劉 藝 鄧琳雯 謝 萍

（成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610075）

盆腔炎屬于臨床常見婦科炎癥，常累及卵巢、子宮，導致輸卵管炎、輸卵管卵巢炎，子宮內(nèi)膜炎等，病情加重則發(fā)展為感染性休克、敗血癥等，嚴重危害婦女身心健康，因此探究其發(fā)病機制，對于急性盆腔炎的治療、預后均有十分積極的意義［1］。c-Jun氨基末端激酶（JNK）/p38信號通路為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路重要成員，參與多種炎癥疾病的發(fā)生［2］，近期動物研究顯示JNK信號通路參與盆腔炎的發(fā)生，抑制通路活性后，可抑制炎癥因子的表達，進而緩解病情［3］。慢性盆腔炎中研究顯示，抑制p38信號通路后可抑制巨噬細胞浸潤，進而緩解炎癥反應［4］。以上研究均表明JNK/p38信號通路可能與盆腔炎的發(fā)生有關。本研究通過制備急性盆腔炎大鼠，并給予婦炎湯治療，以探究婦炎湯對JNK/p38信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雌性Wistar大鼠72只，體質量200~220 g，8周鼠齡，購于河南省醫(yī)藥科學研究院，許可證號：SYXK （豫）2016-0008。所有大鼠均在同一條件下飼養(yǎng)，恒溫25℃，濕度為50%，期間大鼠自由飲水、攝食，飼養(yǎng)1周后進行模型制備。

1.2 試劑與儀器 1）試藥：婦炎湯（組成：丹參、薏苡仁、敗醬草各20 g，金櫻子根10 g，梔子8 g），置于冷水中浸泡1 h，蒸煮30 min后濃縮至質量濃度為2 g/mL。婦科千金片，株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：161013，規(guī)格：0.32 g/片。解脲支原體、大腸桿菌（菌種號：336902）、金黃色葡萄球菌（菌種號：186335）購于北納生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自于碧云天公司，批號：20160916、20160725；兔抗鼠JNK、p-JNK、p38、p-p38抗體均購自于美國Gibco 公司， 批號分別為 20160803、20160912、20160819、20160725；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二體、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 抗體購自于美國 Amresco公司，批 號 分 別 為 20161014、 20100924、20160922、20161003、20161017；結晶紫染液購自于北京中杉金橋生物技術有限公司批號：20161013。2）儀器：倒置顯微鏡購于Olympus公司，批號：20130607；蛋白凝膠成像儀購自于Bio-Red公司，批號：20131117。

1.3 分組及造模 72只大鼠隨機抽取12只作為假手術組，剩余大鼠造模。參照文獻［5］制備大鼠急性盆腔炎模型，除假手術組外，其余60只大鼠均采用3%戊巴比妥鈉麻醉后，注射0.5 mL濃度為3×1012/L的菌懸液（支原體、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌三者比例為1∶1∶1混勻），在陰道底部子宮頸分叉處進針進入宮腔中，并在宮腔中反復抽拉造成子宮內(nèi)膜機械損傷，隨后沿卵巢方向注入0.1 mL混合菌懸液，按照同樣操作將等量菌液注入另側宮腔，結束后將海綿置于陰道底部以防滲出。假手術組大鼠操作與模型組相同，但沿卵巢方向僅注射等量生理鹽水。大鼠造模成功后，隨機分為模型組、婦炎湯治療組（低、中、高劑量）、陽性組（婦科千金片）各12只。

1.4 干預方法 造模結束后第5日，婦炎湯低、中、

高、劑量組分別予婦炎湯 4、8、16 g/（kg·d）進行給藥。陽性組給予婦科千金片，劑量為0.2 g/（kg·d）。假手術組給予等容積蒸餾水50 mL，所有大鼠每天均給藥1次，連續(xù)給藥3周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 組織學觀察 給藥結束后次日清晨，采用7.5 mL/kg烏拉坦麻醉后，將大鼠斷頭處死，分別獲取卵巢、子宮組織，將組織中一部分置于10%多聚甲醛中固定，另一部分置于-80℃冰箱中進行保存。將固定后的組織進行石蠟包埋、切片及HE染色，置于顯微鏡下觀察組織病理學改變。組織病理學評分，子宮、卵巢等組織未出現(xiàn)出血、水腫、炎癥細胞浸潤等為0分；結構不清晰，出現(xiàn)輕度水腫，少量炎性細胞浸潤為1分，組織結構模糊，出血、水腫以及出現(xiàn)炎癥細胞浸潤為2分；組織被破壞，結構模糊，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤為3分。

