張一凡，李昌輝，李平蘭，張金蘭，胡錦蓉，張 瑩*

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

發(fā)酵香腸是指將絞碎的肉（常指豬肉或牛肉）和動物脂肪同糖、鹽、發(fā)酵劑和香辛料等混合后灌進腸衣，經(jīng)過微生物發(fā)酵而制成的具有穩(wěn)定微生物特性和典型發(fā)酵香味，并且具有較長保質期的發(fā)酵肉制品[1]。肉制品發(fā)酵劑在發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中具有理想的代謝活性[2]，能夠產(chǎn)生有助于風味和產(chǎn)品發(fā)酵成熟所需的特殊酶系[3]，有利于人體消化[4]，且能夠抑制腐敗微生物的生長，延長產(chǎn)品貨架期[5]。肉制品發(fā)酵劑的研究始于20世紀初，最早發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和過氧化氫酶陽性球菌混合發(fā)酵香腸的效果較好[6]。乳酸菌可以產(chǎn)生特殊酶系，有助于香腸風味的產(chǎn)生和發(fā)酵肉制品的成熟[7]，降低香腸pH值，抑制腐敗微生物的生長[8]；而葡萄球菌屬具有分解脂肪、蛋白質以及產(chǎn)生過氧化氫酶的活性[9]，能夠豐富發(fā)酵香腸的風味。因此，乳酸菌和非致病性葡萄球菌混合菌種發(fā)酵劑的研究和應用獲得了快速發(fā)展。

近年來，肉制品發(fā)酵劑研究熱點主要集中在兩方面。一是對發(fā)酵肉制品成熟過程中風味物質形成有利的呈香菌的研究，如篩選肉制品中的優(yōu)良產(chǎn)香葡萄球菌、戊糖片球菌等[10]。Yan Cheng等[11]研究自然風干過程中腐生葡萄球菌S25發(fā)酵的香腸與天然發(fā)酵（對照）四川香腸的脂肪和蛋白質含量變化，發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌S25可以加速四川香腸中的蛋白質水解和脂肪分解；張曉瓊等[12]從國內(nèi)外發(fā)酵肉樣品中分離篩選得到10 株性能優(yōu)良的葡萄球菌菌株，并對其蛋白酶、脂肪酶、硝酸還原酶和過氧化氫酶活性以及其在高鹽和亞硝酸鹽環(huán)境中的生長情況進行測定。而另一個研究熱點是能夠提高發(fā)酵香腸衛(wèi)生安全性的菌株，如產(chǎn)細菌素能力強、可抑制病原菌生長、提高發(fā)酵肉制品安全性的乳酸菌[13]。Kantachote等[14]以戊糖片球菌HN8和Lactobacillus namurensis NH2混合發(fā)酵劑制作泰國發(fā)酵豬肉香腸，結果表明，混合發(fā)酵劑可降低香腸中生物胺和膽固醇的含量；Ba等[15]利用從天然發(fā)酵肉中篩選出的植物乳桿菌制作發(fā)酵香腸，結果表明，接種植物乳桿菌的香腸腐敗細菌數(shù)量和脂肪氧化水平顯著降低。

食鹽（NaCl）在傳統(tǒng)西式香腸制品的加工中發(fā)揮著重要作用，決定著發(fā)酵香腸制品的感官質量和生物安全性[16]。食鹽不但能夠促進肌原纖維蛋白的溶解，增加蛋白質的結合特性，改善香腸質地，而且還能提高發(fā)酵香腸的微生物安全性[17]。但是傳統(tǒng)西式香腸制品的鹽分含量很高，約為8%[18]，高于大部分肉制品，長期食用可能會對人體健康造成不利影響。近年來，隨著消費者保健意識的增強，開發(fā)低鹽西式發(fā)酵香腸將更為符合消費者的需求。但鹽量的降低可能會對發(fā)酵香腸的質量安全和感官品質產(chǎn)生不利影響，因此需要定向篩選適用于低鹽發(fā)酵香腸的優(yōu)良菌種。

