(zhǎng)度）試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。為提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)全面性，增加γ因素水平，以獲取準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)實(shí)際值和編碼值見(jiàn)表1。試驗(yàn)共27組（中心點(diǎn)重復(fù)6組），每組做3次，取均值。其中菌絲密度（長(zhǎng)度）計(jì)算方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。

3 結(jié)果分析

3.1 生長(zhǎng)環(huán)境模型

生長(zhǎng)環(huán)境模型分析試驗(yàn)在佳木斯大學(xué)食用菌栽培試驗(yàn)室進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

從表2可以看出，利用Design Expert（Version8.0.6 Copyright?2010 Stat-Ease,Inc.All rights reserved） 軟件[7]，對(duì)各因素及其交互作用分析，得到木耳養(yǎng)菌階段菌絲最佳生長(zhǎng)微環(huán)境模型：Z=16.26-1.18×A-1.29×B-0.20×C+1.17×AB-0.46×BC+0.34AC-3.03A2-3.51B2-1.23C2。

表1 因素水平表Tab.1 Factor level table

表2 試驗(yàn)結(jié)果表Tab.2 Result of experiment

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance table

模型具有顯著影響（P<0.001），P<0.05為顯著項(xiàng)，三因素對(duì)菌絲密度具有顯著影響；含水率（A）一次項(xiàng)、過(guò)氧化鈣添加量（B）一次項(xiàng)對(duì)菌絲生長(zhǎng)有顯著影響；含水率（A）二次項(xiàng)、過(guò)氧化鈣添加量（B） 二次項(xiàng)對(duì)菌絲生長(zhǎng)有極顯著影響；含水率（A）和過(guò)氧化鈣添加量（B）交互項(xiàng)對(duì)菌絲生長(zhǎng)有顯著影響；培養(yǎng)料密度（C）對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不大。失擬值=0.05，失擬顯著，表明還有其他因素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響；R2=0.89，信噪比=11.89，校正系數(shù)=0.84（大于0.80），變異系數(shù)（CV） =14.67%（小于15%），說(shuō)明模型擬合程度好（不考慮其他因素對(duì)結(jié)果影響），能夠解釋試驗(yàn)數(shù)據(jù)并對(duì)菌絲生長(zhǎng)環(huán)境參數(shù)進(jìn)行初步分析。

3.2 單因素作用

單因素作用試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

回歸方程中1個(gè)因素置為零水平，分別考慮培養(yǎng)料含水率（A）、過(guò)氧化鈣添加量（B）、培養(yǎng)料密度（C）對(duì)菌絲密度影響，得到單因素回歸模型：培養(yǎng)料含水率 （A）：Z=16.26-1.18×A-3.03A2，氧化鈣添加量 （B）：Z=16.26-1.29×B-3.51B2，培養(yǎng)料密度（C）：Z=16.26-0.20×C-1.23C2。

圖1 單因素對(duì)菌絲影響Fig．1 Effect of single factor on mycelium density

由圖1看出，培養(yǎng)料含水率和過(guò)氧化鈣添加量置為零水平，菌絲密度隨著培養(yǎng)料密度變化呈先升后降的變化趨勢(shì)，但變化幅度不大，說(shuō)明培養(yǎng)料密度對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較輕。培養(yǎng)料含水率和培養(yǎng)料密度置為零水平，過(guò)氧化鈣添加量對(duì)菌絲密度影響劇烈，－1～0水平階段，菌絲密度隨著過(guò)氧化鈣添加量增加不斷升高，并與培養(yǎng)料含水率影響曲線相交于最高點(diǎn)，此后呈下降趨勢(shì)，下落幅度略大于培養(yǎng)料含水率影響曲線；當(dāng)過(guò)氧化鈣添加量和培養(yǎng)料密度置于零水平時(shí)，培養(yǎng)料含水率影響曲線和過(guò)氧化鈣添加量影響曲線趨于一致，但激烈程度略低于過(guò)氧化鈣添加量。由此得出三因素對(duì)菌絲密度影響程度順序：過(guò)氧化鈣添加量（B） 最大、含水率（A） 次之、培養(yǎng)料密度（C）最小。

3.3 交互作用

3．3．1 AB 交互作用

圖2 培養(yǎng)料含水率和過(guò)氧化鈣交互作用對(duì)菌絲密度影響Fig．2 Effect of interaction between the water content of culture material and the calcium peroxide content on mycelium density