1.5.2 外周血細胞測定 大鼠斷頭處死后取血，采用血細胞分析儀測定血液中淋巴細胞、白細胞、嗜酸性粒細胞等。

1.5.3 蛋白免疫印跡法檢測JNK/p38信號通路、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10蛋白 取出保存子宮、卵巢組織，加入IPA裂解緩沖液冰上放置30 min，采取蛋白提取試劑盒提取組織中總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度。用SDS-PAGE分離等量蛋白質，并轉移至PDVF膜上，置于4℃下添加一抗與β-actin（1∶500）孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶500）常溫下孵育2 h。采用ECL發(fā)光試劑顯影后，使用Quantity One軟件分析蛋白相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩對比采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組外周血中細胞測定結果比較 見表1。與假手術組相比，模型組白細胞數(shù)、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞、嗜中粒細胞數(shù)均升高（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組白細胞數(shù)、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞、嗜中粒細胞數(shù)均降低，具有劑量依賴性（P＜0.05）。

表1 各組外周血白細胞數(shù)量測定結果比較（±s）

表1 各組外周血白細胞數(shù)量測定結果比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，◇P＜0.05。 下同

組 別 n假手術組 12模型組 12低劑量組 12嗜酸粒細胞（%）嗜中粒細胞（%）2.12±0.36 29.13±2.10 3.63±0.27* 70.92±3.87*3.14±0.15# 51.65±2.98#中劑量組 12 1.24±0.32#△ 42.13±2.33#△ 3.59±0.19#△ 2.78±0.33#△ 42.08±2.24#△高劑量組 12 1.11±0.25#△◇ 51.76±2.74#△◇ 3.32±0.34#△◇ 2.32±0.36#△◇ 33.10±3.17#△◇陽性組 12 1.06±0.31# 52.84±2.83# 3.29±0.26# 2.02±0.26# 26.13±2.07#白細胞數(shù)（×109/L） 淋巴細胞（%）單核細胞（%）1.08±0.16 21.63±2.84 3.52±0.41 1.67±0.42* 61.65±2.87* 5.23±0.39*1.43±0.35# 33.48±2.57# 4.44±0.27#

2.2 各組卵巢、子宮組織病理學檢測結果 見圖1~圖2，表2。假手術組卵巢組織正常，未出現(xiàn)充血、炎癥細胞浸潤；模型組卵巢嚴重充血和出血，且出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤；婦炎湯低劑量組仍存在充血，高劑量組充血、出血明顯減少；陽性組卵巢基本恢復正常，見圖1。假手術組子宮壁組織分界清晰，上皮細胞排列整齊，血管無充血、炎癥浸潤；模型組子宮壁組織分界模糊，上皮細胞出現(xiàn)壞死、脫落，出現(xiàn)水腫，血管充血以及炎癥細胞浸潤；經(jīng)婦炎湯、婦科千金片治療后，上述癥狀均得到緩解，見圖2。與假手術組相比，各給藥組卵巢、子宮病理評分均升高；與模型組相比，各給藥組卵巢、子宮病理評分均降低，且婦炎湯作用具有劑量依賴性（P＜0.05），見表 2。2.3 各組子宮、卵巢中JNK/p38信號通路蛋白表達見圖3~圖4，表3。與假手術組相比，模型組p-JNK、p-p38蛋白表達升高；與模型組相比，各給藥組p-JNK、p-p38蛋白表達降低，且婦炎湯作用具有劑量依賴性（P＜0.05）。各組間JNK、p38蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。

圖1 卵巢組織病理檢測結果（HE染色，200倍）

圖2 子宮組織病理檢測結果（HE染色，200倍）

表2 各組大鼠卵巢、子宮組織病理評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠卵巢、子宮組織病理評分比較（分，±s）

組 別 n 卵巢 子宮假手術組 12 0.16±0.04 0.15±0.04模型組 12 3.56±0.65* 3.44±0.35*低劑量組 12 2.47±0.53# 2.87±0.63#中劑量組 12 1.88±0.62#△ 2.18±0.35#△高劑量組 12 1.26±0.38#△◇ 1.56±0.42#△◇陽性組 12 0.64±0.18# 1.14±0.17#

