金佳佳 陳建華 季曉亮 楊偉剛

（浙江省湖州市中醫(yī)院，浙江 湖州 313000）

急性乳腺炎是乳房急性感染性疾病，主要為金黃色葡萄球菌感染，本病占乳腺感染性疾病的75%，在哺乳期多發(fā)，初產(chǎn)婦更為多見(jiàn)，發(fā)病多在產(chǎn)后3~4周［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，20%的哺乳期婦女曾患哺乳期急性乳腺炎［2］，一旦延誤治療，乳腺膿腫的發(fā)病率顯著上升。乳腺膿腫治療周期長(zhǎng)，要經(jīng)歷乳腺膿腫穿刺或手術(shù)引流等有創(chuàng)性操作，影響乳房外觀和產(chǎn)后哺乳，不利于身心健康。所以，如何有效地治療急性乳腺炎已經(jīng)成了一個(gè)迫在眉睫的問(wèn)題。而現(xiàn)代多項(xiàng)研究表明，蒲公英對(duì)治療急性乳腺炎效果顯著［3］。為此，本實(shí)驗(yàn)觀察蒲公英多糖穴位離子導(dǎo)入對(duì)急性乳腺炎大鼠的抗炎作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD雌性已孕大鼠100只，體質(zhì)量 220～260 g，80～110 d齡，采購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證：X1602249）。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)室［溫度（22±1） ℃，濕度 50%～70%，光照 150～200 Lx，噪音＜50 dB］，12 h明暗循環(huán)，各數(shù)據(jù)均能自動(dòng)控制和顯示。大鼠全部滅菌，自由采食全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，自由飲用高壓滅菌水。

1.2 儀器與設(shè)備 ABE-Ⅲ型智能通絡(luò)治療儀 （鄭州愛(ài)博爾醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；AG204-電子分析天平，瑞士METTLER公司；AF100雪花狀制冰機(jī)，美國(guó)SCOTSMAN公司，STP120脫水機(jī)、AP280-2包埋機(jī)、HM335E切片機(jī)、HMS70染色機(jī)，MICROM公司，YS100顯微鏡，日本NIKON公司（以上均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供使用）；無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠，SW～CJ～ZF）；CR21 型高速冷凍離心機(jī)（HITACHI生產(chǎn)）；動(dòng)物測(cè)溫儀（北京鴻鷗成運(yùn)科技有限公司，型號(hào) TH212）測(cè)溫范圍：-30～50 ℃，精度：±0.2 ℃，分辨率：0.1℃，標(biāo)準(zhǔn)傳感器規(guī)格：Φ33 20 mm（大鼠）；導(dǎo)藥襯墊為自制，用半徑為2.1 cm的圓形8層無(wú)菌紗布制成；大鼠固定板（自制）；1 mL一次性注射器、5 mL一次性注射器、量筒、量杯、燒杯、鑷子、止血鉗、手術(shù)剪、眼科剪、試管、吸管、微量移液器、絲線、醫(yī)用紗布膠布、棉簽等。

1.3 藥物與試劑 蒲公英多糖［西安千草生物技術(shù)有限公司，規(guī)格 30%（UV 紫外檢測(cè)），批號(hào)：001］；阿莫西林（廣州白云山天心制藥股份有限公司，規(guī)格0.25g，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024600）。金黃色葡萄球，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，平板稀釋計(jì)數(shù)法將濃度調(diào)整1.5×108CFU/mL；TNF-α、IL-1β 和 IL-6 血清酶免試劑盒，購(gòu)于武漢谷歌生物科技有限公司；蘇木精-伊紅用于組織切片的染色 （HE染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1120）［4］；蒸餾水（自制），生理鹽水，10%的甲醛溶液，龍膽紫，碘伏，醫(yī)用75%乙醇，醫(yī)用凡士林等（上海榮柏生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。

