陳 勇 陳 濤 高永翔

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610000）

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以多關(guān)節(jié)炎癥為顯著特征的慢性自身免疫系統(tǒng)疾病，因具有發(fā)病率及致殘率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康［1］。目前針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究表明，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RA發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其中備受研究者關(guān)注當(dāng)屬Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號(hào)通路［2-3］。研究證實(shí)JAK/STAT信號(hào)通路通過(guò)多途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)，在RA發(fā)病及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［4］。目前針對(duì)RA的治療，臨床首選具有多靶點(diǎn)特色的中藥復(fù)方制劑，其中風(fēng)濕定膠囊以祛寒除濕、補(bǔ)氣養(yǎng)血、扶正祛邪的功效及副作用小、患者依從性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，逐漸在臨床中得到廣泛應(yīng)用，但其具體作用機(jī)理目前尚不明確。基于此，本研究通過(guò)探討風(fēng)濕定膠囊對(duì)RA大鼠滑膜組織中JAK-STAT信號(hào)通路表達(dá)的影響闡述其治療RA的作用機(jī)制，以期為其臨床推廣提供一定理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康未交配性成熟Wistar大鼠 85 只，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20） g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)（國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所），動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（粵）2014-0144；飼養(yǎng)環(huán)境：標(biāo)準(zhǔn)飼料和水飼養(yǎng)，室溫18~22℃、相對(duì)濕度40%~50%。

1.2 試藥與儀器 風(fēng)濕定膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20044165，0.3 g/粒，陜西健民制藥有限公司）；甲氨蝶呤片（國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644，2.5 mg/片，上海信誼藥廠(chǎng)有限公司）。雞Ⅱ型膠原（10 mg/支），完全弗氏佐劑（CFA，10 mg/支），均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；p-JAK3、JAK3單抗，p-STAT3、STAT3單抗均購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰荆籛estern blotting印跡全套試劑盒，購(gòu)于上海英拜生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器：足趾容積檢測(cè)器（WA.198-462，北京卓川電子科技有限公司）；熒光定量PCR儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）。風(fēng)濕定膠囊灌胃溶液配置：根據(jù)不同劑量將風(fēng)濕定膠囊用0.9%氯化鈉注射液沖成混懸液，低劑量（10 mg/mL）、中劑量（20 mg/mL）、高劑量（40 mg/mL），給藥體積 2 mL/100 g，大鼠風(fēng)濕定膠囊灌胃濃度按照體表面積法，根據(jù)臨床成人給藥劑量計(jì)算得到。CⅡ乳劑的配置：于無(wú)菌條件下，以0.1 moL/L的冰乙酸充分溶解Ⅱ型膠原后，置于4℃冰箱中靜置過(guò)夜。第2天取出，取等體積弗氏完全佐劑混合，經(jīng)振蕩乳化得CⅡ乳劑（CⅡ含量為1 mg/mL），置于4℃冰箱中保存，備用。

1.3 模型制備 將85只大鼠飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選出15只為空白組，其余70只均參照文獻(xiàn)［5］方法以CⅡ乳劑進(jìn)行造模：以10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，分別于每只大鼠背部及左后足跖多點(diǎn)進(jìn)行皮下注射CⅡ乳劑0.5 mL，誘導(dǎo)大鼠發(fā)生炎癥進(jìn)行造模，造模第14天隨機(jī)選取兩只進(jìn)行關(guān)節(jié)病理檢查，判斷是否成模。

1.4 分組及給藥 選取建模成功的大鼠60只隨機(jī)分為6組，分別為模型組、風(fēng)濕定膠囊低劑量組［200 mg/（kg·d）］、風(fēng)濕定膠囊中劑量組［400 mg/（kg·d）］、風(fēng)濕定膠囊高劑量組［800 mg/（kg·d）］、陽(yáng)性對(duì)照組［甲氨蝶呤 0.5 mg/（kg·d）］，模型組與空白組每日分別以等量的（4 mL）0.9%氯化鈉注射液灌胃。造模14 d后開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥4周。

