張繼斌

（勁牌生物醫(yī)藥有限公司，中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶 435100）

砂仁為姜科植物陽(yáng)春砂（Amomum villosum Lo-ur.）、綠殼砂（Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen） 或海南砂 （Amomum longiligularg T.L.wu）的干燥成熟果實(shí)，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功能，主要用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動(dòng)不安等[1]。砂仁主要成分為揮發(fā)油類成分[2-4]，但其中也含有黃酮類成分[5]和多糖類成分[6]。

試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)選藥材粒度、溶劑倍數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間等影響因素，以提取得到揮發(fā)油中乙酸龍腦酯、提取物中總黃酮和總多糖提取率為考查指標(biāo)，確定了砂仁藥材綜合利用的最佳工藝條件。通過(guò)對(duì)砂仁藥材進(jìn)行一次提取，同時(shí)得到砂仁揮發(fā)油、砂仁黃酮、砂仁多糖提取物，對(duì)砂仁藥材進(jìn)行了綜合利用，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備

6890型氣相色譜儀，安捷倫科技公司產(chǎn)品；TU1901型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司產(chǎn)品；AB135-S型電子天平，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SK8200LHC型超聲提取器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

砂仁藥材，由勁牌生物醫(yī)藥有限公司提供；乙酸龍腦酯對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品、葡萄糖對(duì)照品，由中國(guó)食品藥品監(jiān)督檢定研究院提供；苯酚、濃硫酸、甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純；純凈水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 乙酸龍腦酯含量測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2015版一部“砂仁”項(xiàng)下規(guī)定的方法測(cè)定。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用30%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，然后加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，混勻，放置6 min；加入0.3 mL 10%AL（NO3）3溶液，混勻，放置6 min；然后加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，混勻，放置15 min；用30%乙醇定容至10 mL，搖勻。以相應(yīng)試劑為空白，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 供試品溶液的制備

稱取適量的提取物粉末樣品，加入適量的50%乙醇至50 mL容量瓶中，搖勻，超聲溶解，定容，放置，作為供試品溶液。

2.2.4 含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，按照2.2.2的方法，自“加入0.3 mL 5%NaNO2溶液”起，依法測(cè)定吸光度，計(jì)算即得。

2.3 總多糖含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。再量取1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置于具塞比色管中，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，分別精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中煮沸15 min，取出冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 供試品溶液的制備

稱取樣品約15 mg，于50 mL容量瓶中，加入40 mL水，超聲溶解、定容、過(guò)濾，作為供試品溶液備用。

2.3.4 顯色測(cè)定

取上述供試品溶液1 mL，加水至2.0 mL，按照2.3.2的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，計(jì)算即得。

3 正交試驗(yàn)

3.1 因素水平設(shè)計(jì)

采用水加熱提取，其影響因素主要有藥材粒度、溶劑倍數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間[7]，采用L9（34）正交表優(yōu)化提取條件，考查上述4個(gè)因素和3個(gè)水平。

因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)

3.2 樣品制備

將砂仁藥材分別按要求稱取質(zhì)量為100 g的樣品9份，按正交試驗(yàn)表的條件分別進(jìn)行加熱提取，收集得到揮發(fā)油，準(zhǔn)確測(cè)量其體積。

揮發(fā)油相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

表2 揮發(fā)油相關(guān)數(shù)據(jù)

3.3 含量測(cè)定

按試驗(yàn)方法測(cè)定揮發(fā)油中的乙酸龍腦酯的含量，并分別計(jì)算質(zhì)量。結(jié)果如表2所示。

3.4 正交分析

以揮發(fā)油中乙酸龍腦酯質(zhì)量為考查指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表3結(jié)果可以看出，以乙酸龍腦酯提取率為考查指標(biāo)，極差結(jié)果表明，各因素的作用依次為樣品粒度＞提取時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞溶劑倍數(shù)，以樣品粒度因素影響為最大。同時(shí)通過(guò)直觀分析結(jié)果表明，以A3B3C1D3為最佳提取條件。但由于在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，藥材粉碎難度較大，且粉碎后提取液難以過(guò)濾，因此樣品的粒度選擇“粉碎”。因此，砂仁藥材的最佳提取條件確定為粉碎15倍，浸泡時(shí)間0.5 h，提取時(shí)間6.0 h。

4 純化試驗(yàn)

4.1 提取

稱取砂仁藥材樣品300 g，按正交試驗(yàn)最佳提取條件進(jìn)行提取，將樣品破碎，加入15 BV（4 500 mL）純凈水，浸泡0.5 h，加熱回流提取6.0 h。