1.4 造模與分組 動(dòng)物在溫度20～25℃、相對(duì)濕度60%左右、水和標(biāo)準(zhǔn)飼料充足條件下飼養(yǎng)，稱重后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組20只：分別為空白對(duì)照組、模型組、蒲公英穴位離子導(dǎo)入高強(qiáng)度組、蒲公英穴位離子導(dǎo)入低強(qiáng)度組、阿莫西林組。各組雌鼠產(chǎn)后1～6 d后經(jīng)10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，用75%的酒精對(duì)第4對(duì)乳腺區(qū)域進(jìn)行消毒。除空白對(duì)照組外，其余4組80只雌鼠麻醉后固定，用小鑷子輕輕夾起乳頭，用帶鈍性針頭的1 mL注射器輕輕刺破皮膚經(jīng)乳頭管插入，每側(cè)注入50 μL的1.5×108CFU/mL金黃色葡萄球菌懸濁液。80只大鼠中75只大鼠感染16 h后腹部可見(jiàn)輕微腫大，第4對(duì)乳腺區(qū)域腫脹變硬，充血，體溫升高，飲水和采食改變，豎毛、精神萎靡，蜷縮在籠子一角，活動(dòng)量減少，整體觀察與空白對(duì)照組有明顯不同，表明模型復(fù)制成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 1）動(dòng)物穴位定位。穴位的定位選取根據(jù)李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［5］，以比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)。乳根：在胸部，第5肋間隙，前正中線旁開(kāi)4寸。膻中：在胸部，橫平第4肋間隙，前正中線上。2）蒲公英多糖離子導(dǎo)入液配制。蒲公英多糖：取蒲公英干品回流提取、離心，沉淀部分用無(wú)水乙醇脫水2次，返溶凍干，凍干品為粗多糖。取粗多糖溶于超濾水中，濾液過(guò)柱，洗脫液經(jīng)8 kD膜包超濾，收集循環(huán)液，凍干為總多糖。同時(shí)收集透過(guò)液，濃縮凍干，為小分子對(duì)照品。取蒲公英多糖60 g，予1000 mL蒸餾水稀釋，備用。3）動(dòng)物治療及對(duì)照處理。造模成功24 h后，高強(qiáng)度組大鼠取仰臥位并固定于大鼠固定板，將前胸部皮膚備皮并充分顯露，將治療儀輸出線一端插入輸出孔，另一端的正、負(fù)兩個(gè)治療電極板內(nèi)放入已在蒲公英多糖離子液中浸濕的自制襯墊；先用75%的酒精涂擦前胸部皮膚，再將正、負(fù)電極板分別置于“乳根”及“膻中”穴上，接通電源選擇電流深度為6級(jí)，強(qiáng)度為45 Hz進(jìn)行治療；低強(qiáng)度組大鼠電流強(qiáng)度為30 Hz，其余處理同高強(qiáng)度組；空白對(duì)照組與模型組大鼠于造模24 h后，自制襯墊予蒸餾水浸濕，其余處理同高強(qiáng)度組；阿莫西林組予阿莫西林混懸液（含藥150 mg/kg灌胃）。各組大鼠分別按照以上方法進(jìn)行處理，不同的電流強(qiáng)度大鼠均能耐受，每次20 min，每日1次，1周為1個(gè)療程，連續(xù)治療2周觀察相應(yīng)指標(biāo)。期間飼料和飲用水準(zhǔn)備充足。1.6 觀察指標(biāo) 1）病理觀察。用頸椎脫臼方法處死大鼠，選取第4對(duì)乳腺區(qū)，以乳頭為中心取直徑為1 cm，深度穿透皮膚層進(jìn)行取材，取致炎術(shù)后各組大鼠乳腺組織，行免疫組化試驗(yàn)并作病理切片，比較對(duì)照組與給藥組間組織病理學(xué)變化之差異。2）血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量。根據(jù)大鼠當(dāng)天體質(zhì)量給予0.3 mL/100 g水合氯醛，待其麻醉后，在木板上固定，切開(kāi)腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，持一次性采血針頭（前針頭）平刺腹主動(dòng)脈，見(jiàn)血后將采血針尾端（后針頭）插入抗凝真空負(fù)壓采血管內(nèi)，取血液1 mL后更換非抗凝管取血液3 mL。采血后抗凝真空負(fù)壓采血管上下顛倒混合5～10次。對(duì)采血管進(jìn)行標(biāo)記。由我院檢驗(yàn)科測(cè)定白細(xì)胞計(jì)數(shù)。將非抗凝采血管放置于離心機(jī)中，離心轉(zhuǎn)速約為2000 r/min，離心15 min后取上清液0.8 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠各指標(biāo)的含量。3）乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)：取各組乳腺組織一份固定于10%的甲醛溶液中48 h。經(jīng)過(guò)逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，超薄切片，備用。將石蠟包埋的乳腺組織切成3 μm薄片、脫蠟、水化、蒸餾水等沖洗，經(jīng)過(guò)蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察各組乳腺組織形態(tài)學(xué)改變，包括水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料應(yīng)用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組病理切片結(jié)果 見(jiàn)圖1。空白對(duì)照組：大鼠乳腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，未看到明顯的病理變化。模型組：外膜間質(zhì)有淋巴細(xì)胞 ，腺泡上皮細(xì)胞脫落，有明顯充血情況，空泡變性。蒲公英穴位離子導(dǎo)入高強(qiáng)度組：腺泡未脫落，治療效果最好。阿莫西林組：輕微充血，有上皮細(xì)胞脫落；癥狀減輕，外膜結(jié)構(gòu)清晰。蒲公英穴位離子導(dǎo)入低強(qiáng)度組：腺泡飽滿，充血不明顯，癥狀明顯減輕，外膜未見(jiàn)淋巴細(xì)胞，正常腺泡較多，個(gè)別有脫落。