1.5 觀(guān)察指標(biāo) 1）各組大鼠一般情況觀(guān)察。分別觀(guān)察各組大鼠毛發(fā)、進(jìn)食、活動(dòng)、精神狀態(tài)及體質(zhì)量變化等一般情況。大鼠足腫脹程度測(cè)定：分別以容積檢測(cè)儀測(cè)定并記錄各組給藥后第 0、7、14、20、24、28 天大鼠右后足的腫脹體積變化情況。2）大鼠滑液及滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。采用蛋白免疫印記（Western blotting）法檢測(cè)各組大鼠滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平，血管總蛋白的提?。喝「鹘M大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織于研缽中，加300 UI裂解液（按照說(shuō)明書(shū)配制1 mmoL/L的PMSF），研磨處理10 min，充分振蕩后靜置10 min，于4℃條件下以離心（14000 r/min）8 min，取上清得總蛋白；以 BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，分別取適量總蛋白，以5倍量上揚(yáng)緩沖液稀釋后，置于95℃變性處理5 min，備用；Western blotting檢測(cè)：將變性蛋白置于120 g/L的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，而后加入一抗p-JAK3、p-STAT3于4℃條件下孵育過(guò)夜，再以辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的山羊抗兔孵育后，采用BeyoECL Plus發(fā)光檢測(cè)。檢測(cè)完畢清除免疫印跡，再檢測(cè)GAPDH，操作步驟同上。以圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以二者蛋白灰度值的比值（目的蛋白/內(nèi)參GAPDH）反應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。3）關(guān)節(jié)組織病理觀(guān)察。給藥后第28天以脫頸法將大鼠處死，留取關(guān)節(jié)滑膜組織：將大鼠仰位固定，沿后肢膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)，暴露出膝關(guān)節(jié)中心約3 cm×3 cm的區(qū)域，無(wú)菌剝離出關(guān)節(jié)滑膜組織，以無(wú)菌生理鹽水清洗，快速放入1‰DEPC處理的EP管中，并存于-80℃冰箱中備用。采用免疫組化法將關(guān)節(jié)滑膜組織以4%甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，于光鏡下觀(guān)察關(guān)節(jié)滑膜組織的病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間差異分析采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病一般情況及體質(zhì)量比較

見(jiàn)表1?？瞻捉M大鼠毛色雪白有光澤、無(wú)脫毛現(xiàn)象，攝食正常，能自由活動(dòng)，精神狀態(tài)佳，足部無(wú)腫脹；模型組大鼠于造模第7天，大鼠毛色無(wú)光澤、皮膚少有脫毛，攝食及活動(dòng)減少，少有精神萎靡現(xiàn)象，后足部及踝關(guān)節(jié)發(fā)紅并伴有輕度腫脹；造模第14天大鼠背部脫毛明顯、攝食及活動(dòng)明顯減少、多數(shù)精神萎靡，雙側(cè)后足踝關(guān)節(jié)腫脹明顯并伴隨局部充血現(xiàn)象，提示造模成功。給藥治療過(guò)程中，陽(yáng)性對(duì)照組及風(fēng)濕定膠囊治療組大鼠攝食及精神狀態(tài)較模型組明顯改善，且隨治療時(shí)間延長(zhǎng)，效果越明顯。陽(yáng)性對(duì)照組及各治療組大鼠體質(zhì)量在各階段體質(zhì)量增加量均高于模型組，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，隨風(fēng)濕定膠囊劑量的增加，體質(zhì)量增加量逐漸增大。

表1 各組大鼠不同階段體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠不同階段體質(zhì)量比較（g，±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05；與風(fēng)濕定膠囊中劑量組比較，▲P＜0.05。 下同