AB交互作用試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。AB交互作用響應(yīng)曲面圖（圖2）呈凸面，培養(yǎng)料含水率、過(guò)氧化鈣添加量交互作用明顯，兩者對(duì)菌絲密度影響呈先增后降趨勢(shì)，但影響程度基本一致：當(dāng)培養(yǎng)料含水率或過(guò)氧化鈣添加量在零水平附近，另一因素對(duì)菌絲密度影響曲線先升后降，且影響劇烈，表明65．75%培養(yǎng)料含水率能將0．95%過(guò)氧化鈣全部分解，此時(shí)氧氣濃度最大，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳。培養(yǎng)料含水率或過(guò)氧化鈣添加量在低水平和高水平附近，另一因素對(duì)菌絲密度影響曲線平緩，此時(shí)放氧量偏低或過(guò)高：培養(yǎng)料含水率處于低水平不能完全分解過(guò)氧化鈣，所釋放氧氣無(wú)法滿(mǎn)足菌絲生長(zhǎng)；過(guò)氧化鈣添加量處于高水平，會(huì)消耗大量水分，菌絲因缺水生長(zhǎng)緩慢。培養(yǎng)料含水率和過(guò)氧化鈣添加量同時(shí)近零水平時(shí)（含水率為65．75%，過(guò)氧化鈣添加量為0．95%），菌絲密度達(dá)到最大值16．8 mm。

3．3．2 AC 交互作用

AC交互作用試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 培養(yǎng)料含水率和密度交互作用對(duì)菌絲密度影響Fig．3 Effect of interaction between the water content and thedensity of culture material on mycelium density

AC交互作用響應(yīng)曲面圖（圖3）呈側(cè)山脊形，可看出培養(yǎng)料含水率與培養(yǎng)料密度交互作用對(duì)菌絲密度影響較大，當(dāng)培養(yǎng)料含水率在低水平或高水平時(shí)，培養(yǎng)料密度變化對(duì)菌絲密度影響平緩，但低水平培養(yǎng)料含水率對(duì)菌絲密度影響程度整體要高于高水平培養(yǎng)料含水率，說(shuō)明培養(yǎng)料含水率過(guò)高菌絲呼吸作用降低。培養(yǎng)料含水率零水平處為山脊，此時(shí)培養(yǎng)料密度對(duì)菌絲密度影響較大，呈先增后降趨勢(shì)，培養(yǎng)料含水率66%，培養(yǎng)料密度614 kg·m－3，菌絲密度達(dá)到最大值16．9 mm，BC交互作用P值為0．51（＞0．05），對(duì)目標(biāo)值影響較小，所以BC交互作用不予分析。

4 模型優(yōu)化

利用Design Expert優(yōu)化模塊，以最大菌絲密度為目標(biāo)，得到最優(yōu)三因素組合：培養(yǎng)料含水率65．75%，過(guò)氧化鈣添加量0．95%，培養(yǎng)料密度719 kg·m－3，菌絲密度系數(shù) 17．55。

5 結(jié)論

以最大菌絲密度為目標(biāo)，完成黑威15二級(jí)菌種養(yǎng)菌階段菌絲微環(huán)境模型實(shí)例化構(gòu)建并得出其最佳因素組合：培養(yǎng)料含水率65．75%，過(guò)氧化鈣添加量0．95%，培養(yǎng)料密度 719 kg·m－3。

三因素對(duì)菌絲密度影響程度順序?yàn)檫^(guò)氧化鈣添加量最大，培養(yǎng)料含水率次之，培養(yǎng)料密度最??；前兩因素影響程度趨于一致，其一因素置為零水平，另一因素對(duì)菌絲密度影響曲線先升后降，且影響劇烈，表明65．75%培養(yǎng)料含水率能將0．95%過(guò)氧化鈣全部分解，此時(shí)氧氣濃度最大，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳。應(yīng)將過(guò)氧化鈣添加量和含水率作為重要因素進(jìn)行控制，尤其培養(yǎng)料含水率嚴(yán)格控制在64%～66%范圍內(nèi)，過(guò)氧化鈣添加量不可超過(guò)1．2%。當(dāng)培養(yǎng)料含水率在67．5%附近，此時(shí)培養(yǎng)料密度對(duì)菌絲密度有顯著影響，前期影響較小，當(dāng)超過(guò)730 kg·m－3時(shí)，菌絲密度急劇下降，適宜培養(yǎng)料密度應(yīng)為720 kg·m－3～730 kg·m－3。

對(duì)比普通養(yǎng)菌車(chē)間，改善后的生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)，菌絲密度系數(shù)平均增加5．1。由于本次試驗(yàn)考慮菌絲在常溫下均能生長(zhǎng)，并未設(shè)置溫度作為影響因素，其他因素交互作用對(duì)菌絲密度影響還有待研究[4，8－10]。