4.2 濃縮

將提取液趁熱過(guò)濾，濾液濃縮至體積約300 mL（生藥質(zhì)量濃度1.0 g/mL）。

4.3 醇沉

將以上得到的濃縮液分為4份，每份樣品75 mL，相當(dāng)于原藥材75 g。將其中3個(gè)濃縮液中分別加入不同體積的乙醇溶液，使醇沉分別達(dá)到60%，70%，80%，攪拌均勻，靜置12 h。其中，1個(gè)濃縮液不醇沉，作為對(duì)比樣品。

4.4 黃酮提取物

將醇沉液離心后的上清液回收乙醇，濃縮干燥，得到砂仁黃酮提取物。同時(shí)將未醇沉的濃縮液直接濃縮干燥，得到砂仁粗提取物，并按試驗(yàn)方法分別對(duì)提取物樣品進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。

砂仁黃酮提取物試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 砂仁黃酮提取物試驗(yàn)結(jié)果

從表4試驗(yàn)結(jié)果可以看出，醇沉可有效提高提取物中總黃酮的含量，隨著醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷提高，砂仁總黃酮提取物的得率和總黃酮成分的得率越來(lái)越低，提取物的含量越來(lái)越高。

4.5 多糖提取物

將醇沉液離心后的沉淀直接干燥粉碎，得到砂仁多糖提取物。同時(shí)，將未醇沉的濃縮液直接濃縮干燥，得到砂仁粗提取物，并分別按試驗(yàn)方法對(duì)提取物進(jìn)行總多糖含量測(cè)定。

砂仁多糖提取物試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 砂仁多糖提取物試驗(yàn)結(jié)果

從表5試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷提高，砂仁總多糖提取物的得率越來(lái)越高，提取物的含量越來(lái)越低，但總多糖的得率以70%醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最高。綜合總黃酮和總多糖提取物的試驗(yàn)結(jié)果分析，砂仁粗提取物的純化條件以醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%為最適宜。

5 驗(yàn)證試驗(yàn)

5.1 試驗(yàn)條件

稱取砂仁藥材樣品150 g共2份，將樣品破碎，加入15 BV（2 250 mL） 純凈水，浸泡0.5 h，加熱回流提取6.0 h，收集得到砂仁揮發(fā)油。將提取液過(guò)濾，濃縮至體積約150 mL（生藥質(zhì)量濃度1.0 g/mL）。濃縮液中分別加入乙醇溶液，使醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到70%，攪拌均勻，靜置。將醇沉液用離心機(jī)離心，分別取上清液和沉淀。將醇沉離心后的上清液分別回收乙醇，濃縮干燥，得到砂仁黃酮提取物。將醇沉離心后的沉淀干燥粉碎，得到砂仁多糖提取物。

5.2 提取物得率

計(jì)算揮發(fā)油、黃酮、多糖3種提取物的得率。各提取物的得率見表6。

表6 各提取物的得率

5.3 有效成分得率

按試驗(yàn)方法測(cè)定揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量、提取物中總黃酮和總多糖的含量，分別計(jì)算各有效成分的得率。

各有效成分得率見表7。

表7 各有效成分得率

6 結(jié)論

（1）試驗(yàn)對(duì)砂仁藥材進(jìn)行加熱提取，通過(guò)對(duì)水蒸氣冷凝分層收集得到砂仁揮發(fā)油，同時(shí)對(duì)提取液濃縮后醇沉，分別干燥得到砂仁黃酮和多糖提取物，采用一種工藝同時(shí)得到砂仁的3種提取物，對(duì)砂仁藥材進(jìn)行了綜合利用，有效降低了生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)了資源的合理利用，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

（2）通過(guò)提取正交試驗(yàn)和純化試驗(yàn)，結(jié)合生產(chǎn)的實(shí)際情況，砂仁藥材綜合利用最佳試驗(yàn)條件為取砂仁藥材破碎，加15倍量的水，浸泡0.5 h，提取6.0 h。提取液濃縮至生藥質(zhì)量濃度1.0 g/mL，醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%。

（3）經(jīng)過(guò)對(duì)砂仁藥材綜合利用最佳試驗(yàn)條件的驗(yàn)證，每100 g砂仁藥材可得到砂仁揮發(fā)油2.5 mL，揮發(fā)油中乙酸龍腦酯的含量為469.7 mg/mL。同時(shí)可得到砂仁黃酮提取物6.04 g，提取物中總黃酮的含量為36.32%，得到砂仁總多糖提取物5.84 g，提取物中總多糖的含量為8.50%。