圖1 各組大鼠乳腺病理組織學(xué)切片（HE染色，400倍）

2.2 各組血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，模型組血清中的TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的含量顯著升高 （P＜0.05）；與模型組相比，蒲公英穴位離子導(dǎo)入高強(qiáng)度組、蒲公英穴位離子導(dǎo)入低強(qiáng)度組、阿莫西林組血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s）

表1 各組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組別 n IL-6（pg/mL）空白對(duì)照組 20 8.81±2.11模型組 20 153.44±37.15*阿莫西林組 20 127.42±28.36△TNF-α（ng/L） IL-1β（pg/mL）11.51±3.42 57.25±15.13 39.37±12.12*186.35±38.43*30.23±8.36△ 154.25±37.13△低強(qiáng)度組 20 85.16±19.43△21.34±7.31△ 108.36±27.21△高強(qiáng)度組 20 14.61±5.43△ 73.53±19.12△ 34.25±5.33△

2.3 各組乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組乳腺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒲公英穴位離子導(dǎo)入高強(qiáng)度組、蒲公英穴位離子導(dǎo)入低強(qiáng)度組、阿莫西林組中乳腺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

急性乳腺炎多發(fā)于哺乳期，病因分感染性和非感染性兩種［6］，前者多由金黃色葡萄球菌感染所致，一般有紅腫熱痛，或發(fā)熱等全身癥狀，很多哺乳期女性會(huì)經(jīng)歷輕重程度不同的的乳腺炎，嚴(yán)重影響泌乳，不利于母嬰身心健康［7-9］。西醫(yī)一般常規(guī)采用抗生素治療，此方法不僅影響哺乳，而且經(jīng)乳汁的抗生素可進(jìn)入嬰兒體內(nèi)，影響嬰兒發(fā)育［10-11］。

表2 各組乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較（±s）

表2 各組乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)比較（±s）

組 別 n IL-6（pg/mL）空白對(duì)照組 20 1.00±0.13模型組 20 36.45±0.89*阿莫西林組 20 12.42±0.67△TNF-α（ng/L） IL-1β（pg/mL）1.01±0.01 1.00±0.08 4.36±0.19* 13.07±0.86*1.31±0.06△ 9.55±0.35△低強(qiáng)度組 20 1.42±0.81△0.51±0.05△ 2.36±0.31△高強(qiáng)度組 20 0.82±0.04△ 0.42±0.03△ 0.69±0.07△