本研究旨在從我國傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品中分離出適用于低鹽發(fā)酵香腸的優(yōu)良葡萄球菌與乳酸菌菌株，并通過測定葡萄球菌菌株的溶血、耐硝耐酸、硝酸鹽還原性和48 h產(chǎn)酸等發(fā)酵特性指標，以及產(chǎn)氨、蛋白酶、脂肪酶、產(chǎn)乙偶姻等風味指標，篩選出具有產(chǎn)香功能、可改善低鹽對風味產(chǎn)生的不良影響的優(yōu)良葡萄球菌菌株；通過測定對乳酸菌菌株的產(chǎn)接觸酶、耐硝、48 h產(chǎn)酸等發(fā)酵特性指標，以及抑菌指標和產(chǎn)氨、產(chǎn)蛋白酶等風味指標，篩選出產(chǎn)酸快、抑菌能力強、可以在低鹽的基礎上保障香腸安全性的優(yōu)良乳酸菌菌株。對篩選得到的優(yōu)良葡萄球菌和乳酸菌菌株進行拮抗性實驗，得到無拮抗作用的菌株組合，作為潛在開發(fā)肉制品發(fā)酵劑的出發(fā)菌株。最終篩選出的混合發(fā)酵劑可在保障安全性的同時改善低鹽發(fā)酵香腸的風味，不但有利于低鹽發(fā)酵香腸產(chǎn)品的開發(fā)，而且能夠為我國自主產(chǎn)權發(fā)酵劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)家煙熏老臘肉、川味土豬臘腸 四川省閬中市蜀香坊特產(chǎn)臘味店；郭三酸菜 沈陽市成懿醬腌菜廠；歐力波蘭薩拉米 北京利康德利肉食品有限公司；川味臘肉衡東縣鄉(xiāng)間農(nóng)家腌臘制品食品有限公司；廣味掛腸 北京家樂福中關村店；紫光園自制酸乳 北京紫光園飯店（西直門店）；秦烹小院自制酸乳 北京秦烹小院；漁芙南湘菜館自制酸乳 北京漁芙南湘菜館；自制乳酸菌飲料 一口酸牛奶（北京鼓樓東大街店）。

MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏 北京奧博星生物技術有限責任公司；MSA培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；氯化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鉀、檸檬酸二銨、乙酸鈉、碳酸鈣（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SE602F電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-SⅡ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MQD-S3R恒溫振蕩箱上海旻泉儀器有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；SCL-1300垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；MINIB-100恒溫金屬浴杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與純化

無菌操作下稱取10 g絞碎的樣品，轉移至100 mL無菌生理鹽水中，振蕩（200 r/m，30 min）混勻；靜置數(shù)分鐘，再取1 mL加入到9 mL無菌生理鹽水中，即成10-2稀釋度，根據(jù)需要再依次稀釋；選取合適稀釋度的樣品溶液，倒入相應的固體培養(yǎng)基中，混勻后37 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h；挑取單菌落反復劃線，直至獲得純的菌株。其中，乳酸菌的分離采用含有3% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，挑取具有溶鈣圈[19]的菌株；葡萄球菌的分離采用MSA固體培養(yǎng)基。

1.3.2 菌株的初步篩選

對純化后的菌株進行革蘭氏染色、菌體形態(tài)觀察，選擇革蘭氏陽性菌種保存。對所分離的革蘭氏陽性菌分別進行如下篩選：

接觸酶實驗[20]：將37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌液用接種環(huán)涂抹于已滴有5% H2O2的玻片上，立即觀察結果，3 min內(nèi)出現(xiàn)氣泡者為陽性反應，反之為陰性。

耐硝性實驗[21]：以1%的接種量將菌種分別接種于不同亞硝酸鈉添加量（0、50、100、150 mg/kg）的液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，于600 nm波長處測定吸光度。