圖3 子宮組織中JNK/p38信號通路蛋白表達

圖4 卵巢組織中JNK/p38信號通路蛋白表達

表3 各組大鼠組織中JNK/p38信號通路蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠組織中JNK/p38信號通路蛋白表達比較（±s）

組 別 n 子宮假手術組 12 JNK p-JNK p-JNK p38 p-p38 0.88±0.09 0.21±0.03 0.73±0.16 0.18±0.03卵巢JNK p-JNK p-JNK p38 p-p38 0.75±0.12 0.34±0.04 0.63±0.06 0.15±0.04模型組 12低劑量組 12中劑量組 12高劑量組 12陽性組 12 0.85±0.07 0.92±0.16* 0.77±0.15 1.14±0.23*0.83±0.08 0.77±0.12# 0.74±0.16 0.86±0.18#0.89±0.06 0.46±0.42#△ 0.79±0.14 0.68±0.14#△0.88±0.09 0.31±0.04#△◇ 0.73±0.16 0.37±0.03#△◇0.85±0.07*0.27±0.06# 0.77±0.21 0.34±0.05#0.77±0.14 1.22±0.08* 0.67±0.05 1.12±0.26*0.79±0.14 0.92±0.09# 0.64±0.06 0.87±0.05#0.78±0.15 0.77±0.06#△ 0.69±0.04 0.66±0.12#△0.73±0.14 0.49±0.08#△◇ 5.13±0.96 0.41±0.05#△◇0.77±0.09 0.38±0.03# 6.07±1.25 0.22±0.05#

2.4 各組子宮、卵巢中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 蛋白表達比較 見圖5~圖6，表4。與假手術組相比，模型組子宮、卵巢中TNF-α、IL-1β、IL-8蛋白表達升高，IL-10蛋白表達降低；與模型組相比，各給藥組子宮、卵巢中 TNF-α、IL-1β、IL-8 蛋白表達降低，IL-10 蛋白表達升高，且婦炎湯作用具有劑量依賴性（P＜0.05）。

圖5 子宮組織中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10蛋白表達

圖 6 卵巢組織中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10蛋白表達

表 4 各組子宮、卵巢組織中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 表達比較（±s）

表 4 各組子宮、卵巢組織中 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 表達比較（±s）

組 別 n 子宮假手術組 12 TNF-α IL-1β IL-8 IL-10 0.18±0.03 0.14±0.03 0.13±0.03 1.06±0.23卵巢TNF-α IL-1β IL-8 IL-10 0.15±0.02 0.14±0.03 0.23±0.03 0.22±0.05模型組 12低劑量組 12中劑量組 12高劑量組 12陽性組 12 1.24±0.15* 0.84±0.05* 1.07±0.25* 0.37±0.06*0.89±0.13# 0.67±0.08# 0.74±0.15*# 0.55±0.13#0.58±0.14#△ 0.53±0.06#△ 0.56±0.14*#△ 0.68±0.19#△0.43±0.06#△◇ 0.38±0.05#△◇ 0.43±0.08#△◇ 0.97±0.08#△◇0.24±0.05# 0.25±0.02# 0.32±0.03# 1.02±0.32#1.17±0.24* 0.82±0.08* 1.07±0.13* 0.15±0.04*0.95±0.14# 0.67±0.09# 0.84±0.06# 0.87±0.05#0.78±0.07#△ 0.41±0.06#△ 0.69±0.04#△ 0.66±0.12#△0.43±0.06#△◇ 0.49±0.0#△◇ 0.43±0.11#△◇ 0.41±0.05#△◇0.22±0.04# 0.38±0.03# 0.37±0.04# 0.91±0.05#

3 討 論

急性盆腔炎在中醫(yī)學中屬于 “帶下”“腹痛”等范疇，主要由于氣滯、正氣不足、濕熱等引起，因此應將清熱利濕、活血化瘀、益氣扶正等作為治療目的［6］。婦炎湯中的丹參可促行氣，敗醬草可清熱解毒，金櫻子根可活血化瘀，薏苡仁可利水滲透濕，對急性盆腔炎的治療具有一定的功效。高薇煒研究顯示婦炎湯對慢性盆腔炎治療效果較好，能夠促進血循環(huán)，提高患者機體自身抗炎力［7］。馬德芬研究顯示婦炎湯對濕熱型盆腔炎治療效果較好，患者治療后帶下量多及腹痛等癥狀均得到明顯改善［8］。以上研究均表明婦炎湯治療盆腔炎療效較好，但對于其作用機制，目前研究不多，本研究通過制備急性盆腔炎模型大鼠，給予婦炎湯治療，以探究婦炎湯作用機理。

