符麗雪 ， 錢(qián)麗麗 ，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

綠豆不僅包含人體所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還擁有許多生物活性物質(zhì)，如黃酮類(lèi)化合物、多酚類(lèi)、多糖、蛋白質(zhì)水解酶、苯丙氨酸氨解酶、抗性淀粉、香豆素、生物堿等[1]。這些成分都具有一定的生理功能，如改善腸道菌群組成、降血脂血糖、抗氧化、提高免疫力、清熱解毒等[2]。并且相關(guān)研究[3]表明，綠豆發(fā)芽時(shí)，伴隨酶活性的啟動(dòng)，其活性成分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生部分改變，從20世紀(jì)60年代初至今，人們積極從綠豆及其萌芽中找尋生物活性物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行分離提純及定性定量的研究。目前對(duì)于綠豆中活性成分的研究主要集中在黃酮類(lèi)化合物，國(guó)內(nèi)對(duì)于雜糧中SOD性質(zhì)的研究多數(shù)集中在水稻、玉米、大豆等作物中，但在綠豆作物中有關(guān)SOD的研究較少，試驗(yàn)以綠豆為原料，研究綠豆在發(fā)芽3～7 d內(nèi)的SOD活性變化規(guī)律，采用NBT光還原法[4]測(cè)定綠豆發(fā)芽不同時(shí)期及不同部位的SOD活性，參考考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。對(duì)綠豆發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽部位SOD活性進(jìn)行差異性顯著分析。

1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1 試驗(yàn)材料

綠豆（市售）。

1.2 試驗(yàn)儀器

FA2004B型電子天平，上海菁海儀器有限公司產(chǎn)品；DHP600型恒溫培養(yǎng)箱，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；2-16p型離心機(jī)，德國(guó)CGM產(chǎn)品;Intergral5型默克純水儀，默克化工技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HYQ-212A型快速混勻器，深圳市瑞鑫達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；WisetisHG-15D型數(shù)碼分散機(jī)，廣州泰通儀器有限公司產(chǎn)品；澳柯瑪冰箱，澳柯瑪股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)主要試劑

核黃素，分析純，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），高純級(jí)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供；考馬斯亮藍(lán)R250，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 綠豆發(fā)芽工藝流程

稱(chēng)取綠豆→挑選綠豆→純水清洗→恒溫浸泡→種子露白→移栽培養(yǎng)→綠豆芽。

2.2 操作要點(diǎn)

①稱(chēng)取500 g的綠豆；②挑選綠豆，挑選顆粒飽滿(mǎn)、無(wú)蟲(chóng)害及霉變的綠豆；③純水清洗，使用默克純水儀生產(chǎn)的超純水清洗綠豆表面；④每100 g綠豆中加入500 mL超純水，放在燒杯中浸泡24 h；⑤待種子露白后將綠豆取出放置在鋪有3層紗布的長(zhǎng)方形瓷盤(pán)中繼續(xù)培養(yǎng)，使用小噴瓶每天澆水2次，澆水至浸沒(méi)紗布為止，在24℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并及時(shí)將不同天數(shù)的綠豆進(jìn)行分離處理。

2.3 綠豆發(fā)芽過(guò)程中SOD和蛋白質(zhì)的變化規(guī)律

采集發(fā)芽不同時(shí)間（3～7d）的綠豆及不同部位樣品作為研究對(duì)象，研究綠豆芽發(fā)芽過(guò)程中SOD和蛋白質(zhì)的變化規(guī)律。

2.3.1 SOD的變化規(guī)律研究

取整根綠豆、根（胚根）、莖（下胚軸）、胚（胚芽）于50℃烘箱中烘24 h至干，將烘干后的樣品粉碎后，放入中號(hào)塑料袋或塑料瓶中備用；稱(chēng)取綠豆芽樣品粉末5 g，加入磷酸緩沖液（PBS） 25 mL，攪拌均勻后，在4℃條件下，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心20 min，取得的上清液為SOD酶粗提液。

SOD活性測(cè)定試劑見(jiàn)表1。

表1 SOD活性測(cè)定試劑

按表1加好試劑，在4 000 lx熒光燈下進(jìn)行照光，時(shí)間控制在20 min，（主要目的是各管照光情況相同，把控反應(yīng)溫度在25～35℃，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶活性高低而定)，最后于波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定各反應(yīng)液的吸光度。以緩沖液替代酶液做空白對(duì)照。

2.3.2 蛋白質(zhì)的變化規(guī)律研究

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD酶活性。

式中：ACK——照光對(duì)照管的吸光度；

AE——樣品管的吸光度；

V——樣液總體積，mL；

Q——樣品質(zhì)量，g；

VT——測(cè)定時(shí)樣品的用量，mL；

2.5 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0版本的單因素方差分析方法，多重比較采用Duncan法。圖形處理為Microsoft Excel（Office 2007） 軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同發(fā)芽時(shí)間SOD酶及蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律