產(chǎn)酸能力測定[21]：以1%接種量將菌株接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 、48 h后測定發(fā)酵液的pH值。

對于所分離的陽性球菌菌株，分別進行如下額外指標的篩選：

耐酸性實驗[21]：以1%的接種量將菌種分別接種于NB液體培養(yǎng)基（pH值調至5.0）中，37 ℃培養(yǎng)48 h，于600 nm波長處測定吸光度。

溶血實驗[22]：用接種針取37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌液，在血平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24、48、72 h后觀察結果，有溶血圈出現(xiàn)的菌株為陽性，以金黃色葡萄球菌作為陽性對照。

硝酸鹽還原酶活力測定[23]：檢查37 ℃培養(yǎng)過夜后菌液的硝酸鹽還原情況，在白色搪瓷比色盤中加入1 滴菌液，然后加入硝酸還原試劑A、B液各1 滴，觀察菌落周圍出現(xiàn)的紅圈大小和清晰度，顯色反應后，挑出紅圈直徑＞1.2 cm的菌株。

1.3.3 菌株的復篩

對初步篩選所得到的葡萄球菌及乳酸菌菌株進行進一步的篩選：

蛋白酶活性檢測[21]：將37 ℃培養(yǎng)過夜后的新鮮菌液分別點接種在脫脂牛乳平板培養(yǎng)基（SM）上，培養(yǎng)5 d。觀察菌落周圍透明圈的大小。

氨基酸脫羧酶實驗[24]：將37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌液傾注到氨基酸脫羧酶檢測培養(yǎng)基（分別含有0.5%酪氨酸、0.25%組氨酸、賴氨酸及精氨酸，以不添加氨基酸作為空白對照）中，37 ℃培養(yǎng)，變色則為陽性。

精氨酸雙水解酶實驗[25]：將37 ℃培養(yǎng)過夜后的菌液傾注到精氨酸雙水解酶檢測培養(yǎng)基（含有1% L-精氨酸鹽）中，37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基轉化為紅色者為陽性。

對于初步篩選得到的葡萄球菌菌株，分別進行如下額外指標的篩選：

脂肪酶活性檢測[21]：將37 ℃培養(yǎng)過夜后的新鮮菌液分別點接種在三丁酸甘油酯培養(yǎng)基（TB）上，培養(yǎng)5 d，觀察菌落周圍透明圈。

乙偶姻產(chǎn)生實驗[25]：接種葡萄球菌菌株于乙偶姻檢測培養(yǎng)基，取培養(yǎng)液和40% NaOH等量混合。加少許肌酸，如果培養(yǎng)液10 min出現(xiàn)紅色即為陽性反應。

對于所分離的乳酸菌菌株，進行抑菌實驗[26]作為額外的篩選指標：將乳酸菌菌株培養(yǎng)至約為108CFU/mL，點接種于已含有106CFU/mL的敏感指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以及蠟樣芽孢桿菌）的固體平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落周圍是否存在抑菌圈。

1.3.4 菌株的分類學鑒定

形態(tài)學觀察：將菌株平板劃線于固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，挑取對數(shù)生長期的菌體進行革蘭氏染色后顯微鏡下觀察菌體細胞形態(tài)。

生理生化實驗：參照《乳酸細菌現(xiàn)代研究實驗技術》[20]及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]對篩選菌株的生理生化特性進行檢測，包括精氨酸雙水解酶實驗、糖醇發(fā)酵實驗等。

16S rDNA分子生物學鑒定：細菌基因組DNA按照試劑盒說明書步驟進行提取。以提取基因組作為PCR擴增的模板，利用通用引物Lpw57（5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’）及Lpw205（5’-CTT GTT ACG ACT TCA CCC-3’）進行PCR擴增[27]。PCR反應體系（25 μL）為：10×Buffer 2.5 μL、模板DNA 1 μL、引物各2.5 μL、dNTP 2 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL、dd H2O 14.25 μL，混勻5 min。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 1 min、43 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，進行30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[28]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分析后由北京諾賽基因組研究中心測序。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構建：所得菌株序列根據(jù)NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對鑒定，根據(jù)鑒定結果及相似性較高的幾株菌的16S rRNA，利用MEGA軟件進行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.3.5 菌株的生長特性及產(chǎn)酸能力測定