組 別 n空白組 10模型組 10陽(yáng)性對(duì)照組 10 24 d 28 d 273.20±9.32 298.27±9.17 235.78±9.14* 246.79±9.58*269.59±7.13# 279.67±6.19#風(fēng)濕定膠囊低劑量組 10 195.24±8.19213.37±8.74#223.58±7.11# 247.68±7.14# 265.76±8.18# 282.82±8.16#風(fēng)濕定膠囊中劑量組 10 192.16±7.67 218.43±8.17#△ 235.49±7.38#△ 256.52±8.15#△ 274.57±7.27#△ 291.65±8.32#△風(fēng)濕定膠囊高劑量組 10 192.26±7.29 219.58±8.12#△▲ 241.62±8.14#△▲ 264.75±9.32#△▲ 289.62±9.86#△▲ 308.76±9.45#△▲0 d 7 d 14 d 182.45±6.54203.49±7.12 225.87±6.64 172.29±7.31196.25±8.27*213.54±8.31*196.28±7.34215.49±8.35#228.48±6.15#20 d 251.14±8.12 226.37±9.19*246.54±8.16#

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)比較 見(jiàn)圖1。各組大鼠關(guān)節(jié)病理切片HE染色顯示：空白組滑膜組織無(wú)炎癥及血管增生，細(xì)胞細(xì)胞整齊；模型組滑膜組織有不同程度的增生且存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張；陽(yáng)性對(duì)照組及風(fēng)濕定膠囊治療組中滑膜組織增生及炎癥均有所改善。且風(fēng)濕定膠囊中、高劑量組中滑膜組織細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)規(guī)則，僅存在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織僅輕度增生，血管無(wú)擴(kuò)張。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠不同階段體質(zhì)量及足腫脹體積比較

見(jiàn)表2?？瞻捉M及各治療組各階段大鼠足腫脹體積均顯著低于模型組 （P＜0.05）；隨風(fēng)濕定膠囊劑量的增加，足腫脹體積逐漸減小，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 不同階段各組大鼠足腫脹體積比較（mL，±s）

表2 不同階段各組大鼠足腫脹體積比較（mL，±s）

組 別 n空白組 10模型組 10陽(yáng)性對(duì)照組 10 24 d 28 d 1.25±0.09 1.29±0.17 1.97±0.12* 2.05±0.15*1.81±0.13# 1.82±0.19#風(fēng)濕定膠囊低劑量組 10 1.23±0.12 1.49±0.08# 1.55±0.11# 1.70±0.14# 1.79±0.18# 1.80±0.13#風(fēng)濕定膠囊中劑量組 10 1.24±0.11 1.39±0.09#△ 1.46±0.06#△ 1.54±0.13#△ 1.58±0.12#△ 1.62±0.13#△風(fēng)濕定膠囊高劑量組 10 1.25±0.13 1.32±0.05#△▲ 1.38±0.08#△▲ 1.43±0.08#△▲ 1.45±0.13#△▲ 1.49±0.14#△▲0 d 7 d 14 d 0.98±0.08 1.06±0.12 1.12±0.14 1.28±0.12 1.57±0.07* 1.73±0.15*1.25±0.15 1.50±0.06# 1.57±0.14#20 d 1.18±0.12 1.89±0.13*1.72±0.16#

2.4 各組大鼠滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3和圖2。各組間JAK3蛋白及STAT3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組及各治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白組（P＜0.05）；隨風(fēng)濕定膠囊劑量的增加，p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平逐漸下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n空白組 10模型組 10陽(yáng)性對(duì)照組 10 JAK3蛋白 P-JAK3蛋白 STAT3蛋白 P-STAT3蛋白0.63±0.02 0.58±0.03 0.71±0.05 0.67±0.14 0.65±0.03 1.89±0.16* 0.75±0.06 2.75±0.22*0.62±0.05 1.28±0.18# 0.78±0.06 1.74±0.15#風(fēng)濕定膠囊低劑量組 10 0.59±0.04 1.32±0.15# 0.76±0.04 1.69±0.17#風(fēng)濕定膠囊中劑量組 10 0.64±0.03 1.16±0.19#△ 0.69±0.09 1.32±0.14#△風(fēng)濕定膠囊高劑量組 10 0.62±0.02 0.86±0.08#△▲ 0.74±0.07 0.92±0.11#△▲