以發(fā)芽時(shí)間在3～7 d內(nèi)的整根綠豆為樣品進(jìn)行酶活和蛋白質(zhì)的測(cè)定。

綠豆發(fā)芽時(shí)間對(duì)SOD及蛋白含量的影響見(jiàn)表2。

表2 綠豆發(fā)芽時(shí)間對(duì)SOD及蛋白含量的影響

由表2可知，由于發(fā)芽時(shí)間不同，SOD活力和蛋白質(zhì)含量均存在顯著性差異。SOD活力最高為3 079 U/mL，蛋白含量最高為4.49 mg/mL。隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力不斷攀升，第3天到第5天的增幅達(dá)21.9%；在第5天達(dá)到頂峰，隨后開(kāi)始緩慢降低，降幅相比增幅小；而第5天到第7天的降幅僅為8%；綠豆發(fā)芽3～7 d過(guò)程中，蛋白質(zhì)含量不斷上升，綠豆通過(guò)葉的光合作用不斷合成新的蛋白質(zhì)。依據(jù)綠豆發(fā)芽3～7 d的酶活力和蛋白含量，計(jì)算SOD比活力。綠豆發(fā)芽第5天時(shí)，比活力最大。發(fā)芽3～5 d的情況下，SOD的比活力存在顯著性差異。

3.2 研究不同部位SOD及蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律

3.2.1 綠豆莖的酶活及蛋白含量測(cè)定

以發(fā)芽時(shí)間在3～7 d內(nèi)的綠豆莖為樣品進(jìn)行酶活和蛋白質(zhì)的測(cè)定。

綠豆莖的酶活及蛋白含量見(jiàn)表3。

由表3可知，發(fā)芽3～5 d時(shí)，綠豆莖中SOD活力差異顯著，SOD活力最高為1 311 U/mL，蛋白含量最高為4.79 mg/mL；發(fā)芽時(shí)間在4～6 d時(shí)，SOD的比活力差異不顯著。

表3 綠豆莖的酶活及蛋白含量

3.2.2 綠豆胚的酶活及蛋白含量測(cè)定

以發(fā)芽時(shí)間在3～7 d內(nèi)的綠豆胚為樣品進(jìn)行酶活和蛋白質(zhì)的測(cè)定。

綠豆胚的酶活及蛋白含量見(jiàn)表4。

表4 綠豆胚的酶活及蛋白含量

由表4可知，SOD活力最高為2 458 U/mL，蛋白含量最高為5.15 mg/mL。發(fā)芽3～5 d時(shí)，綠豆胚的SOD的比活力差異顯著，伴隨發(fā)芽時(shí)間的增長(zhǎng)，SOD的比活力也逐漸增加，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間超過(guò)5 d后，SOD的比活力反而減小。

3.2.3 綠豆根的酶活及蛋白含量測(cè)定

以發(fā)芽時(shí)間在3～7 d內(nèi)的綠豆根為樣品進(jìn)行酶活和蛋白質(zhì)的測(cè)定。

綠豆根的酶活及蛋白含量見(jiàn)表5。

由表5可知，SOD活力最高為5956 U/mL，蛋白含量最高為4.27 mg/mL，除發(fā)芽第5天SOD的比活力外，發(fā)芽3～7 d內(nèi)的SOD的比活力差異不顯著。

綠豆中的SOD主要集中在綠豆的根部，綠豆不同部位隨發(fā)芽時(shí)間的變化與綠豆芽整體類(lèi)似，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，綠豆生長(zhǎng)過(guò)程中，SOD比活力大小的順序?yàn)楦九撸厩o。綠豆根的活性最高，其SOD的比活力分別為胚、莖的3倍和5倍。

表5 綠豆根的酶活及蛋白含量

4 結(jié)論

以綠豆為原料，在發(fā)芽3～7 d的條件下，制備綠豆SOD粗酶液，研究SOD活性和蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠豆SOD比活力在發(fā)芽過(guò)程中呈鐘形曲線(xiàn)，比活力在發(fā)芽初期隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，發(fā)芽至第5天時(shí)，SOD的比活力最強(qiáng)，為783 U/mg，隨后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。綠豆發(fā)芽過(guò)程中不同部位間SOD比活力存在顯著性差異。綠豆發(fā)芽時(shí)根部SOD的比活力最強(qiáng)，為1 649 U/mg。蛋白質(zhì)含量與發(fā)芽時(shí)間成正比，隨發(fā)芽時(shí)間的增長(zhǎng)而增大。