將菌株接種于相應的液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)（葡萄球菌接種在NB液體培養(yǎng)基中200 r/min振蕩培養(yǎng)，乳酸菌接種在MRS液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)），以液體培養(yǎng)基為空白對照，每2 h用紫外分光光度計于600 nm波長處測定吸光度，用酸度計測定菌液的pH值。

1.3.6 菌株間拮抗性測試

用含乳酸菌的接種環(huán)，在低鹽模擬肉湯固體培養(yǎng)基[29]（NaCl質量分數(shù)2%）上劃一直線接菌。37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，待形成菌落后，沿菌落邊緣（不接觸）用接種環(huán)從垂直方向接種葡萄球菌；37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察乳酸菌對于葡萄球菌的抑制效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復進行3 次，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析，使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)良葡萄球菌菌株初篩結果

從5 種自然發(fā)酵食品中分離出平板培養(yǎng)形態(tài)不同的疑似菌株共56 株，其中6 株來自川味臘肉，4 株來自歐力波蘭薩拉米，1 株來自廣味掛腸，15 株來自農(nóng)家煙熏老臘肉，30 株來自川味土豬臘腸。從疑似菌株中篩選出革蘭氏陽性球菌、接觸酶陽性菌39 株，初步判定為葡萄球菌。

對所得的39 株菌株的安全性進行溶血實驗，結果表明，39 株菌均為溶血實驗陰性，說明分離的球菌均具有安全性。39 株菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，僅2 株球菌對150 mg/kg NaNO2不耐受；其中34 株菌具有硝酸鹽還原酶，且其中的23 株可耐受pH 5.0的酸度，經(jīng)過初篩，得到發(fā)酵特性良好的優(yōu)良葡萄球菌23 株，作為下一步復篩的出發(fā)菌株。其中菌株L1、L2、L3來自川味臘肉，R1、R2、R3來自歐力波蘭薩拉米，Z7、Z9、Z10、Z12來自農(nóng)家煙熏老臘肉，C6、C7、C8、C10、C11、C16、C17、C23、C24、C25、C26、C29、C30來自川味土豬臘腸。

2.2 優(yōu)良葡萄球菌菌株復篩結果

表1 葡萄球菌菌株復篩結果Table 1 Secondary screening of Staphylocooccccuuss s t raaiinnss

對初篩所得的23 株葡萄球菌進行復篩，由表1可知，其中有17 株菌既不產(chǎn)氨基酸脫羧酶，也不產(chǎn)精氨酸雙水解酶，這17 株菌中有15 株菌具有脂肪酶活性，14 株菌具有蛋白酶活性，而既產(chǎn)蛋白酶又產(chǎn)脂肪酶的菌株有12 株，其中有3 株產(chǎn)乙偶姻。因此，最終篩選出3 株具有優(yōu)良風味特性的葡萄球菌，它們分別為篩選自川味臘肉的L2、篩選自歐力波蘭薩拉米的R2以及篩選自農(nóng)家煙熏老臘肉的Z9。

2.3 優(yōu)良乳酸菌菌株初篩結果

從6 種自然發(fā)酵食品中分離出的平板培養(yǎng)形態(tài)不同的疑似菌共52 株，其中25 株來自郭三酸菜，7 株來自歐力波蘭薩拉米，5 株來自北京紫光園自制酸乳，4 株來自秦烹小院自制酸乳，7 株來自漁夫南湘菜館自制酸乳，3 株來自一口酸牛奶（鼓樓東大街店）的自制乳酸菌飲料。從疑似菌株中篩選出具溶鈣圈的革蘭氏陽性、接觸酶陰性乳酸菌30 株。