其中TNF-α、IL-1β、IL-6等是目前公認(rèn)的主要促炎因子，這些因子在生物損傷和SIRS的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其通過(guò)分泌量增加及各種炎癥因子的瀑布式釋放產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。TNF-α在細(xì)菌等感染后直接升高，特異性高，是炎癥反應(yīng)的首要因素；IL-1β則是通過(guò)改變前炎癥介質(zhì)或抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和影響組織多型核中性粒細(xì)胞聚集而促進(jìn)炎癥的發(fā)展，引起組織細(xì)胞損傷［12-13］；IL-6對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞增殖、分化均有促進(jìn)作用，同時(shí)IL-6與其受體結(jié)合活化絲氨酸/蘇氨酸激酶促 CRP產(chǎn)生［14］，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程［15］，故 IL-1β、IL-6 對(duì)炎癥反應(yīng)的發(fā)生起到協(xié)同作用。

蒲公英味苦甘，性寒，無(wú)毒，入肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛散瘀、養(yǎng)陰涼血、通乳益精、利尿通淋等功效［16］?，F(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英中含有多種有效成分，如胡蘿卜素類、三萜類、植物甾醇類、倍半萜內(nèi)酯類、香豆素類、黃酮類等［17］。炎癥是臨床最為常見(jiàn)的病理過(guò)程之一，因此抗炎中藥的研發(fā)尤為重要。蒲公英分布廣泛，價(jià)格低廉，目前蒲公英外敷治療急性乳腺炎的研究較多，且效果確切，但蒲公英提取物聯(lián)合穴位離子導(dǎo)入這種新型的給藥方式的研究甚少，且作用機(jī)制尚未明確。

本研究顯示與模型組比較，蒲公英多糖穴位離子導(dǎo)入能明顯減輕乳腺組織的病理?yè)p傷，蒲公英多糖高強(qiáng)度組、蒲公英多糖低強(qiáng)度組、阿莫西林組血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），且乳腺組織中 TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量均顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。由此得出，蒲公英多糖能夠有效降低急性乳腺炎大鼠的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)和修復(fù)乳腺組織細(xì)胞，且進(jìn)一步證實(shí)蒲公英多糖通過(guò)高強(qiáng)度穴位離子導(dǎo)入的給藥方式抗炎作用更強(qiáng)，穴位離子導(dǎo)入能夠促進(jìn)藥物的滲透與吸收。穴位離子導(dǎo)入法在直流電的作用下，用直流穩(wěn)壓電源，使藥物離子循序漸進(jìn)地透過(guò)皮膚導(dǎo)入穴位。其優(yōu)勢(shì)明顯，首先藥物不經(jīng)過(guò)肝臟“首過(guò)效應(yīng)”和胃腸道破壞，降低毒副作用，可維持穩(wěn)定、持久的血藥濃度；其次穴位是臟腑氣血匯集之處［18］，現(xiàn)代科學(xué)證明了人和動(dòng)物的經(jīng)絡(luò)穴位具有較周圍皮膚阻抗低、電容大等特征，且經(jīng)絡(luò)穴位對(duì)滲透藥物的效果更佳。劉建平等［19］用氨茶堿膜劑平喘作用實(shí)驗(yàn)，證實(shí)穴位電阻值確實(shí)低于非穴位電阻值，且能促進(jìn)藥物的吸收。但穴位離子導(dǎo)入具體的信號(hào)通路應(yīng)進(jìn)一步研究和探討。

總之，蒲公英多糖穴位離子導(dǎo)入法，根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論將中藥提取物、經(jīng)絡(luò)穴位與離子導(dǎo)入有機(jī)融合，既有穴位刺激作用，又有中藥治療效果，具有明顯的疏通經(jīng)脈、調(diào)和氣血的功效［20］，在局部產(chǎn)生藥物濃度的相對(duì)優(yōu)勢(shì)，發(fā)揮最大的全身藥理作用。而本研究這種新型的給藥方式能夠抑制急性乳腺炎大鼠促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及表達(dá)，最終發(fā)揮抗炎作用，為臨床治療急性乳腺炎提供了新的思路。