機體發(fā)生急性或慢性炎癥反應時候外周血中白細胞數(shù)量也會出現(xiàn)不同的變化，不同類型的白細胞比例也會發(fā)生改變［9］，本研究通過對大鼠外周血中血細胞成分進行分析顯示，模型組白細胞數(shù)、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞、嗜中粒細胞數(shù)均明顯高于假手術組，病理結果提示模型組子宮、卵巢組織均出現(xiàn)充血、炎癥細胞浸潤，提示急性盆腔炎大鼠模型制備成功。在經(jīng)婦炎湯治療后白細胞數(shù)、淋巴細胞、單核細胞等均明顯降低，子宮、卵巢組織中炎性細胞浸潤得到明顯緩解，提示婦炎湯可能通過調控機體免疫力發(fā)揮抗炎作用。另有研究顯示婦炎湯可降低急性盆腔炎大鼠炎癥反應，降低組織內(nèi)炎性細胞的浸潤［10］，這一觀點支持本研究結果，但其具體藥理機制，目前尚不清楚。

JNK、p38為MAPK家族成員，參與較多炎癥反應，是重要的炎性信號通路。研究顯示機體受到炎癥損傷可導致JNK、p38發(fā)生磷酸化，促進細胞釋放較多炎性因子，進而活化中性粒細胞等炎性因子，放大炎癥反應［11］。研究顯示促進JNK信號通路，可能促進卵巢癌細胞的增殖促進其侵襲、遷移［12］。在氟化鈉誘導的子宮內(nèi)膜炎中研究顯示，p38磷酸化水平明顯升高，提示p38可能參與子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組子宮、卵巢組織中p38、JNK磷酸化水平增加，提示JNK/p38信號通路的活化與子宮、卵巢組織炎癥損傷有關。梁照研究發(fā)現(xiàn)化瘀通絡法能明顯降低大鼠盆腔組織MAPK活性及蛋白表達水平，抑制MAPK活化，可降低盆腔組織炎癥損傷［14］。與此一致，本研究結果顯示經(jīng)婦炎湯治療后p38、JNK磷酸化水平降低，提示婦炎湯可能通過抑制JNK/p38信號通路磷酸化進而發(fā)揮抗炎作用，減輕組織炎癥損傷。

JNK/p38信號通路能夠被炎癥、缺血、缺氧等激活。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子通過使JNK/p38通路蛋白磷酸化，擴大炎癥反應，進一步促進炎性細胞釋放促炎細胞因子，加重炎癥損傷［15］。尤良震等發(fā)現(xiàn)，大鼠組織中p-JNK、p-p38表達的上調與 IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平上調一致，證實JNK/p38信號通路的激活能夠促進炎性細胞因子釋放加重炎癥損傷［16］。本研究進一步對信號通路下游有關炎癥因子進行檢測，結果顯示模型組 TNF-α、IL-1β、IL-8 蛋白表達升高，IL-10 蛋白表達降低。給予婦炎湯治療后，子宮、卵巢中TNF-α、IL-1β、IL-8蛋白表達降低，IL-10蛋白表達升高，結合過往研究推測，婦炎湯能夠抑制子宮、卵巢組織中JNK/p38信號通路激活，減少炎癥細胞因子分泌，進一步抑制炎癥細胞因子相關基因的表達，減少組織中炎性細胞浸潤，緩解子宮、卵巢組織炎癥損傷。

綜上所述，婦炎湯對急性盆腔炎大鼠具有保護作用，這可能與抑制子宮、卵巢組織中JAK2/STAT3信號通路激活有關。然而，本研究中婦炎湯僅能部分緩解組織損傷及炎癥反應，而非完全逆轉組織損傷，這可能與藥物劑量有關，也有可能受其他因素的影響，這還有待后續(xù)深入探究，以期為急性盆腔炎的治療提供更有力的證據(jù)。