所得30 株乳酸菌菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，其中有28 株菌可耐受150 mg/kg亞硝酸鹽。不同菌株的產(chǎn)酸情況差異較大，部分產(chǎn)酸較快菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，pH值可達3.67，其中21 株菌的pH值可在24 h內(nèi)降至3.70～3.90，產(chǎn)酸效果較好。經(jīng)過初篩，得到發(fā)酵特性良好的優(yōu)良乳酸菌21 株，作為下一步復篩的出發(fā)菌株。其中菌株P1、P2、P4、P5、P6、P8、P9、P12、P15、P19、P20、P21來自于郭三酸菜，S1來自于歐力波蘭薩拉米，SN1-1、SN1-2、SN1-3、SN1-5來自于北京紫光園自制酸乳，SN2-6、SN2-7、SN2-8來自于秦烹小院自制酸乳，X來自于一口酸牛奶自制乳酸菌飲料。

2.4 優(yōu)良乳酸菌菌株復篩結果

表2 乳酸菌菌株復篩結果Table 2 Secondary screening of lactic acid bacteria

對初篩所得的21 株乳酸菌進行復篩，經(jīng)過抑菌實驗，所有菌株均對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌有抑制作用。由表2可知，根據(jù)抑菌圈的大小，其中10 株乳酸菌的抑菌作用最強（抑菌圈平均寬度大于3 mm）。在進行復篩的21 株菌中，氨基酸脫羧酶陰性的菌株有12 株，精氨酸雙水解酶陰性的菌株有18 株，具有蛋白酶活性有7 株。因此，最終篩選出4 株兼具多種優(yōu)良特性的乳酸菌菌株，分別為篩選自郭三酸菜的P6與P12、篩選自北京紫光園自制酸乳的SN1-3以及篩選自一口酸牛奶自制乳酸菌飲料的X。

2.5 菌株的分類學鑒定結果

2.5.1 菌株形態(tài)學鑒定結果

圖1 葡萄球菌菌落形態(tài)特征Fig. 1 Colony characteristics of Staphylococcus

由圖1可知，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9在NB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約1～2 mm，菌落形態(tài)均呈白色圓形，不透明，形狀規(guī)則，其中L2、R2菌落光滑、濕潤、呈凸起狀，Z9菌落邊緣粗糙，質地干燥且菌落比較扁平。

圖2 葡萄球菌菌體形態(tài)學特征（×1 000）Fig. 2 Morphological characteristics of Staphylococcus (×1 000)

由圖2可知，經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9的菌體細胞均為圓球形，革蘭氏陽性，其中菌株L2部分成對生長，菌株R2單個生長，菌株Z9呈不規(guī)則堆狀排列。

圖3 乳酸菌菌落形態(tài)特征Fig. 3 Colony characteristics of lactic acid bacteria

由圖3可知，乳酸菌菌株P6、P12、SN1-3及X在MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落直徑約1～2 mm，菌落形態(tài)均為白色圓形，菌落表面光滑，濕潤凸起，邊緣規(guī)則，其中X菌落呈半透明狀，P6、P12、SN1-3菌落均不透明。

圖4 乳酸菌菌體形態(tài)學特征（×1 000）Fig. 4 Morphological characteristics of lactic acid bacteria (×1 000)

由圖4可知，經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，乳酸菌菌株P6細胞成對或成短鏈，革蘭氏陽性，粗短桿狀；菌株P12成對或成短鏈，為革蘭氏陽性短桿菌；菌株SN1-3細胞部分以直二個方向形成四聯(lián)排列，為革蘭氏陽性球菌；菌株X成對或成短鏈，為革蘭氏陽性桿菌。

2.5.2 菌株生理生化實驗鑒定結果

表3 葡萄球?菌菌株生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of Staphylocooccccuuss

由表3可知，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]，根據(jù)葡萄球菌生理生化鑒定結果，初步推斷葡萄球菌菌株L2、Z9為腐生葡萄球菌，R2為肉葡萄球菌。