3 討 論

圖2 各組大鼠p-JAK3、p-STAT3蛋白免疫印跡

RA是一種常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病率約為0.5%，且發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)［6］。因RA患者均存在不同程度的關(guān)節(jié)功能障礙嚴(yán)重影響工作能力，且因自身免疫系統(tǒng)失調(diào)，極易引起感染及心血管疾病，給患者身心及日常生活帶來(lái)極大危害［7-8］。因目前針對(duì)RA的具體發(fā)病機(jī)理尚不明確，針對(duì)RA的治療，臨床西藥多為激素類(lèi)藥物，長(zhǎng)期服用引起的不良反應(yīng)極大降低了患者順應(yīng)性，而導(dǎo)致病情無(wú)法得到及時(shí)控制［9］。而中醫(yī)藥則首先從其病機(jī)根源“弊病”出發(fā)，辨證治療，以扶正祛邪為原則，整體把握其發(fā)病趨勢(shì)，取得了可喜的療效［10-11］。目前中醫(yī)藥針對(duì)RA的治療常使用具有清熱解毒、祛風(fēng)散寒、活血化瘀等功效的中藥復(fù)方，雖取得了一定療效，但針對(duì)其具體的作用機(jī)理研究仍待進(jìn)一步深入研究。

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號(hào)通路是體內(nèi)一種重要的多功能細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與體內(nèi)多種病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等［12-13］。既往研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路在癌癥［14-15］、心血管系統(tǒng)［16］、代謝系統(tǒng)疾?。?7］等發(fā)展過(guò)程中起重要調(diào)控作用，針對(duì)在RA發(fā)病過(guò)程中的研究較少。近年來(lái)隨著臨床研究者對(duì)RA的不斷深入研究，針對(duì)RA中的相關(guān)JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制研究亦逐漸增多，Malemud CJ等研究表明，部分抗抑郁藥物可能通過(guò)調(diào)控腦組織中SAPK/MAPK、JAK/STAT等信號(hào)通路抑制炎癥因子發(fā)揮對(duì)RA患者的治療作用［18］。Walker JG等研究表明，隨著對(duì)RA患者的治療，RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中的 JAK3、STAT1、STAT4、STAT6 均逐漸降低［19］。wierkot J等［20］研究表明，RA患者關(guān)節(jié)滑液及外周血中STATs的表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組，以上研究均提示JAK/STAT信號(hào)通路可能參與調(diào)控RA疾病的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果表明，模型組及各治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），與上述研究結(jié)果一致。

風(fēng)濕定膠囊由八角楓、白芷、徐長(zhǎng)卿、甘草組成，具有活血通絡(luò)、消腫、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效，為臨床治療RA的常用中成藥之一，但針對(duì)其治療機(jī)理目前尚不明確。在此背景下，本研究通過(guò)觀(guān)察風(fēng)濕定膠囊對(duì)RA大鼠滑膜組織病理、足腫脹體積的影響及測(cè)定關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的變化，探究其治療RA的相關(guān)分子機(jī)制，以期為臨床風(fēng)濕定膠囊的推廣提供一定理論依據(jù)。研究結(jié)果表明，治療4周后，陽(yáng)性對(duì)照組及風(fēng)濕定膠囊治療組中滑膜組織增生、炎癥及大鼠足腫脹癥狀均較模型組有顯著改善。且風(fēng)濕定膠囊中、高劑量組中滑膜組織細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)規(guī)則，僅存在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且滑膜組織僅輕度增生，血管無(wú)擴(kuò)張，接近空白組；隨風(fēng)濕定膠囊劑量的增加，大鼠足腫脹體積均逐漸減小，且中、高劑量組治療效果顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組 （P＜0.05）；隨風(fēng)濕定膠囊劑量的增加，關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JAK3、p-STAT3的蛋白表達(dá)水平均逐漸下調(diào)，且中、高劑量組下調(diào)效果顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）；提示風(fēng)濕定膠囊可能通過(guò)下調(diào)p-JAK3、p-STAT3蛋白蛋白的表達(dá)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路，進(jìn)而改善RA的病癥。

綜上所述，風(fēng)濕定膠囊可能通過(guò)下調(diào)p-JAK3、p-STAT3蛋白的表達(dá)，參與JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)RA的治療作用。但具體的信號(hào)調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究及大量臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。