表4 乳酸菌菌株生理生化實驗結果Table 4 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

由表4可知，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]和《乳酸細菌現(xiàn)代研究實驗技術》[20]，根據(jù)乳酸菌菌株的生理生化鑒定結果，初步推斷乳酸菌菌株P6、P12為植物乳桿菌或鼠李糖乳桿菌、X為干酪乳桿菌、SN1-3為戊糖片球菌。

2.5.3 菌株的16S rDNA分子生物學鑒定結果

圖5 菌株16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig. 5 Electrophoresis of PCR products 16S rDNA gene from strains

由圖5可知，對菌株的16S rDNA序列采用通用引物進行擴增后，在1 000～2 000 bp之間可見到清晰明亮的條帶，大小約為1 500 bp。

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序對菌株16S rDNA測序結果在GenBank已知序列數(shù)據(jù)庫中進行對比分析。結果表明：葡萄球菌菌株L2、Z9與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）具有最高同源性，葡萄球菌菌株R2與肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）具有最高同源性；乳酸菌菌株P6、P12與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）具有最高同源性，乳酸菌菌株X與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有最高同源性，乳酸菌菌株SN1-3與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）具有最高同源性。選取與GenBank中相似性較高菌株的序列，利用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結果如圖6～8所示。

圖6 葡萄球菌菌株L2、R2、Z9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Neighbour-joining tree of Staphylococcus L2, R2 and Z9

圖8 乳酸菌菌株SN1-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 8 Neighbour-joining tree of Lactobacillus SN1-3

綜合生理生化及分子生物學鑒定，結果表明，葡萄球菌菌株L2、Z9為腐生葡萄球菌，葡萄球菌菌株R2為肉葡萄球菌；乳酸菌菌株P6、P12為植物乳桿菌，菌株X為干酪乳桿菌，SN1-3為戊糖片球菌。

2.6 菌株的生長特性及產(chǎn)酸能力

本研究測定了篩選出的3 株葡萄球菌及4株乳酸菌的在培養(yǎng)過程中的生長情況及培養(yǎng)基的pH值變化，并繪制曲線。

圖9 不同葡萄球菌的生長曲線及產(chǎn)酸能力（ =3）Fig. 9 Growth curve and acid production of Staphylococcus (n = 3)

由圖9可知，葡萄球菌L2、Z9和R2均能在NB液體培養(yǎng)基中生長且長勢良好，這3 株菌的生長速率和生長曲線的趨勢非常相似，生長調整期均較短，12 h后進入生長穩(wěn)定期，菌數(shù)達到最大值。此外，這3 株菌的pH值變化也非常相似，均隨培養(yǎng)時間的增加呈上升趨勢，在24 h后趨勢均逐漸平緩，與生長曲線趨勢大體一致。

圖10 不同乳酸菌的生長曲線及產(chǎn)酸能力（n==44）Fig. 10 Growth curve and acid production of lactic acid bacteria (n = 4)

由圖10可知，乳酸菌P6、P12、X及SN1-3均能在MRS液體培養(yǎng)基中生長且長勢良好，但生長速率存在差異。乳酸菌P6、P12的生長速率較快，生長調整期較短，約為0～2 h，16 h后進入生長穩(wěn)定期，菌數(shù)達到最大值。而菌株X與SN1-3生長速率較慢，生長調整期略長，約為0～4 h，20 h后才達到生長穩(wěn)定期。此外，這4 株菌產(chǎn)酸較快，0～12 h內(nèi)pH值下降迅速，36 h后均達到3.5以下，產(chǎn)酸能力較強。但4 株菌的產(chǎn)酸速率存在差異，菌株P6、P12產(chǎn)酸最快，而菌株SN1-3相對較慢。

2.7 菌株間的拮抗作用

表5 菌株間拮抗性測試結果Table 5 Compatibility test among antagonistic strains

由表5可知，戊糖片球菌SN1-3對于3 種葡萄球菌的拮抗作用最微弱，對肉葡萄球菌R2無明顯拮抗作用；而植物乳桿菌P6、P12對于3 種葡萄球菌的拮抗作用最強，對腐生葡萄球菌Z9具有非常強的抑制作用，若復配使用非常不利于葡萄球菌的生長。因此，經(jīng)菌株間拮抗實驗的結果，選擇戊糖片球菌SN1-3與肉葡萄球菌R2作為最終制作低鹽發(fā)酵香腸的復配菌株。

3 結 論

國內(nèi)肉類科技界在產(chǎn)品加工過程中在質量與特性變化、加工用發(fā)酵劑菌種選育、配制等方面開展了大量工作，但是關于低鹽發(fā)酵香腸的工藝研究和菌株選育方面的研究較少。因此，定向從我國自然發(fā)酵制品中篩選利于低鹽西式發(fā)酵香腸制品生產(chǎn)與開發(fā)的適應性優(yōu)良菌種，不但可以利用我國豐富的菌種資源，還能夠為我國低鹽發(fā)酵香腸產(chǎn)品的研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

本研究從臘肉、四川香腸、薩拉米等5 種自然發(fā)酵制品中分離、純化得到56 株過氧化氫酶陽性球菌菌株。通過菌株耐受性、發(fā)酵特性、風味特性等指標對所分離的56 株過氧化氫酶陽性菌株進行篩選，最后篩選得到腐生葡萄球菌L2、肉葡萄球菌R2以及腐生葡萄球菌Z9為適用于低鹽發(fā)酵香腸、具有優(yōu)良產(chǎn)香特性的葡萄球菌菌株。其中L2來自川味臘肉，R2來自薩拉米，Z9來自農(nóng)家煙熏老臘肉，它們均可以耐受150 mg/kg的NaNO2和較低的酸度，并且具有硝酸鹽還原能力。菌株均不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶，具有一定的蛋白酶和脂肪酶活性，還可以產(chǎn)生風味物質乙偶姻，具有優(yōu)良的產(chǎn)香特性。

本研究還通過菌株耐受性、發(fā)酵特性、抑菌特性、風味特性等指標對分離自泡菜、自釀酸乳、乳酸菌飲料等6 種自然發(fā)酵制品中的52 株乳酸菌菌株進行篩選，最終篩選得到植物乳桿菌P6、植物乳桿菌P12、干酪乳桿菌X以及戊糖片球菌SN1-3 4 株適用于低鹽發(fā)酵香腸的優(yōu)良乳酸菌菌株。其中，菌株P6、P12來自酸菜，SN1-3來自酸乳，X來自乳酸菌飲料。4 株菌均可耐受150 mg/kg的NaNO2，具有很好的發(fā)酵特性，產(chǎn)酸速度快，產(chǎn)酸能力強，不含有氨基酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶，可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌等食源性致病菌，并且具有較好的蛋白酶活性，有利于保障低鹽發(fā)酵香腸的安全性及風味。

葡萄球菌與乳酸菌復配作為香腸發(fā)酵劑，可以在產(chǎn)香的同時保證低鹽發(fā)酵香腸的安全性，但是乳酸菌產(chǎn)生的細菌素以及乳酸會對葡萄球菌的生長造成不利影響，因此混合發(fā)酵劑的篩選必須考慮到菌株間的拮抗作用。本研究經(jīng)過葡萄球菌與乳酸菌的拮抗實驗，發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌SN1-3和肉葡萄球菌R2之間無明顯的拮抗作用，可以用于香腸混合發(fā)酵劑的開發(fā)。因此，后續(xù)實驗也將進一步利用SN1-3＋R2復配組合制作低鹽發(fā)酵香腸，考察其混合發(fā)酵的效果，為我國自主產(chǎn)權低鹽發(fā)酵香腸混合發(fā)酵劑的研究和開發(fā)提供參考。